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¿Se revierten las construcciones de inserción de levadura?


Si inserto un nuevo gen con un plásmido de integración de levadura y lo selecciono con un cultivo de abandono una vez, ¿puedo asumir que el gen recién integrado permanecerá en la cepa sin ejercer presión selectiva sobre él? (es decir, ¿puedo usar placas y cultivos líquidos normales después de obtener la levadura con la cepa recién integrada?


Depende exactamente de lo que hayas hecho.

La forma estándar de usar un plásmido de integración de levadura (YIp) es que se integre en el genoma mediante la recombinación entre un fragmento de ADN de levadura que lleva YIp y el mismo ADN en el genoma. Este es a menudo, pero no necesariamente, el marcador seleccionable. Entonces, por ejemplo, un YIp que lleva el URA3 gen, ya que su único ADN de levadura se integrará en el URA3 locus (probablemente mutante para permitir la selección de Ura+, así que más correctamente ura3).

Si el YIp se linealiza cortando en un sitio dentro del URA3 marcador esto dirigirá la inserción y aumentará la eficiencia de transformación.

Una vez realizada la inserción, la configuración en el sitio de integración es:

cromosoma ... URA3 ... otras secuencias YIp ... ura3 ... cromosoma

Esto es inherentemente inestable porque puede tener lugar un evento de bucle de salida vía recombinación entre el URA3 / ura3 regiones. Por lo tanto, eliminar la selección significa que corre el riesgo de perder el inserto. Además, es posible que se produzca un bucle dejando el URA3 alelo detrás en lugar del ura3 alelo. Por lo tanto, puede perder el vector incluso cuando se mantiene la selección (pero esto dependerá de la naturaleza exacta de la mutación).

Son posibles configuraciones más complejas donde la secuencia objetivo está separada del marcador seleccionable, y donde la digestión elimina una parte completa de la secuencia objetivo antes de la transformación. Entonces, por ejemplo, si el TRP1 gen se utilizó para apuntar a un plásmido con el URA3 marcador en un TRP1 ura3 cepa que obtendría:

cromosoma ... TRP1 fragmento A ... URA3 + otras secuencias YIp ... TRP1 fragmento B ... cromosoma

el transformante resultante es ahora Ura+ por el integrado URA3 plásmido, pero algunos TRP1 Ahora falta el ADN (el ADN que se extrajo cuando se digirió el plásmido), por lo que la cepa es trp1. La aparición de este Trp- El fenotipo indica que la transformación probablemente se ha producido por la vía descrita.

En este caso, el plásmido insertado es mucho más estable porque esos dos fragmentos restantes de TRP1 El ADN no es idéntico, por lo que no hay posibilidad de que se salga.

En resumen, si su transformante tiene el inserto que lleva el "nuevo gen" flanqueado por una secuencia repetida, entonces es inestable; de ​​lo contrario, está bien eliminar la selección. En el primer caso, si el nuevo gen es deletéreo, habrá una fuerte presión selectiva a favor de las células que han perdido el inserto.

Apéndice

Puede evitar el uso de plásmidos YIp integrando su nuevo gen en cualquier locus utilizando cebadores de destino largos, como se muestra en la Figura siguiente.

Diseñe cebadores para amplificar su gen como de costumbre, pero sintetícelos con extensiones 5 'de 40 pb correspondientes a dos secuencias en los extremos del sitio de integración (URA3 utilizado aquí con fines ilustrativos). El fragmento resultante se puede utilizar en una transformación y se integrará en el URA3 sitio por recombinación homóloga, reemplazando el ADN residente. La ventaja de usar URA3 para esto es que puedes seleccionar para integrantes como Ura- células por resistencia al ácido fluoorótico (FOA). Aunque probablemente pueda seleccionar directamente para esto, siempre he cotransformado el fragmento junto con otro plásmido seleccionable (LEU2, TRP1 etc., pero no un plásmido CEN) Entonces su p. ej. Leu+ Los transformantes pueden seleccionarse para detectar aquellos que también se han convertido en FOA.R. Esta cotransformación ocurre con una frecuencia bastante alta porque las células que absorben el ADN absorben mucho de él. Una vez que elimine la selección para el plásmido cotransformante, pronto se perderá, dejándolo con un integrante limpio no reversible.

Ha pasado un tiempo desde que hice este tipo de cosas, probablemente ahora hay métodos aún más inteligentes.


Se sabe que los plásmidos integradores de levadura son estables, incluso en ausencia de un medio selectivo, pero pueden revertirse como la mayoría de los plásmidos de recombinación homólogos.

Citando del libro Análisis de genes de levadura (pg476):

Los YIps son generalmente más estables que los plásmidos YRp o YEp. Como resultado, es seguro cultivar la mayoría de las cepas portadoras de YIp en medios enriquecidos, aunque es una buena práctica almacenarlas en condiciones selectivas. La estabilidad de las cepas portadoras de YIp depende de la naturaleza del evento de integración. Por ejemplo, si el YIp genera una repetición en tándem tras la integración en el genoma, esto puede revertir al tipo salvaje mediante un evento de recombinación homóloga intramolecular.

-> por lo tanto, utilice marcadores con regularidad y frecuencia.

Fuentes:

Mick F. Tuite, Yeast Gene Analysis Vol 26 (Academic Press, 1998) p.476


Una imprimación interactoma ABC de levadura

El análisis del interactoma del transportador del casete de unión a ATP de levadura proporciona información relevante para la salud humana sobre la regulación y función de una familia de proteínas que determina la tolerancia a las condiciones fisiológicas y el estrés impuesto externamente.

La mayoría de los estudios del interactoma de proteína de levadura han utilizado el sistema de dos híbridos de levadura (YTH) para identificar acoplamientos de cebo-presa intranucleares solubles o MS para identificar componentes de co-complejos solubles marcados por afinidad (AP-MS) 3. Para las proteínas de membrana, se ha utilizado MS de co-complejos solubles en detergente, purificados por afinidad y estables 8. Los tres enfoques detectan interacciones funcionales y reguladoras que pueden anotarse mediante "culpa por asociación". Sin embargo, existen importantes limitaciones en la obtención de resultados a nivel de sistema de calidad y la identificación de redes con diferentes propiedades topológicas y biológicas depende del método 9. El sistema de dos híbridos de levadura de membrana (MYTH) utiliza la reconstitución de una ubiquitina dividida para informar sobre las interacciones entre las proteínas de membrana presentadas como cebos y sus presas. en el lugar 10. La reconstitución de una ubiquitina cuasi nativa activa genes que permiten el crecimiento en medio selectivo se verifica usando un indicador lacZ, mientras que la localización del cebo esperada se confirma usando un YFP unido al cebo (iMYTH) 3,10. Snider et al. 7 utilizan análisis fenotípicos para evaluar el impacto de construcciones de cebo transportador ABC de levadura seleccionadas sobre la función celular y un dominio C-terminal de ubiquitina mutado que requiere un complejo cebo-presa para la reconstitución de ubiquitina. La complementación fluorescente bimolecular usando un YFP dividido confirma las interacciones cebo-presa e identifica la localización subcelular del co-complejo cebo-presa.


INTRODUCCIÓN

La translocación de proteínas a través y la integración en la membrana del retículo endoplásmico (RE) están mediadas por el complejo translocón Sec61 (Johnson y van Waes, 1999). Las proteínas se dirigen a este complejo mediante secuencias señal hidrófobas (von Heijne, 1990). Las señales no escindidas y los subsecuentes segmentos hidrófobos del polipéptido se integran en la bicapa como hélices transmembrana. No se comprenden completamente ni los determinantes de la topología de las proteínas en la membrana ni el mecanismo de integración. El caso más simple de topogénesis de proteínas en la membrana es la orientación de la secuencia señal al entrar en el translocón. Las secuencias de señales pueden translocar el extremo C-terminal (señales escindibles y anclas de señal) o el extremo N-terminal (anclas de señal inversa). El determinante mejor establecido de la orientación de la señal es la distribución de residuos cargados a ambos lados del núcleo hidrofóbico de la señal. Según la "regla del interior positivo" (von Heijne, 1986 Hartmann et al., 1989), el extremo más positivo es generalmente citosólico. Los determinantes adicionales son el plegamiento de secuencias N-terminal a una señal interna que puede obstaculizar estéricamente la N-translocación (Denzer et al., 1995), y la hidrofobicidad del núcleo de la señal apolar (Sakaguchi et al., 1992 Wahlberg y Spiess, 1997 Eusebio et al., 1998 Harley et al., 1998 Rösch et al., 2000 Goder y Spiess, 2003).

El translocón Sec61 consta de Sec61α (Sec61p en levadura) con 10 dominios transmembrana, y las proteínas de extensión única Sec61β (Sbh1p) y Sec61γ (Sss1p), correspondientes en bacterias al complejo SecY (SecY / SecG / SecE). La estructura cristalina reciente del complejo arquebacteriano SecY de Methanococcus jannaschii (van den Berg et al., 2004) reveló un haz de hélice sorprendentemente compacto con un poro de canal hidrófilo potencial y un sitio de salida lateral hecho de segmentos transmembrana TM2 y TM7, consistente con datos de reticulación previos (Plath et al., 1998). Sugiere que el canal de translocación está formado por un solo heterotrímero. La estructura representa claramente el estado cerrado, porque el pasaje central está bloqueado por un dominio de tapón lumenal y un anillo de constricción central. Para abrir, el tapón debe moverse hacia afuera y el anillo debe expandirse para ensanchar el pasaje central. Mediante mutagénesis de cisteína y entrecruzamiento de disulfuro, se demostró que los polipéptidos translocantes se localizan de hecho en el centro de SecY en Escherichia coli (Cañón et al., 2005). Es probable que el dominio de enchufe esté involucrado en la activación del translocón desencadenado por la secuencia de señal para permitir la entrada y transferencia del polipéptido que se translocará y sellar el canal cuando está inactivo (Tam et al., 2005).

En un análisis sistemático de residuos cargados conservados en Sec61p que eran candidatos a ser responsables de la regla del interior positivo, se identificaron tres residuos, R67, R74 y E382, para cumplir con los criterios de aumento de N-translocación de un modelo de anclaje de señal. proteína con cargas flanqueantes N-terminales más positivas cuando se muta y para disminuir la translocación N de una proteína modelo con una diferencia de carga opuesta (Goder et al., 2004). Según la estructura del complejo de arquebacterias SecY, E382 se encuentra en el extremo citoplásmico del segmento transmembrana TM8, y tanto R67 como R74 están en el dominio de enchufe, posiciones aparentemente apropiadas para influir en la orientación de una señal que ingresa al canal cerrado. Para probar el papel del dominio plug en la orientación de la señal y su importancia para la funcionalidad translocon y la viabilidad celular, se introdujeron mutaciones específicas para alterar su estructura, incluida una deleción completa. Sorprendentemente, la mutación o deleción del dominio del tapón no afectó a la viabilidad ni al crecimiento, a pesar de la reducción de la eficiencia de translocación y la formación de translocon.


MATERIALES Y MÉTODOS

Construcción de plásmido

El plásmido pUC21ΔBB se construyó escindiendo pUC21 (11) con BamHola y BglII seguido de ligación para eliminar el fragmento entre los dos sitios, el plásmido resultante no tiene un BamHola ni un BglII sitio de restricción. El plásmido pUC21-NotI se construyó insertando el 123 bp NoI fragmento de polienlazador del plásmido pFA6b (12) en pUC21ΔBB que se había escindido con NoI. Se utilizó una estrategia similar para construir vectores equivalentes con un marcador de resistencia a la kanamicina, pUK21ΔBB y pUK21-NotI, comenzando con el plásmido pUK21 (11).

Plásmido HO-escuela politécnica-HO fue construido en varios pasos. Un fragmento de 912 pb (HO-L) con secuencias del HO El promotor (–2720 a –1814 corriente arriba del ATG) se hizo mediante PCR con cebadores diseñados para generar un fragmento con HinDIII y BsiSecuencias de voladizo WI (ver más abajo). Este fragmento se insertó en HinDIII–BsiPUC21-NotI digerido con WI. Un fragmento de 507 pb (HO-R) con secuencias desde el extremo 3 ′ del HO gen (+1199 a +1699 aguas abajo del ATG) se hizo mediante PCR con cebadores diseñados para generar un fragmento con EcoRI y SfiYo sobresalgo de las secuencias (ver más abajo). Este fragmento se insertó en EcoRHODE ISLAND-SfiDigerí pUC21-NotI. Plásmido HO-poly-KanMX4-HO fue construido insertando el 1494 bp BsiWISCONSIN-EcoFragmento RI con KanMX4 del plásmido pFA6-KanMX4 (12) en BsiWISCONSIN-EcoRI digerido HO-escuela politécnica-HO. Plásmido HO-hisG-URA3-hisG-escuela politécnica-HO fue construido insertando el 3853 bp BamHOLA-BglII fragmento con el hisG-URA3-hisG casete (8) en BamHI digerido HO-escuela politécnica-HO.

La amplificación por PCR del HO-L se realizó utilizando el método de "clonación por PCR de extremo pegajoso" (13) utilizando cuatro cebadores, F852-F855 (Tabla 1). Brevemente, este método implica realizar dos reacciones de PCR seguidas de fusión y hibridación del ADN. La PCR con los cebadores F852 y F854 da como resultado un fragmento de extremos romos donde cada extremo contiene 5 pb de los HinDIII o BsiSitios de reconocimiento de WI. En una reacción separada, la PCR con los cebadores F853 y F855 da como resultado un fragmento de extremos romos donde cada extremo contiene 1 pb necesario para el HinDIII o BsiSitios de reconocimiento de WI. Las dos reacciones de PCR se mezclan, se funden a 100 ° C y luego se enfrían lentamente para permitir la hibridación del ADN. Este recocido de ADN da como resultado cuatro tipos de productos de ADN, con diferentes extremos. Una cuarta parte de los productos de ADN tienen proyecciones para la clonación en el vector digerido con HinDIII y BsiWISCONSIN. Este método elimina el paso a veces problemático de la digestión por restricción de productos de ADN después de la amplificación por PCR. Se utilizó el mismo método para preparar el HO-R fragmento utilizando los cebadores F856 – F859.


RESULTADOS

Sla1p se localiza en los parches de actina cortical

La supresión de SLA1 hace que las células sean sensibles a la temperatura para el crecimiento y tengan defectos asociados de actina caracterizados por parches corticales más pequeños y más grandes (Holtzman et al., 1993). Para determinar si los efectos de las mutaciones en SLA1sobre la organización de la actina podría ser directa, se determinó la localización subcelular de Sla1p. Otros genes, como ANC1, que codifica una proteína nuclear, causa defectos de actina cuando se elimina, aunque sus productos génicos no se localizan en el citoesqueleto de actina (Welch y Drubin, 1994). Se elevó un antisuero a los aminoácidos 854–920 de Sla1p. Después de la purificación por afinidad, este antisuero reconoció una única proteína de 148 kDa (frente a un peso molecular predicho de 136 kDa) en transferencias Western (Figura 1A). La Figura 1, B y C, muestra la colocalización de Sla1p con un subconjunto de los parches corticales de actina. No se observó colocalización de Sla1 en los cables de actina. Además, no hubo tinción detectable ensla1 celdas nulas (nuestros resultados no publicados). También generamos una versión etiquetada con myc de Sla1p, que reveló un patrón de tinción como el obtenido con los anticuerpos anti-Sla1p (nuestros resultados no publicados). Los datos de fluorescencia demuestran que Sla1p está bien posicionado para desempeñar un papel directo en la organización del ensamblaje de actina en la corteza de las células de levadura.

Fig. 1. Localización de Sla1p y actina mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta de doble marca. (A) Los anticuerpos producidos para Sla1p se utilizaron para detectar Sla1p en transferencias Western de células de tipo salvaje y para demostrar la falta de proteínas reactivas en sla1 celdas nulas. (B y C) A continuación, se realizó microscopía de inmunofluorescencia para localizar Sla1p (C) y actina (B) en células diploides de tipo salvaje. Barra, 5 μm.

Localización de proteínas asociadas a actina en ausencia de Sla1p

Muchas proteínas muestran una colocalización completa o parcial con parches corticales de actina. Otras proteínas, como la Rab-GTPasa Sec4p, no se colocalizan con la actina pero, sin embargo, dependen de un citoesqueleto de actina intacto para lograr una localización polarizada en el presunto sitio de la yema y en la yema de las células en crecimiento. Para explorar el posible papel de Sla1p en la localización de tales proteínas, se localizaron 11 proteínas asociadas a la corteza junto con actina en tipo salvaje ysla1 celdas nulas. De las proteínas probadas que se sabe que se unen a la actina o que muestran una colocalización significativa con la actina, la mayoría continuó haciéndolo incluso cuando la actina perdió su estructura de "parche" de tipo salvaje en sla1 celdas nulas. Esta categoría incluía Abp1p, Sac6p, cofilin, Srv2p, Arp2p y Las17p / Bee1p (Drubin et al., Luna de 1988 et al., 1993 Freeman et al., 1996 Moreau et al., 1996 Li, 1997), como se ilustra en la Figura 2, A y B, para Abp1p. Además, tres proteínas (Cdc42p, calmodulina y Spa2p) que están muy polarizadas en las células pero no se colocalizan con la actina (Snyder, 1989 Brockerhoff y Davis, 1992 Ziman et al., 1993) se localizó normalmente en ausencia de Sla1p (nuestros resultados no publicados). Por el contrario, otras dos proteínas mostraron alteraciones significativas en su localización en sla1 celdas nulas. Sla2p, que tiene una región C-terminal con homología con talin (Holtzman et al., 1993 Raths et al., 1993) y se une a la actina in vitro (McCann y Craig, 1997), y que muestra una colocalización sustancial con parches de actina cortical in vivo (Yang, Cope y Drubin, observaciones no publicadas), no se colocaliza con la actina en ausencia de Sla1p. En lugar de asociarse con los trozos de actina en sla1 células nulas, Sla2p se encuentra en pequeños parches en la periferia de la célula (Figura 2, C y D). Además, Sla2p no está tan bien polarizado en ausencia de Sla1p como en las células de tipo salvaje. La penetrancia del fenotipo de no localización del parche Sla2p / actina cortical se evaluó contando 100 células en cada uno de los tres experimentos de recuento. En las células de tipo salvaje, los parches Sla2p mostraron colocalización con un subconjunto de parches de actina en el 88% de las células contadas. En las células en las que no se expresó Sla1p, sin embargo, solo el 24% de las células mostraron colocalización de parches de Sla2p con estructuras de actina cortical. Sin embargo, cabe señalar que la endocitosis, que requiere Sla2p (Raths et al., 1993) no se ve gravemente afectado en Δsla1 células (Ayscough, observación no publicada).

Fig. 2. Localización de proteínas en ausencia de Sla1p.sla1 las células nulas se cultivaron hasta la fase logarítmica y se examinaron mediante microscopía de inmunofluorescencia de doble marcaje. (A y B) Células etiquetadas para Abp1p (A) y actina (B). (C y D) Células teñidas para Sla2p (C) y actina (D). Barra, 5 μm.

La segunda proteína que se localiza de forma aberrante en ausencia de Sla1p es Rho1p. Los anticuerpos generados y purificados por afinidad contra un péptido Rho1p (ver MATERIALES Y MÉTODOS) reconocieron una proteína del tamaño apropiado por transferencia Western, y la preincubación de los anticuerpos con el péptido bloqueó este reconocimiento (Figura 3A). Además, esta banda aumentó en intensidad cuando RHO1 se sobreexpresó (Figura 3B). Cuando los anticuerpos se usaron para la inmunolocalización en células de tipo salvaje, se encontró Rho1p en un parche en el sitio donde ocurrirá la emergencia de la yema, en la punta de la nueva yema y luego alrededor de la corteza de la yema a medida que crece (Figura 3C ), como se describió anteriormente (Yamochi et al., 1994). En ausencia de Sla1p, aunque la localización de Rho1p fue relativamente normal durante la formación de la yema, muchas células sin brotar mostraron tinción en toda la corteza celular (Figura 3D). Por el contrario, en las células de tipo salvaje, se observó poca o ninguna tinción cortical general en las células no agrupadas (Figura 3C). Los recuentos mostraron que casi el 50% de los sla1las células nulas mostraron una tinción cortical inapropiada (Figura 3E).

Fig. 3. Eliminación de SLA1 afecta la localización de Rho1p. (A y B) Inmunotransferencias de lisados ​​de células enteras (10 μg / carril) sondeados con anticuerpos anti-Rho1p purificados por afinidad. (A) Lisado de células de tipo salvaje (DDY664) probadas con anticuerpos sin tratar (carril izquierdo) o con los mismos anticuerpos después de la preincubación con el antígeno peptídico Rho1p (carril derecho). (B) Lisados ​​de DDY1097 (que llevan unGALÓNRHO1 plásmido carril derecho) y DDY1098 (que lleva un plásmido de control) se prepararon después del crecimiento en galactosa durante 8 h y se sondaron con los anticuerpos anti-Rho1p (abajo) o (como control de carga) con anticuerpos anti-β-tubulina (arriba). (C y D) Inmunolocalización de Rho1p en células en fase logarítmica de tipo salvaje (C) y sla1 celdas nulas (D) Bar, 5 μm. (E) Se contaron los patrones de tinción de las células sin brotar. Los datos que se muestran son los promedios de tres experimentos en los que se puntuaron al menos 200 células no agrupadas. El único parche de tinción en las células sin brotes de tipo salvaje es presumiblemente el sitio del que emergerá el nuevo brote.

Anteriormente mostramos que en presencia de latrunculina-A, un fármaco que altera la actina, Sla1p pudo localizarse en la corteza celular pero no pudo polarizar en el sitio de la yema incipiente (Ayscough et al., 1997). El resultado presentado aquí que muestra una dependencia de Rho1p en Sla1p para su localización sugeriría que Rho1p también debería ser incapaz de polarizar en ausencia de un citoesqueleto de actina intacto. Probamos la dependencia de la localización de Rho1p en F-actina como se describe en Ayscough et al. (1997) y observaron que Rho1p fue capaz de localizarse en la corteza celular en presencia de latrunculina-A pero no se polarizó en los extremos de la célula (nuestros resultados no publicados). Un recuento de las células reveló que & gt70% de las células mostró tinción cortical pero no polarizada de Rho1p y 13% mostró tinción tanto en toda la corteza como en un parche en un extremo de una célula. Las células restantes no mostraron tinción detectable para Rho1p.

Rho1p regula la enzima sintetizadora de la pared celular 1,3-β-glucano sintasa (Drgonová et al., 1996 Qadota et al., 1996). Para investigar si la localización anormal de Rho1p en sla1 células nulas afectadas por la deposición de la pared celular, utilizamos microscopía electrónica. Como se muestra en la Figura 4, el sla1 Las células mutantes nulas mostraron un engrosamiento aberrante de las paredes de las células madre y sin brotes. Este engrosamiento pareció ser uniforme en toda la superficie de las células madre y sin brotar, pero no se extendió a las yemas (Figura 4B), de acuerdo con la localización relativamente normal de Rho1p en las células en gemación (ver arriba).

Fig. 4. Las células nulas sla1 tienen paredes celulares gruesas. (A) Tipo salvaje y (B) Δsla1 las células se cultivaron hasta la fase logarítmica y luego se fijaron y procesaron para microscopía electrónica utilizando fijación de permanganato de potasio para mejorar la visualización de la pared celular y las membranas.

La expresión de formas mutantes de Sla1p define dominios funcionales dentro de la proteína

La secuencia primaria de Sla1p sugiere que hay elementos estructurales dentro de la proteína que podrían ser responsables de funciones e interacciones específicas. Una serie de sla1 mutantes de deleción (Figura 5) se expresaron ensla1 celdas nulas para explorar esta posibilidad. Las transferencias de Western verificaron que se expresaban niveles similares de Sla1p en las células que llevaban las diferentes construcciones (nuestros resultados no publicados), lo que indica que las estabilidades de las proteínas Sla1 mutantes no se redujeron significativamente.

Fig. 5. Mutante sla1 constructos. Los detalles de la construcción del plásmido se dan en la Tabla 2.

Luego determinamos si las proteínas mutantes Sla1 eran capaces de rescatar dos fenotipos asociados con la deleción de SLA1, crecimiento sensible a la temperatura y dependencia de Abp1p. Los transformantes se sembraron en placas sobre medios selectivos apropiados a 25 ° o 37 ° C (Figura 6A). Todos menos uno de los constructos, Sla1-ΔG1 + SH3 # 3, pudieron rescatar la sensibilidad a la temperatura del sla1 mutante nulo. Esta construcción carecía de la región entre el segundo y tercer dominio SH3 (Gap1) y también el tercer dominio SH3 (Figura 5). Curiosamente, los mutantes que carecen de Gap1 solo o del tercer dominio SH3 solo pudieron soportar el crecimiento a la temperatura no permisiva. Además, otro constructo, Sla1-ΔG2, sólo soportó un crecimiento deficiente a 37 ° C.

Fig. 6. Crecimiento de células que contienen proteínas Sla1 mutantes. (A) Células en las que la copia genómica de SLA1 fue eliminado (KAY14) se transformaron con el sla1 constructos mutantes y sembrados en medio selectivo a 25 ° y 37 ° C. (B) Células portadoras ABP1 en un URA3plásmido marcado (KAY78) se transformaron con el sla1 constructos mutantes y ensayados para el crecimiento en medio selectivo en presencia o ausencia de 5-FOA. (C) Las células (KAY14) se cotransformaron con sla1construcciones mutantes Sla1-ΔC-term.rpts y Sla1ΔGap1 + SH3 # 3 y se ensayaron para el crecimiento a 37 ° C. La expresión de ambas formas de Sla1p se verificó mediante transferencia Western.

Se probó el rescate del fenotipo de dependencia de Abp1p mediante placassla1 abp1 Células de doble mutante que portaban unURA3-marcado ABP1 plásmido y expresó los diversos sla1 constructos mutantes en medio que contiene 5-FOA, que selecciona contra el ABP1plásmido portador (Figura 6B). En estas celdas, ABP1 estaba presente solo en unURA3plásmido marcado. En ausencia de Sla1p, estas células no pueden crecer sin el ABP1 plásmido y, como resultado, no puede crecer en placas de 5-FOA. De las formas mutantes de Sla1p, solo las células que expresan repeticiones Sla1-ΔC-terminales no lograron rescatar la dependencia de Abp1p. Este resultado sugiere que esta región de repetición está involucrada en una función que es redundante con la de Abp1p.

En este análisis inicial, habíamos identificado una proteína mutante que rescató la dependencia de Abp1p del sla1 mutante nulo pero no su sensibilidad a la temperatura y un segundo que rescató la sensibilidad a la temperatura pero no la dependencia de Abp1p. Para probar si las dos funciones Sla1p podrían realizarse en transformantes, las dos construcciones mutantes se cotransformaron en sla1 celdas nulas. Los transformantes crecieron muy mal a 37 ° C (Figura 6C), lo que sugiere que Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 inhibe competitivamente las repeticiones Sla1-ΔC-terminales (Sla1-ΔC-term.rpts).

Organización de la actina en las células que expresan las formas mutantes de Sla1p

Como se ha mencionado más arriba, sla1 los mutantes nulos tienen menos parches de actina cortical, y estos parches parecen más grandes y menos polarizados de lo normal (Figura 7, B y C). Para evaluar si este fenotipo de actina aberrante se puede atribuir a un dominio particular de Sla1p, se tiñeron las células que expresan los diferentes mutantes Sla1p con Rd-faloidina. Se contaron las células con parches de actina cortical de tipo salvaje o aberrante, y esto se resume en la Figura 7A. Las células representativas de tres de los mutantes se muestran en la Figura 7, D – F. Las células que expresan Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 (Figura 7D) tenían el fenotipo de actina más severo, similar al de sla1células nulas, lo que indica que este dominio juega un papel crítico en la regulación de la organización de la actina cortical. Por el contrario, las células que expresan la mayoría de las otras formas mutantes de Sla1p tenían un patrón de tinción casi indistinguible del de las células de tipo salvaje. Por ejemplo, la Figura 7E muestra el patrón de tinción para las repeticiones Sla1-ΔC-terminal. Por tanto, estas proteínas contienen la información necesaria para mantener la organización normal del citoesqueleto de actina cortical. Algunos de los mutantes, incluidos Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2 y Sla1-ΔGap1, tienen un fenotipo de actina parcialmente penetrante con ∼15-20% de las células de la población que tienen trozos de actina, aunque las células restantes tienen una apariencia de actina de tipo salvaje (Figura 7F, Sla1-ΔSH3 # 1 y amp2).

Fig. 7. Organización de actina en células que expresan formas mutantes de Sla1p. Las células en fase logarítmica se procesaron para la tinción con Rd-faloidina. (A) Para cada mutante, se puntuaron al menos 300 células para la morfología del parche de actina de tipo salvaje o aberrante. Se muestran imágenes representativas de tinción de actina para células que expresan (B) Sla1p de tipo salvaje, (C) sin Sla1p, (D) Sla1-ΔG1 + SH3 # 3, (E) Sla1-ΔC-terminal repeticiones, (F) Sla1- ΔSH3 # 1 y amp2. Barra, 5 μm.

También realizamos microscopía de inmunofluorescencia de doble marcaje para actina y Sla2p en células que expresan formas mutantes de Sla1p (nuestros resultados no publicados). Nuestros resultados indicaron que el desacoplamiento de Sla2p y la localización del parche de actina cortical se correlaciona con la gravedad del defecto de actina en lugar de un dominio de unión a Sla2p específico en Sla1p.

Análisis del papel de Sla1p utilizando un ensayo de células permeabilizadas

Se usó un ensayo de células permeabilizadas in vitro para probar aún más el papel de Sla1p en la regulación del ensamblaje del parche de actina. El ensayo mide el ensamblaje nucleado de rodamina-actina añadida exógenamente en parches polarizados en la corteza de las células permeabilizadas (Li et al., 1995). Estos parches se parecen a los observados in vivo en términos de tamaño y distribución (Figura 8A). Como se informó anteriormente (Liet al., 1995), permeabilizado sla1 las células nulas son incapaces de soportar el ensamblaje de actina nucleada y muestran solo un nivel de fondo bajo de fluorescencia de rodamina-actina que nunca se ensambla en parches corticales (Figura 8B). sla1 células nulas que expresan tres de los mutantes sla1 Se examinaron las construcciones y los datos se cuantificaron y expresaron como el rango de intensidades de fluorescencia medidas dentro de las yemas de las células con yemas pequeñas. Las células que expresan repeticiones Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2 o Sla1-ΔC-terminal ensamblaron parches polarizados distintos de rodamina-actina que se asemejan a los observados en las células de tipo salvaje, y los niveles de fluorescencia fueron similares o (para Sla1-ΔSH3 # 1 y amp2) algo mayores que los observados en células de tipo salvaje (Figuras 8, C y E).

Fig. 8. Incorporación de rodamina-actina en células permeabilizadas que expresan formas mutantes de Sla1p. Células que expresan (A) Sla1p de tipo salvaje, (B) sin Sla1p, (C) Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2, (D) Sla1-ΔG1 + SH3 # 3, (E) Sla1-ΔC-term. las repeticiones se cultivaron, permeabilizaron y probaron para el ensamblaje de actina como lo describe Liet al., (1995) (ver MATERIALES Y MÉTODOS). A continuación, se observaron los sitios de incorporación mediante microscopía de fluorescencia y se midió la intensidad de la fluorescencia en las yemas. Las unidades de intensidad de fluorescencia son arbitrarias. Barra, 5 μm.

Por el contrario, la deleción de la región Gap1 y el tercer dominio SH3 juntos, pero de ninguno solo, provocó que las células fueran completamente defectuosas en la incorporación de rodamina-actina en las estructuras corticales de actina (Figura 8D).

Para investigar más a fondo la importancia de Sla1p en el ensamblaje de parches de actina, se agregaron extractos de células a permeabilizado sla1células nulas en un intento de reconstituir la actividad de ensamblaje de actina. De hecho, la actividad podría restaurarse mediante la adición de extractos de células de tipo salvaje, pero extractos de sla1 las células nulas o de células que expresan solamente Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 no pudieron restaurar la actividad de ensamblaje de actina (Eby y Ayscough, datos no publicados, ver MATERIALES Y MÉTODOS). Estos datos apoyan aún más la conclusión de que Sla1p desempeña un papel directo en la regulación del citoesqueleto de actina cortical.

Un homólogo de levadura de fisión de SLA1 puede rescatar la sensibilidad a la temperatura de las células nulas de S. cerevisiae sla1

Un homólogo completo de SLA1 fue identificado en elS. pombe base de datos del genoma. Aunque la similitud general de la secuencia no es alta (27%), la predicción S. pombeLa proteína contiene los mismos dominios reconocibles de Sla1p, incluidos tres dominios SH3, un motivo de hélice de prolina y una región de repetición C-terminal (Figura 9A). Además, en el tercio central de las proteínas había dos regiones no relacionadas, cada una de ∼60 aminoácidos, que eran más similares (58 y 60% de identidad, respectivamente) que cualquier otra parte de la proteína (Figura 9A). Estos dominios no comparten una homología significativa con otras secuencias en las bases de datos de acceso público. El antisuero elevado a S. cerevisiae Sla1p no reconoció una proteína del tamaño apropiado en una transferencia Western de S. pombe proteínas, ni dieron un patrón de tinción distinto por inmunofluorescencia. los S. pombe sla1 El gen se clonó a partir del ADN del cósmido en un vector de sobreexpresión y se transformó en S. cerevisiae celdas en las queSLA1 había sido eliminado. los S. pombe gen pudo rescatar parcialmente la sensibilidad a la temperatura asociada con la deleción (Figura 9, B y C) sin embargo, la tinción de estas células para la actina indicó que su organización aberrante de actina no fue rescatada por el gen de la levadura de fisión.

Fig. 9. El S. pombe homólogo deSLA1 rescata la sensibilidad a la temperatura de S. cerevisiae sla1Δ células. (A) S. pombe Sla1p tiene una estructura de dominio similar a la de S. cerevisiaeSla1p. Dos regiones de alta homología se denominan SHD (dominio de homología Sla1p) 1 y 2. Los porcentajes de identidad de los dominios SH3 y las regiones SHD se indican debajo de los motivos respectivos. Crecimiento deS. cerevisiae sla1 celdas nulas (KAY14) que contienenS. cerevisiae SLA1, S. pombe sla1, o el vector solo se probó a (B) 29 ° C y (C) 37 ° C.


Estados oligoméricos alternativos del complejo de levadura Rvb1 / Rvb2 inducidos por etiquetas de histidina

Rvb1 y Rvb2 son esenciales AAA + (ATPases aasociado con diversas aactividades) helicasas, que son componentes importantes de complejos críticos como los complejos de remodelación de cromatina y telomerasa. El estado oligomérico de las proteínas Rvb ha sido controvertido. Independent studies from several groups have described the yeast and human Rvb1/Rvb2 complex both as a single and as a double hexameric ring complex. We found that histidine-tagged constructs of yeast Rvb proteins employed in some of these studies induced the assembly of double hexameric ring Rvb1/Rvb2 complexes. Instead, untagged versions of these proteins assemble into single hexameric rings. Furthermore, purified endogenous untagged Rvb1/Rvb2 complexes from Saccharomyces cerevisiae were also found as single hexameric rings, similar to the complexes assembled in vitro from the purified untagged components. These results demonstrate that some of the differences between the reported structures are caused by histidine tags and imply that further studies on the purified proteins should be carried out using untagged constructs.


Yeast are first cells known to cure themselves of prions

When colonies of baker's yeast cells that contain clumped prion proteins (colonies of white cells on left) are stressed by high temperatures, some can convert the aggregated prion proteins to the non-clumping form of the protein (red cells in the colonies the right). Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

Yeast cells can sometimes reverse the protein misfolding and clumping associated with diseases such as Alzheimer's, according to new research from the University of Arizona.

The new finding contradicts the idea that once prion proteins have changed into the shape that aggregates, the change is irreversible.

"It's believed that when these aggregates arise that cells cannot get rid of them," said Tricia Serio, UA professor and head of the department of molecular and cellular biology. "We've shown that's not the case. Cells can clear themselves of these aggregates."

Prions are proteins that change into a shape that triggers their neighbors to change, also. In that new form, the proteins cluster. The aggregates, called amyloids, are associated with diseases including Alzheimer's, Huntington's and Parkinson's.

"The prion protein is kind of like Dr. Jekyll and Mr. Hyde," said Serio, senior author of the paper published today in the open-access journal eLife. "When you get Hyde, all the prion protein that gets made after that is folded in that bad way."

For yeast, having clumps of amyloid is not fatal. Serio and her students exposed amyloid-containing cells of baker's yeast to 104 F (40 C), a temperature that would be a high fever in a human. When exposed to that environment, the cells activated a stress response that changed the clumping proteins back to the no-clumping shape.

The finding suggests artificially inducing stress responses may one day help develop treatments for diseases associated with misfolded prion proteins, Serio said.

"People are trying to develop therapeutics that will artificially induce stress responses," she said. "Our work serves as a proof of principal that it's a fruitful path to follow."

First author on the paper "Spatial quality control bypasses cell-based limitations on proteostasis to promote prion curing" is Serio's former graduate student Courtney Klaips, now at the Max Planck Institute for Biochemistry in Munich. The other authors are Serio's students Megan Hochstrasser, now at the University of California, Berkeley, and Christine Langlois of Brown University.

National Institute of Health grants R01 GM069802001, F31 AG034754 and F31 GM099383 funded the research.

These yeast cells contain a prion protein that can change shape from a non-clumping form to one that aggregates into clumps called amyloids. Proteins in these cells have the non-clumping shape and are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

To accomplish their jobs inside cells, proteins must fold into specific shapes. Cells have quality-control mechanisms that usually keep proteins from misfolding. However, under some environmental stresses, those mechanisms break down and proteins do misfold, sometimes forming amyloids.

Cells respond to environmental stress by making specific proteins, known as heat-shock proteins, which are known to help prevent protein misfolding.

Serio and her students wanted to know whether particular heat-shock proteins could make amyloids revert to the normal shape. To that end, the team studied yeast cells that seemed unable to clear themselves of the amyloid form of the prion protein Sup35.

The researchers were testing one heat-shock protein at a time in an attempt to figure out which particular proteins were needed to clear the amyloids. However, the results weren't making sense, she said.

So she and Klaips decided to stress yeast cells by exposing them to a range of elevated temperatures - as much as 104 F (40 C) - and let the cells do what comes naturally.

As a result, the cells made a battery of heat-shock proteins. The researchers found at one specific stage of the cell's reproductive cycle, the yeast could turn aggregates of Sup35 back into the non-clumping form of the protein.

Yeast cells reproduce by budding. The mother cell partitions off a bit of itself into a much smaller daughter cell, which separates and then grows up.

The researchers found in the heat-stressed yeast, just when the daughter was being formed, the mother cell retained most of the heat-shock proteins called chaperones, especially Hsp-104. As a result, the mother had a particularly high concentration of Hsp-104 because little of the protein was shared with the daughter.

The fluorescent green chunks in these yeast cells are prion proteins that have assumed the shape that aggregates into clumps called amyloids. The prion proteins in these cells are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

The mother cells ended up "curing" themselves of the Sup35 amyloid, although the daughters did not. The degree of curing was correlated with the concentration of Hsp-104 in the cell, and the higher the temperature the more Hsp-104 the cells had.

The Hsp-104 takes the protein in the amyloid and refolds it, Serio said. But she and her colleagues found that just inducing high levels of Hsp-104 in cells by itself does not change the amyloid protein back to the non-clumping form.

"Clearly the heat-shock proteins are collaborating in some way that we don't understand," she said.

Having the amyloid-forming version of the protein is not automatically bad, she said. It may be that shape is good under some environmental conditions, whereas the non-aggregating form is good under others.

Even in humans, amyloid forms of a protein can be helpful, she said. Amyloid proteins are associated with skin pigmentation and with hormone storage.

To clear the amyloid from yeast cells, these experiments triggered cells to make many different heat-shock proteins.

Serio now wants to figure out the minimal system necessary to clear amyloids from a cell. Knowing that may help the development of drug therapies for amyloid-related human diseases, she said.


Agradecimientos

This work was supported by the European Commission (Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network “HONOURS” grant agreement no. 721367), the Swiss National Science Foundation (SNF grants CRSII3_160780 and 310030_173085), the German Research Council (DFG grants SFB-TR84 (TRR 84/3, A07) and DR 772/7-2), the Federal Ministry of Education and Research (BMBF grant RAPID, 01KI1723A) and by core funds of the University of Bern. We thank S. Vashee for the provision of the TAR vectors and for discussions related to his herpesvirus work J. Peters Zocher for her advice in generating the figures F. Suter-Riniker and P. Bittel for providing clinical samples staff from the Next Generation Sequencing platform (University of Bern) and M. Schweizer, P. Plattet, M. Gerber, M. Friesland, M. Alves, N. Vielle, B. Zumkehr, M. Brügger and D. Brechbühl for reagents, technical advice and helpful discussions. This study is dedicated to S. Kunz.


Resultados y discusión

Efficient Construction of Yeast Homozygous Diploid Strains

Our strategy for construction of homozygous diploid cells is shown in Figure 1B . As a host strain, we used either a ESTERA a o ESTERA & # x003b1 haploid strain carrying i) PSTE18-URA3, which expresses the URA3 gene under the control of haploid specific STE18 (G-protein γ subunit) promoter [11] and ii) PGAL1-HO, which expresses the HO endonuclease under the control of GAL1 promoter (repressed by glucose and induced by galactose [12]). Once the host strain is transiently incubated on galactose plates (HO induction) , the mating-type switch (ESTERA a& # x02192ESTERA & # x003b1 o ESTERA & # x003b1& # x02192ESTERA a) occurs and consequently diploid cells are formed by mating of ESTERA a y ESTERA & # x003b1 cells within colonies. Following short induction times of HO (㰒 hours), the colonies contain three cell types, ESTERA a, ESTERA & # x003b1, y ESTERA a / & # x003b1. Our strategy can select diploids by counter selection using 5-FOA, where haploids cannot grow because Ura3 (orotidine-5′-phosphate decarboxylase) converts 5-FOA into a toxic compound [13], while diploids are resistant to 5-FOA because URA3 is not expressed. Leaky expression of HO does not matter as long as the host strain is maintained on plates lacking uracil.

First, we investigated whether the PSTE18-URA3 gene allows selecting for diploid cells. We constructed wild-type PSTE18-URA3 y hog1Δ PSTE18-URA3 strains in the three cell types (ESTERA a, ESTERA & # x003b1, y ESTERA a / & # x003b1) and grew them on SC plates lacking uracil or containing 0.1% 5-FOA. As shown in Figure 2A , the haploid and diploid PSTE18-URA3 strains showed the expected phenotypes, i.e. the haploid strains were uracil prototrophic and 5-FOA sensitive, and the diploid strains were uracil auxotrophic and 5-FOA resistant. Moreover, the haploid cells that germinated from spore progeny of the diploid PSTE18-URA3 strains displayed uracil prototrophy and 5-FOA sensitivity ( Figure 2B ). Taken together, these results demonstrate that the PSTE18-URA3 gene can be used as a diploid selection marker.

(A) The haploid and diploid PSTE18-URA3 strains display opposite growth phenotypes on plates lacking uracil or containing 5-FOA. The strains were grown for 2𠄳 days at 30ଌ. (B) The growth phenotype of the diploid PSTE18-URA3 strain can revert to that of haploid after sporulation. The indicated diploid strains were sporulated, tetrads were dissected and spore progeny was grown on YPD plate for 3 days at 30ଌ. Then, the cells were replicated on the indicated plates and grown for 2𠄳 days at 30ଌ.

Next, we determined the efficiency of construction of diploids by our strategy. The wild-type PSTE18-URA3 y hog1Δ PSTE18-URA3 cepasESTERA a y ESTERA & # x003b1) carrying pJH283 (PGAL1-HO) were grown overnight on galactose plate, and then cells were restreaked on SC plate containing 0.1% 5-FOA. The single colonies obtained on the 5-FOA plate were analyzed by two methods: i) observation of pseudohyphal growth on SLAD plate, and ii) determination of mating type by PCR. All of the single colonies analyzed (10 colonies for each strain) showed diploid specific patterns: i) strongly enhanced pseudohyphal growth (data not shown), and ii) two PCR bands corresponding to diploids (Figure S1). These results indicate that our method is highly efficient for construction of diploid strains.

Screening Suppressor Mutations of Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

To demonstrate that our strategy for construction of diploid strains is useful for genetic studies of diploid-specific developments, we applied it to yeast filamentous growth in the � background. Transposon insertion mediated-random mutagenesis and -systematic gene disruption have previously been employed to dissect the genetic bases of filamentous growth [14], [15]. However, these studies used haploid strain backgrounds in which filamentous growth was ectopically induced by an extra copy of the opposite mating-type locus and the PHD1 gene (transcriptional activator for filamentation) or by adding 1% butanol to the growth medium. In addition, however, homozygous diploid strains must be used to analyze the genetics of filamentous growth. We have recently reported that hyperosmotic stress inhibits all of the yeast morphological developments and that the Hog1 MAPK is a central negative regulator of these developments [10]. Moreover, the effect of HOG1 deletion is reflected in diploids more clearly than in haploids [16]. Therefore, suppressor mutations of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ are expected to lead to the identification of genes involved in controlling those phenotypes. In the present study, we screened suppressor mutations of complex colony morphology, strong invasive growth, and hyper-filamentous growth in the � hog1Δ/hog1Δ background by constructing homozygous double mutants (i.e. xxx::mTn/xxx::mTn hog1Δ/hog1Δ).

Following the strategy shown in Figure 3A , a transposon insertion mutagenesis was performed using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO) as a host strain. Since the diploid hog1Δ/hog1Δ strain displays complex colony morphology even on YPD plates while the diploid wild-type strain does not [10], [16], mutant strains defective in formation of complex colony morphology were first screened by visual inspection ( Figure 3B ). From more than six thousand 5-FOA resistant strains (candidates for homozygous diploids) which were obtained at 93% success rate of randomly picked transformants, we isolated more than 100 mutant strains that showed smooth- or less complex-colony morphology. The diploid state in those was confirmed by PCR analysis of the mating-type locus. We amplified the transposon insertion regions of these strains by vectorette PCR and sequencing of the PCR products identified 49 unique genes ( Table 1 and Table S1). Morphological developments (complex colony morphology, invasive growth, and filamentous growth) of all 49 homozygous double mutant strains on YPD plates were characterized, and the results are discussed below.

(A) Strategy for screening the suppressor mutations. Using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO::TRP1) as a host strain, transposon insertion mutagenesis was performed and mutant strains defective in complex colony morphology were screened by visual inspection. The details are described in Materials and Methods. (B) One example of the screening results is shown. The candidates, smooth colony or less complex colony, were further analyzed: identification of the transposon insertion position, mating-type PCR, and morphological assay for invasive growth and filamentous growth.

Tabla 1

GeneCCMIGFGDescription of gene productReferencia
ADE6– –– –& # x02013Formylglycinamidine-ribonucleotide (FGAM)-synthetaseEste estudio
AMN1– –& # x02013& # x02013Protein required for daughter cell separation, multiple mitotic checkpoints, and chromosome stability [15]
ATO2– –– –& # x0002bPutative transmembrane protein involved in export of ammoniaEste estudio
CLN1– –& # x02013– –G1 cyclin involved in regulation of the cell cycle [16], [23]
DHH1– –– –& # x02013Cytoplasmic DExD/H-box helicase [24]
FLO8– –– –– –Transcription factor required for flocculation, diploid filamentous growth, and haploid invasive growth [15], [20]
GCN2– –& # x02013& # x0002bProtein kinase that phosphorylates the alpha-subunit of translation initiation factor eIF2 [19]
HIR2– –& # x02013& # x02013Subunit of the HIR complex [15]
HIR3– –& # x02013& # x02013Subunit of the HIR complexEste estudio
IES1& # x02013& # x0002b& # x02013Subunit of the INO80 chromatin remodeling complexEste estudio
IMP2′& # x02013& # x02013& # x02013Transcriptional activator involved in maintenance of ion homeostasis and protection against DNA damageEste estudio
KRE11& # x02013& # x02013& # x0002bSubunit of the TRAPP II (transport protein particle) complexEste estudio
KSS1– –– –– –Mitogen-activated protein kinase involved in filamentous growth and pheromone response [21]
MSN1& # x02013– –& # x02013Transcriptional activator involved in invertase expression and invasive growth/pseudohyphal differentiation [15], [26]
MTC5– –– –– –Subunit of the SEA (Seh1-associated) complexEste estudio
RAD1– –– –& # x02013Single-stranded DNA endonucleaseEste estudio
RAD24& # x02013& # x02013& # x0002bCheckpoint protein involved in the activation of the DNA damage and meiotic pachytene checkpointsEste estudio
RAS2– –– –– –GTP-binding protein that regulates the nitrogen starvation response, sporulation, and filamentous growth [15], [16]
RDI1& # x02013& # x0002b& # x02013Rho GDP dissociation inhibitor involved in the localization and regulation of Cdc42 [22]
RIM9– –– –– –Protein of unknown function involved in the proteolytic activation of Rim101p in response to alkaline pH [15], [27]
SHE10– –& # x02013& # x0002bPutative glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein of unknown functionEste estudio
SIR3– –– –& # x02013Silencing protein that interacts with Sir2p and Sir4p, and histone H3 and H4 tailsEste estudio
SLP1& # x02013& # x02013& # x02013Member of the SUN-like family of proteinsEste estudio
SPT2& # x02013– –& # x02013Protein involved in negative regulation of transcriptionEste estudio
STE7– –– –– –MAPK kinase involved in pheromone response and pseudohyphal/invasive growth [16], [21]
TCO89& # x02013& # x02013& # x02013Subunit of TORC1, a complex that regulates growth in response to nutrient availabilityEste estudio
TEC1– –– –– –Transcription factor required for haploid invasive and diploid pseudohyphal growth (TEA/ATTS family) [14], [15], [16]
UBP6& # x02013& # x02013& # x02013Ubiquitin-specific proteaseEste estudio
YDR306C– –– –& # x0002bF-box protein of unknown functionEste estudio
YHR177W– –– –– –Putative protein of unknown functionEste estudio

Mitochondrial Function Is Essential for Complex Colony Morphology

Sixteen of the 49 strains displayed petite and smooth colony morphology (Figure S2) and were unable to grow on plates containing glycerol as a sole carbon source (data not shown). These phenotypes suggest impaired respiratory growth, and all of these mutations are indeed linked to mitochondrial functions (Table S1). We confirmed that a rho 0 mutant (lacking mitochondria DNA) in the hog1Δ/hog1Δ background also displays petite and smooth colony morphology (Figure S2). Moreover, we identified three additional genes encoding proteins related to mitochondrial functions, ILM1, SCO1, y SDH1 (Table S1). These results indicate that mitochondrial function is essential for complex colony morphology. Jin et al. have previously shown that mitochondrial dysfunction inhibits filamentous growth through the retrograde signaling pathway, which is a mitochondria-to-nucleus pathway transducing changes in mitochondrial function to specific adaptive changes in nuclear gene expression [15]. ILM1 is known to be required for both mitochondrial function and slowed DNA synthesis-induced filamentous growth [17]. However, all of the mitochondria-related mutants identified by our screen poorly suppressed hyper-filamentous growth and strong invasive growth of the hog1Δ/hog1Δ strain (data not shown), suggesting that the hyper-filamentous phenotype of HOG1 deletion involves multiple mechanisms that are not simply suppressed by mitochondrial dysfunction. Alonso-Monge et al. have recently reported that the Candida albicans hog1 mutant shows an enhanced basal respiratory rate compared to the wild-type strain and suggested a link between Hog1 and mitochondrial function [18]. Therefore, it would be interesting to investigate whether and how Hog1 activated by hyperosmotic stress inhibits mitochondrial function during filamentous growth.

Multiple Mechanisms Are Necessary for the Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

In addition to the mitochondria-related mutations, we identified 30 mutations that suppress at least two of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ (Table S1) and representative mutants are shown in Figure 4 . Thirteen of the 30 genes have previously been reported to be involved in at least one of the three morphological developments in the S. cerevisiae � background [14], [15], [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24]. Those genes include the well-known STE7, KSS1, TEC1, RAS2, y FLO8 that regulate filamentous growth via the MAPK or cAMP-PKA signaling pathway. These two signaling pathways converge on the regulation of the MUC1 (también conocido como FLO11) gene [25], which encodes a GPI-anchored cell surface mucin required for morphological developments. DHH1 is involved in translational regulation of the Ste12 transcription factor which is regulated under the Kss1 MAPK pathway and essential for MUC1 expression [24]. GCN2 (general amino acid control system) and MSN1 (transcriptional activator) are involved in the regulation of MUC1 under certain nutrient conditions [19], [26]. Presumably, RIM9 is also important for the regulation of MUC1 through the pH-responsive Dfg16-Rim101 pathway [27]. Thus, our screen implies that impaired MUC1 expression is sufficient to suppress enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ. Indeed, deletion of the MUC1 gene in the hog1Δ/hog1Δ background lost the enhanced morphological developments and resulted in morphology similar to a muc1Δ/muc1Δ strain ( Figure 4 ).

CCM: complex colony morphology, IG: invasive growth, FG: filamentous growth. All other suppressor mutants identified are shown in Table 1 .

Seventeen of the 30 mutations occurred in genes not previously implicated in filamentous growth in S. cerevisiae. These gene products are involved in various cellular mechanisms, especially DNA damage checkpoint control (IMP2′, RAD1, y RAD24), gene expression via chromatin remodeling or histone-nucleosome assembly (HIR2, HIR3, IES1, SIR3, y SPT2), control of cell cycle or cell division (AMN1 y YHR177W), and other functions. Although the present study did not reveal the morphological suppressing mechanism by deletion of these genes or physical interactions between Hog1 and the identified targets, our screen could highlight the genetic networks that are required for the enhanced morphological developments independent of the filamentous growth signaling pathways. Since the active Hog1 (Hog1-D170A/F318S) strain inhibits all of the morphological developments in a hyperosmotic stress-independent manner [10], the mechanisms identified in our screen might be negatively regulated by Hog1. While crosstalk between the HOG and filamentous growth MAPK pathways is well established [28], the present mutant collection will enable further analyses of connections between the HOG pathway and other mechanisms. Such efforts can contribute to understanding mechanisms of filamentous growth common between model yeasts and pathogenic yeasts as well as devising novel antifungal targets.

In conclusion, we demonstrate that combinatorial use of the PGAL1-HO y PSTE18-URA3 genes is effective for construction of homozygous diploid strains and a useful tool when combined with large-scale screening. Genetic information of S. cerevisiae homozygous diploids obtained by the method proposed in this study may be useful for the studies of other organisms such as diploid Candida albicans in which construction of homozygous mutant strains is a difficult task.


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