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¿Qué tipo de tecnología se requiere para la impresión de ADN de semillas de plantas?


Soy programador, por lo que tengo pocos conocimientos en el campo de la biología. Sin embargo, me interesan las plantas, los transgénicos y el ADN (en términos de programación).

Entonces, quiero saber qué tipo de tecnología es necesaria y qué limitaciones existen en la creación de una impresora de ADN (que podría imprimir una célula para cultivarla en una maceta).

Primero, ¿cómo imprimimos el ADN de una planta? ¿Podemos imprimirlo todo del primer par de cromosomas? Escuché que ya podemos imprimir el ADN de las bacterias. ¿Es esto algo que podríamos lograr fuera de un laboratorio? ¿Podría hacerse a escala comercial?

En segundo lugar, ¿qué condiciones necesitamos para preparar el ADN si no es el de una bacteria sino el de una planta que se convertiría en un organismo multicelular? ¿Realmente podemos imprimir el ADN de una planta, inyectarlo en una célula y dejar que crezca?

En tercer lugar, ¿cuál es la comprensión actual del ADN? ¿Podemos analizar la hebra de ADN con software digital? ¿Podemos simular cómo le irá al organismo con el ADN? ¿Y cómo puedo empezar a trabajar en este campo? ¿Hay artículos científicos de los que pueda aprender?

PD Mi primer objetivo es hacer una vid de Nepenthes. Quiero tener una planta de vid como Pothos arrastrándose en mi cerca con jarras para comer insectos.


Lo más cerca que hemos estado de lograr esto fue probablemente cuando el instituto J. Craig Venter fabricó una bacteria sintética. Produjeron el genoma de las bacterias más pequeñas y simples que pudieron encontrar y, aun así, un gran equipo de investigadores tomó varios años y MUCHO dinero. Construir una planta sería exponencialmente más difícil.

Lo que complica esto es que necesitas más que ADN. Necesita las proteínas que leen el ADN y producen ARN y más proteínas. JCVI no solo tuvo que sintetizar el ADN de las bacterias que querían producir, sino que tuvo que tomar células de otra especie de bacteria, eliminar todo su ADN y luego insertar el nuevo ADN. Las proteínas sobrantes de la especie anterior pudieron leer el nuevo ADN y producir las proteínas que construyeron la nueva especie. Esto solo funcionó porque las 2 especies utilizadas estaban lo suficientemente cerca como para que los mismos promotores y elementos reguladores en el ADN pudieran interactuar con la proteína preexistente. Si pudiera crear un genoma vegetal e insertarlo en una bacteria, se podrían producir algunas proteínas vegetales, pero no se orquestaría lo suficientemente bien como para producir realmente una planta.


Como Chris mencionó en su comentario, 'imprimir' ADN desde cero (es decir, sintetizar una hebra larga de novo) es caro y difícil. Desafortunadamente, el proceso de creación de OGM no es tan simple como ensamblar una hermosa secuencia de ADN en la computadora, imprimirla y luego insertarla en una célula. Aquí hay una pregunta relacionada sobre de novo secuenciación. Biólogos de plantas, corríjanme si me equivoco, pero no creo que sea un asunto trivial cultivar una planta a partir de una sola célula cultivada.

Su tercera pregunta me recuerda la programación del ADN, que es un campo en desarrollo asombrosamente interesante. Muchas empresas (incluida Microsoft) están financiando investigaciones sobre circuitos de ADN y computación biológica, haciendo computadoras a partir de biomoléculas. Aquí tienes un artículo interesante que te dirá más. Lo que puede interesarle más es la rama de la programación del ADN que busca identificar el ADN discreto que codifica proteínas y, por lo demás, funcional que pueda utilizarse como una especie de "lenguaje de programación" para construir un nuevo organismo. Uno de mis supervisores anteriores se unió recientemente a este campo y estoy un poco celoso. En general, este es un campo muy nuevo, por lo que queda mucho por hacer y muy poco técnicamente posible, aunque el principio de los OMG es en realidad solo una optimización de un organismo existente.

En resumen, la respuesta a las tres preguntas es: No, no muy bien. Pero lo estamos intentando.

Lo más probable es que esto no sea algo que pueda recoger en su tiempo libre para tener una planta fresca para crecer en su cerca. Es muy caro y muy difícil (en algunos casos, tal vez incluso imposible). Sin embargo, hay tantas incógnitas en esta área de investigación y todo lo que propones es razonable. En teoria. Házmelo saber si lo averiguas. Me encantaría codificar mi propio jardín.


Transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium: biología y biotecnología

La transformación genética mediada por Agrobacterium es la tecnología dominante utilizada para la producción de plantas transgénicas modificadas genéticamente. Una amplia investigación dirigida a comprender y mejorar la maquinaria molecular de Agrobacterium responsable de la generación y transporte del ADN bacteriano a la célula huésped ha dado como resultado el establecimiento de muchas cepas, plásmidos y tecnologías de Agrobacterium recombinantes que se utilizan actualmente para la transformación exitosa de numerosas especies de plantas. . A diferencia del papel de las proteínas bacterianas, el papel de los factores del huésped en el proceso de transformación ha permanecido oscuro durante casi un siglo de investigación de Agrobacterium, y solo recientemente hemos comenzado a comprender cómo Agrobacterium secuestra los factores del huésped y los procesos celulares durante el proceso de transformación. La identificación de tales factores y los estudios de estos procesos son muy prometedores para el futuro de la biotecnología vegetal y la ingeniería genética vegetal, ya que podrían ayudar en el desarrollo de técnicas y enfoques conceptualmente nuevos que se necesitan hoy para ampliar la gama de hospedantes de Agrobacterium y controlar la proceso de transformación y su resultado durante la producción de plantas transgénicas.


Ingeniería genética: aplicaciones de la tecnología del ADN

El uso de ADN recombinante la tecnología se ha convertido en un lugar común a medida que nuevos productos de plantas, animales y microbios alterados genéticamente están disponibles para uso humano. En 1997, Dolly fue noticia como la primera con éxito clonado mamífero grande (oveja). Desde entonces ha habido muchos avances similares en la medicina, como los tratamientos para el cáncer, muchos avances en la agricultura, como los cultivos transgénicos resistentes a los insectos y muchos avances en la cría de animales, como las hormonas de crecimiento y transgénico animales (un animal que ha recibido ADN recombinante).

La mayoría de los biotecnólogos visualizan las aplicaciones tecnológicas del ADN como una de las nuevas fronteras de la ciencia con un enorme potencial de crecimiento y descubrimiento.

Medicamento

La ingeniería genética ha dado lugar a una serie de productos médicos. Los dos primeros productos preparados comercialmente a partir de la tecnología del ADN recombinante fueron la insulina y la hormona del crecimiento humana, ambos cultivados en la bacteria E. coli. Desde entonces, han aparecido en el mercado una gran cantidad de productos, incluida la siguiente lista abreviada, todos fabricados en E. coli:

Bionote

A vacuna Por lo general, es una versión inofensiva de una bacteria o virus que se inyecta en un organismo para activar el sistema inmunológico para atacar y destruir sustancias similares en el futuro.

  • Factor de necrosis tumoral. Tratamiento para ciertas células tumorales
  • Interleucina-2 (IL-2). Tratamiento del cáncer, inmunodeficiencia y tratamiento de la infección por VIH
  • Prourokinase. Tratamiento para infartos
  • Taxol. Tratamiento para el cáncer de ovario
  • Interferón. Tratamiento para el cáncer y las infecciones virales.

Además, una serie de vacunas ahora se preparan comercialmente a partir de huéspedes recombinantes. Hubo un tiempo en que se fabricaban vacunas desnaturalizando la enfermedad y luego inyectándola en humanos con la esperanza de que activara su sistema inmunológico para combatir futuras intrusiones de ese invasor. Desafortunadamente, el paciente a veces aún terminaba con la enfermedad.

Con la tecnología del ADN, solo se necesita, se copia e inyecta en un huésped inofensivo la capa exterior identificable del microorganismo para crear la vacuna. Es probable que este método sea mucho más seguro porque el microbio que causa la enfermedad no se transfiere al huésped. El sistema inmunológico es activado por proteínas específicas en la superficie del microorganismo -e. La tecnología del ADN tiene eso en cuenta y solo utiliza las características de identificación de la superficie de la vacuna. Actualmente se están desarrollando vacunas contra el virus de la hepatitis B, el virus del herpes tipo 2 y la malaria para su uso en prueba en un futuro próximo.

Agricultura

Las plantas de cultivo han sido y siguen siendo el foco de la biotecnología a medida que se realizan esfuerzos para mejorar el rendimiento y la rentabilidad mejorando la resistencia de los cultivos a los insectos y ciertos herbicidas y retrasando la maduración (para un mejor transporte y resistencia al deterioro). La creación de una planta transgénica, una que ha recibido genes de otro organismo, resultó más difícil que los animales. A diferencia de los animales, encontrar un vector para las plantas resultó ser difícil hasta que el aislamiento de la Plásmido Ti, extraído de una bacteria inductora de tumores (Ti) que se encuentra en el suelo. El plásmido está? Disparado? en una célula, donde el plásmido se adhiere fácilmente al ADN de la planta. Aunque tiene éxito en frutas y verduras, el plásmido Ti ha generado un éxito limitado en cultivos de cereales.

La creación de un cultivo resistente a un herbicida específico resultó ser un éxito porque el herbicida eliminó la competencia de malezas de la planta de cultivo. Los investigadores descubrieron bacterias resistentes a los herbicidas, aislaron los genes responsables de la enfermedad y? Dispararon? en una planta de cultivo, que luego demostró ser resistente a ese herbicida. De manera similar, las plantas resistentes a los insectos están disponibles a medida que los investigadores descubren enzimas bacterianas que destruyen o inmovilizan a los herbívoros no deseados y otras que aumentan la fijación de nitrógeno en el suelo para que las utilicen las plantas.

Los genetistas están en el umbral de un gran avance agrícola. Todas las plantas necesitan nitrógeno para crecer. De hecho, el nitrógeno es uno de los tres nutrientes más importantes que necesita una planta. Aunque la atmósfera contiene aproximadamente un 78 por ciento de nitrógeno, está en una forma inutilizable para las plantas. Sin embargo, un rizobio La bacteria se encuentra en el suelo y convierte el nitrógeno atmosférico en una forma utilizable por las plantas. Estas bacterias fijadoras de nitrógeno también se encuentran naturalmente en las legumbres de ciertas plantas como la soja y el maní. Debido a que contienen estas bacterias inusuales, pueden crecer en suelos deficientes en nitrógeno que prohíben el crecimiento de otras plantas de cultivo. Los investigadores esperan que al aislar estas bacterias, puedan identificar el segmento de ADN que codifica la fijación de nitrógeno, eliminar el segmento e insertarlo en el ADN de un cultivo comercial rentable. Al hacerlo, las nuevas plantas de cultivo transgénicas podrían vivir en nuevos territorios marginales, que normalmente son áreas no aptas para su crecimiento, ¡y crecer en las ubicaciones actuales sin la adición de costosos fertilizantes!

La cría de animales

Ni el uso de vacunas para animales ni la adición de hormonas de crecimiento bovino a las vacas para aumentar drásticamente la producción de leche pueden igualar la emoción real en la cría de animales: animales transgénicos y clones.

Los animales transgénicos modelan los avances en la tecnología del ADN en su desarrollo. El mecanismo para crear uno se puede describir en tres pasos:

  1. Se extraen óvulos sanos de una hembra del animal huésped y se fertilizan en el laboratorio.
  2. El gen deseado de otra especie se identifica, se aísla y se clona.
  3. Los genes clonados se inyectan directamente en los huevos, que luego se implantan quirúrgicamente en la hembra huésped, donde el embrión experimenta un proceso de desarrollo normal.

Se espera que este proceso proporcione un medio rápido y barato de generar las enzimas deseadas, otras proteínas y una mayor producción de carne, lana y otros productos animales a través de funciones naturales comunes.

Desde 1997, cuando se clonó Dolly, la investigación y la experimentación para clonar ganado útil ha continuado incesantemente. El atractivo de la clonación es el conocimiento de que la descendencia será genéticamente idéntica al padre como en la reproducción asexual. Cuatro pasos describen el proceso general:


Vacunas de origen vegetal: producción y desafíos

Las tecnologías de vacunas basadas en plantas implican la integración de los genes deseados que codifican la proteína antigénica para una enfermedad específica en el genoma de los tejidos vegetales mediante varios métodos. AgrobacteriumLa transferencia de genes mediada y la transformación a través de virus vegetales modificados genéticamente son los métodos habituales que se han utilizado para producir vacunas eficaces. Sin embargo, con el avance de la ciencia y la tecnología, se han desarrollado nuevos enfoques para aumentar la eficiencia de los métodos anteriores, como el tratamiento biolístico, electroporación, agroinfiltración, sonicación y polietilenglicol. Aunque las vacunas a base de plantas brindan muchos beneficios a la industria de las vacunas, todavía existen desafíos que limitan la tasa de producción exitosa de estas vacunas de tercera generación. Incluso con todas las limitaciones, se siguen realizando esfuerzos continuos para producir una vacuna eficaz para muchas enfermedades relacionadas con los seres humanos y los animales debido a su gran potencial. Este artículo revisa los métodos convencionales existentes, así como los esfuerzos de desarrollo de los investigadores para mejorar la producción de vacunas a base de plantas. También se discutieron varios desafíos encontrados durante y después del proceso de producción.

1. Introducción

Las vacunas ayudan a estimular la producción de anticuerpos en humanos y animales y proporcionan protección inmunológica contra varias enfermedades [1]. Sin embargo, la falta de disponibilidad de vacunas para el tratamiento de enfermedades mortales ha causado problemas e impulsado la atención mundial hacia la producción de vacunas más seguras, fáciles y eficaces. Generalmente, existen tres tipos de métodos de producción de vacunas, a saber, las vacunas a base de huevo, las vacunas a base de células y las vacunas producidas utilizando sistemas de fabricación en investigación. El ejemplo más común de vacuna a base de huevo es la vacuna contra la influenza producida en huevos embrionados de 9 a 12 días [2, 3]. Este método convencional se ha aplicado durante más de 60 años e implica la inyección de partículas de virus en los huevos y una incubación adicional durante varios días para permitir la replicación de las partículas de virus. Para producir una vacuna, el antígeno aislado del proceso de purificación de los huevos que contienen la partícula del virus de la vacuna se sometería a procedimientos adicionales. Sin embargo, la selección de las cepas del virus de la influenza más apropiadas para replicar para la producción de vacunas sigue siendo la principal limitación de este método, ya que no todas las cepas del virus de la influenza pueden replicarse en huevos embrionados, lo que afecta la cantidad de vacuna producida en los huevos. [2]. Aparte de eso, se requiere una gran cantidad de huevos para producir una vacuna, mientras que la aprobación reglamentaria para las vacunas producidas a partir del método a base de huevo lleva bastante tiempo [2, 4]. Mientras tanto, la principal limitación en la producción de vacunas a base de células sería el requisito de instalaciones de fermentación de alto precio. Con varias limitaciones en los dos primeros métodos convencionales, particularmente en relación con el tiempo, el costoso proceso de fabricación debido a la necesidad de almacenamiento en frío para las vacunas sensibles a la temperatura [5], y el riesgo de una respuesta inmune no deseada y el desarrollo de la enfermedad, investigación Los sistemas de fabricación, que utilizan sistemas biológicos como plantas, células de insectos o cultivo de bacterias para fabricar vacunas, han atraído recientemente la atención de los investigadores. Entre estos, la producción de vacunas a base de plantas ha recibido especial atención debido a las numerosas ventajas que puede ofrecer.

El intento de producir vacunas en plantas fue realizado por Hiatt y colaboradores en 1989 [6]. El Dr. Arntzen y sus colegas introdujeron el concepto de utilizar plantas transgénicas para producir y administrar vacunas de subunidades y demostraron que este concepto puede superar las limitaciones en la producción tradicional de vacunas [6]. La primera vacuna de subunidad fue producida por ellos en plantas de tabaco expresando el antígeno de proteína de superficie de Mutantes de Streptococcus. También iniciaron la producción de la hepatitis B y la subunidad de la toxina B termolábil en los tubérculos de papa y en las plantas de papa. En 1998, el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) demostró por primera vez que una vacuna comestible puede inducir una inmunogenicidad significativa de forma segura [6], utilizando el concepto de plantas como biorreactor. Debido al hecho de que la vacuna a base de plantas es fácil de manipular, ya que no requiere un almacenamiento complicado y su producción es rentable y fácil de ampliar para una gran producción, este método puede proporcionar una alternativa más barata para la producción de vacunas [5, 7-10]. Además, las vacunas comestibles a base de plantas producidas mediante este método pueden proporcionar una vía de administración sin agujas, conveniente y fácil [9-11]. Entre las plantas que se han utilizado comúnmente como biorreactores se encuentran el tabaco, la patata, el tomate, el maíz y el arroz. Hasta la fecha, hay muchas plantas transgénicas que se han utilizado para producir cuatro tipos diferentes de vacunas: vacunas bacterianas, vacunas virales, vacunas parasitarias y vacunas inmunocontraceptivas [9].

Se han producido varias vacunas a base de plantas, y algunas de ellas se encuentran actualmente en la fase de ensayo clínico. Entre ellos, los tipos más comunes de vacunas son contra virus y bacterias que causan enfermedades mortales en humanos y animales y generalmente Nicotiana las plantas se utilizan como biorreactor. Sin embargo, hasta la fecha, solo se han autorizado dos productos: (a) mAB scFV fabricado en plantas que se utiliza en la producción de una vacuna recombinante contra el VHB en Cuba y (b) vacuna contra el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) para aves de corral aprobada por el Departamento de Agricultura de EE. UU. (USDA) [12]. No existe una vacuna a base de plantas que haya recibido la licencia de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Esto se debe al hecho de que las vacunas de origen vegetal se clasifican en la categoría de cultivos modificados genéticamente [13]. En vista de esta investigación emocionante pero desafiante, la primera parte de este documento se enfoca en las tecnologías de expresión convencionales y refinadas para la producción mejorada de vacunas a base de plantas, mientras que la última parte analiza los desafíos encontrados durante y después del proceso de producción.

2. Producción de vacunas a base de plantas

La producción de vacunas a base de plantas implica principalmente la integración de transgén en las células vegetales. La secuencia diana del antígeno seleccionado se integra con el vector antes de transferirse al sistema de expresión.A continuación, el transgén se puede expresar en las plantas a través de un sistema de transformación estable o mediante un sistema de transformación transitoria, dependiendo de la ubicación en la que se haya insertado el transgén en las células. Se puede lograr un sistema de transformación estable mediante la integración nuclear o plástida [14]. Se denomina estable o permanente debido a los cambios permanentes que se producen en la genética de las células receptoras a medida que el transgén diana se integra en el genoma de las células de la planta huésped [15]. Biolística y genéticamente modificada Agrobacterium cepa puede conducir a la formación de transfección estable. Sin embargo, como Agrobacterium tumefaciens no infecta muchas especies de plantas de forma natural, limita la aplicación de Agrobacterium cepa para la transformación estable del gen deseado. Generalmente, las células vegetales transgénicas de forma estable producen una cantidad menor de antígeno de subunidad, en el intervalo del 0,01 al 0,30% de la proteína vegetal soluble total.

Por otro lado, el sistema de transformación transitoria implica la producción de la proteína o el antígeno deseado poco después de que el gen heterólogo resida transitoriamente en las células huésped [14, 16]. El transgén no se incorpora al genoma de las células vegetales. En este sistema de expresión vegetal, no se requiere la regeneración de toda la planta y la frecuencia de su aparición es mayor. Estas características superan los escollos relacionados con la integración estable [14]. Los dos métodos más comúnmente utilizados que lograrían la expresión transitoria de una proteína deseada en las plantas son el Agrobacterium-transformación mediada por virus de plantas modificados genéticamente y bombardeo de partículas [14].

2.1. Método de entrega directa de genes

Como se mencionó anteriormente, existen varios métodos que se pueden utilizar para producir vacunas a base de plantas. Básicamente, estos métodos se dividen en dos categorías, que son la entrega de genes directa e indirecta [16, 17]. El método de entrega directa de genes significa simplemente la introducción directa de ADN o ARN en las células vegetales [12]. En esta sección, se discutirá más a fondo el enfoque de administración directa de genes más común, el método biolístico.

El método biolístico es un método independiente del vector y también se conoce como método de bombardeo de microproyectiles o pistola de genes [12]. Este es un método alternativo de transferencia de genes para la transformación nuclear si Agrobacterium-la transformación mediada no es factible [6, 18, 19]. Implica el uso de oro o tungsteno como microportador para recubrir el ADN [6, 20]. El ADN recubierto se colocará en la parte superior del macroportador, se insertará en la pistola de genes y se someterá a alta presión de gas helio [6, 20]. Debido a la alta presión, el ADN recubierto viajará a alta velocidad dentro del vacío y penetrará en las células de la planta objetivo [21]. Las ventajas de este método son que forma una integración estable del transgén en el genoma de la planta y se puede aplicar para transferir ADN extraño a una variedad de tipos de especies de plantas hospedadoras, así como a varios tipos de células [14]. No hay ningún requisito de vector para este método y ayudará en la cotransformación [14]. Sin embargo, requiere un costoso dispositivo de pistola de partículas, requiere mucha mano de obra y puede causar graves daños a los tejidos de las plantas [16, 20].

El método biolístico se puede utilizar para lograr dos tipos de expresión de antígenos en las plantas transgénicas: transformación nuclear y de cloroplasto. La transformación nuclear se realiza integrando el gen deseado en el núcleo de las células vegetales mediante recombinación no homóloga [22, 23]. El transgén podría insertarse en el mismo locus o en diferentes loci para crear plantas transgénicas estables [22]. A pesar de que las plantas pueden heredar el transgén a la descendencia, las plantas transgénicas nucleares muestran un bajo nivel de expresión de antígenos lo que lleva al requerimiento de una gran cantidad de material vegetal para producir la dosis correcta de administración y podría causar efectos pleiotrópicos y de posición debido a la integración aleatoria del transgén [23-25].

Una alternativa fascinante a la transformación nuclear con el objetivo de aumentar el rendimiento de la producción de proteínas recombinantes a partir de un solo paso de transformación se conoce como transformación de cloroplasto [6, 17, 26]. La formación de plantas transgénicas de cloroplasto implica el uso de un proceso biolístico, que entregará el ADN deseado en los cloroplastos, seguido de la integración del gen de interés en el genoma del cloroplasto a partir del vector de transformación de plastidios en la secuencia flanqueante mediante recombinación homóloga [18, 26]. Las ventajas de la transformación de cloroplasto frente a la transformación nuclear son la capacidad de eliminar el efecto silenciador de genes, una producción rápida y de bajo costo debido a su alto número de copias en una célula vegetal, su potencial para expresar múltiples genes en plastidios y un trabajo menos técnico, natural. la contención del transgén y garantizar una inserción específica del transgén en el genoma del cloroplasto [6, 17, 25, 27, 28]. Como los plástidos generalmente se heredarán por vía materna a la siguiente descendencia, el flujo de genes a través de la polinización hacia las malezas o parientes silvestres de la planta transgénica en la misma ubicación ambiental se puede prevenir cuando el transgén se inserta y expresa en el genoma del plástido [29]. Sin embargo, como no ocurre ningún proceso de glicosilación en los plástidos, este método no es una opción para la producción de proteínas heterólogas funcionales que requieren una modificación postraduccional compleja.

Entre la transformación nuclear y de cloroplasto, la mayoría de las vacunas de origen vegetal notificadas recientemente se producen mediante transformación de cloroplasto. Algunos ejemplos de vacunas derivadas del cloroplasto para combatir enfermedades bacterianas son el cólera, la enfermedad de Lyme, el ántrax, el tétanos y la peste, mientras que las vacunas para combatir las enfermedades virales son el rotavirus y el parvovirus canino (CPV) [26]. La producción de la mayoría de estas vacunas utilizó tabaco como planta modelo. La subunidad B de la toxina del cólera, Bacillus Anthracis El antígeno protector y los genes del fragmento C de la toxina del tétanos se expresaron utilizando el modelo de tabaco transgénico [30-32]. De manera similar, un péptido protector, a saber, 2L21, que previene a los perros de la infección por CPV, también se expresó con éxito en el modelo de tabaco [33]. Algunas vacunas derivadas de plantas también se probaron en modelos animales para validar su eficacia. Por ejemplo, los resultados mostraron que los ratones inmunizados con la vacuna contra el ántrax derivada del cloroplasto sobrevivieron al desafío con la toxina del ántrax [34], mientras que la inmunización de las mucosas de los ratones con la vacuna contra el tétanos derivada del cloroplasto aumentó los anticuerpos contra el tétanos en el cuerpo, lo que indica el uso seguro de la vacuna aplicada por vía nasal u oral [32].

Además del modelo del tabaco, se ha informado de la producción de dos vacunas a base de plantas contra los virus del dengue y la rabia en Lactuca sativa (lechuga) y Zea mays, respectivamente, a través del método biolístico. La vacuna contra el virus del dengue dirigida a la poliproteína del serotipo del dengue-3 (DENV3prM / E) se produjo en Lactuca sativa mediante transformación de cloroplasto [35]. Los resultados mostraron que L. sativa expresó la poliproteína del antígeno en diferentes formas como monómeros, heterodímeros o multímeros en Western blot. La planta creció normalmente y los transgenes fueron heredados por la siguiente progenie sin segregación. En otro ejemplo, la vacuna contra la rabia se produjo en Zea mays mediante el cual el callo embriogénico se transformó primero con la construcción pregenerada con un promotor constitutivo del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) por biolística, y las plantas regeneradas se cultivaron en un invernadero [36]. Entonces, el transgénico Zea mays que expresa la glicoproteína del virus de la rabia se administró a ratones por vía oral. Los resultados mostraron que el tratamiento protegió a los animales de la exposición al virus de la rabia, confiriendo el efecto beneficioso de la vacuna a base de plantas como un potente inmunógeno oral.

Con base en las evidencias actuales, la expresión de antígenos a través de la transformación de cloroplasto confiere varios beneficios. En primer lugar, los genes introducidos se heredaron de forma estable en las generaciones posteriores, lo que garantiza el suministro continuo de la fuente [30]. Además, un alto rendimiento de antígenos en los cloroplastos disminuiría la cantidad de material vegetal necesario para la vacunación, y esto facilitaría la encapsulación del material liofilizado o la formación de píldoras [33]. Aunque la producción de vacunas a base de plantas a partir de la transformación de cloroplasto se ha identificado como un método alternativo para superar la debilidad de la transformación nuclear, es necesario realizar más estudios. Esto se debe al hecho de que el método de transformación de cloroplasto aún no se ha aplicado en muchas especies de plantas además de la planta de tabaco. Además, es difícil crear plantas que tengan plástidos transformados uniformemente (homoplásmicos). Debido a la limitación posterior, se dificulta la generación de plantas transplastómicas que son genéticamente estables.

2.2. Métodos indirectos de entrega de genes

A pesar de utilizar el método de administración directa de genes, los métodos de administración indirecta de genes muestran una eficacia más significativa en la producción de vacunas, ya que la administración indirecta de genes implica la utilización de bacterias vegetales, particularmente las Agrobacterium especies y virus vegetales, que infectan naturalmente las células vegetales y son capaces de integrar el gen de interés en el genoma vegetal [16].

2.2.1. Agrobacterium-Transferencia genética mediada

Agrobacterium es una bacteria gramnegativa patógena del suelo que naturalmente infectará las plantas y transferirá sus genes (T-DNA) al núcleo de las células vegetales [17, 19]. Dos cepas de Agrobacterium Las especies que se han utilizado comúnmente como vector biológico son Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) y Agrobacterium rhizogenes (A. rhizogenes). La principal diferencia entre estas dos especies es el plásmido que llevan. A. tumefaciens lleva plásmido inductor de tumores (plásmido Ti), mientras que A. rhizogenes lleva plásmido inductor de raíces (plásmido Ri) [18, 37]. Sin embargo, A. tumefaciens es la cepa más preferida por los investigadores para la expresión estable de la proteína deseada. En el plásmido Ti, hay genes que codifican hormonas vegetales, como la síntesis de auxinas y citoquininas, que inducen tejido tumoral en las plantas. Sin embargo, para la producción de vacunas, estos genes se eliminarán para formar un plásmido Ti desarmado y se insertará un gen heterólogo formando un vector plasmídico recombinante [37]. El vector plasmídico recombinante se transforma en A. tumefaciens y con la ayuda de vir gen de la bacteria, el gen heterólogo introducido es transferido por la bacteria transformada y se integra en el ADN genómico nuclear de la planta huésped mediante recombinación no homóloga en sitios aleatorios [17, 19, 37]. Las bacterias transformadas se transfieren a las hojas de la planta empapando las hojas en el A. tumefaciens cultura. Este método es capaz de producir una integración estable del transgén en el genoma de la planta [33, 38].

Muchas investigaciones realizadas antes de 2000 y principios de 2000 produjeron varias vacunas a través de Agrobacterium-sistema de transformación mediado en modelos de plantas dicotiledóneas. Por ejemplo, Arakawa et al. gen expresado con éxito que codifica para la proteína de la subunidad B de la toxina del cólera en explantes de hojas de papa utilizando A. tumefaciens [39]. De manera similar, la papa ha sido transformada para producir proteína VP60 contra el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo, en la cual los conejos inmunizados con el extracto de hoja de papa mostraron mayores títulos de anticuerpos anti-VP60 y estaban protegidos contra la enfermedad hemorrágica [40]. Estos descubrimientos han llevado a la producción de antígenos más diversos en varias especies de cultivos. Helicobacter pylori La proteína TonB se expresó en transgénicos Arabidopsis thaliana a través de este método [41]. El antígeno producido era reconocible por el antisuero anti-TonB de conejo y adecuado para ser utilizado como vacuna contra Helicobacter Infecciones por administración oral. Además, Li et al. mostró que el gen del antígeno de superficie de la hepatitis B podía introducirse en plantas de tomate mediado por A. tumefaciens [42]. AgrobacteriumLa transformación mediada también se ha utilizado para la producción de antígenos como la enterotoxina termolábil a partir de Escherichia coli, Proteína de la cápside del virus Norwalk, antígeno de superficie de la hepatitis B y alfalfa transgénica que expresan proteínas del virus de la fiebre aftosa mediante el uso del modelo de papa [43].

La mayor parte de los preliminares AgrobacteriumLos estudios de transformación mediada se han centrado en plantas de dicotiledóneas. Sin embargo, según informes recientes, este método no se limita solo a las plantas de dicotiledóneas. Yoshida y col. han introducido con éxito el Aβ42 en arroz usando el Agrobacterium método [44]. Cuando este arroz integral transgénico que expresa Aβ se administró por vía oral a ratones, su suero anti-Aβ los títulos de anticuerpos estaban elevados [44]. Además, se indujeron niveles similares de anticuerpos IgG sistémicos e IgA mucosos específicos de CTB con actividad neutralizadora de toxinas en ratones y macacos inmunizados oralmente con la vacuna oral de la subunidad B de la toxina del cólera a base de arroz, MucoRice-CTB / Q o MucoRice-CTB / N producido a través de Agrobacterium-método mediado [45].

Generalmente, este método permite insertar un gran fragmento de ADN extraño en el plásmido Ti de A. tumefaciens. También es un método de transferencia de genes simple y rentable con mayores eficiencias [20, 22]. Por el contrario, este método se considera un proceso bastante lento y produce un bajo rendimiento [20]. El rendimiento de la proteína deseada es bajo debido a la limitación durante la transferencia de la bacteria transformada a los tejidos vegetales. El método de remojo creará el "efecto de posición", en el que solo las capas de células ubicadas en el borde de los explantes recibirán el transgén y no las células completas de los explantes [16]. Por lo tanto, los investigadores han estado refinando este sistema de expresión incorporando varios enfoques posibles para mejorar la producción de vacunas a base de plantas. Entre ellos se encuentra la incorporación de dos enfoques de agroinfiltración: agroinfiltración con jeringa y agroinfiltración al vacío en la Agrobacterium-sistema de transformación mediado.

En un esfuerzo por superar los problemas relacionados con la expresión estable del transgén, los investigadores también utilizan el método de agroinfiltración para insertar el gen deseado en células vegetales. La agroinfiltración es un método que implica la infiltración de A. tumefaciens suspensión en los espacios intracelulares de las partes deseadas de las plantas mediante el uso de una jeringa y da como resultado la expresión transitoria de la proteína o transgén deseados [46, 47]. Puede mejorar el nivel de expresión de la proteína antigénica en las células vegetales [48]. Hay dos métodos de agroinfiltración, que son la infiltración con jeringa y la infiltración al vacío. La infiltración con jeringa es el método más simple en el que, mediante el uso de una jeringa sin aguja, el transformado A. tumefaciens se inyecta en la hoja. Sin embargo, la creación de una pequeña muesca mediante el uso de una aguja debe realizarse antes de eso y el investigador debe asegurarse de que no atraviese ambos lados de la hoja. Las ventajas que ofrece este método son múltiples construcciones transgénicas que pueden introducirse en diferentes partes de una sola hoja y pueden utilizarse para una variedad de aplicaciones de producción de proteínas recombinantes [16]. A pesar de eso, este método permite un análisis rápido y rentable a nivel de expresión transgénica ya que los procedimientos involucrados son relativamente simples y no requieren instrumentos sofisticados [16, 49, 50]. Además de eso, la agroinfiltración se puede aplicar a muchas especies de plantas después de que se hayan optimizado los protocolos [50].

Otro método de agroinfiltración es la infiltración al vacío que consiste en sumergir las hojas en el tampón de infiltración que contiene transgénicos. A. tumefaciens. Se somete una presión atmosférica negativa a las hojas sumergidas en la cámara de vacío con el objetivo de retirar el aire presente en los espacios intersticiales de las hojas y ocupar el espacio con el transformado. A. tumefaciens [51]. En comparación con la infiltración con jeringa, este método es más complicado ya que existe la necesidad de un equipo de vacío y reduce la flexibilidad en la introducción de múltiples transgenes en una sola hoja. Sin embargo, beneficia la producción de proteína recombinante a través del proceso de producción escalable así como la robustez y rapidez de este método para infiltrar un gran número de plantas con Agrobacterium [51]. Agrobacterium tumefaciens También se ha utilizado para administrar los vectores virales "deconstruidos" a las células de lechuga y se descubrió que la agroinfiltración con vectores replicones geminivirales puede producir un alto nivel de partículas similares a virus (VLP) derivadas de la proteína de la cápside del virus Norwalk (NVCP) y mAbs terapéuticos contra los virus del Ébola (EBV) o del Nilo Occidental (WNV) en la lechuga [51]. Chen y col. Además, concluyó que la lechuga es un excelente huésped para la agroinfiltración con vectores virales deconstruidos [51].

La Tabla 1 resume algunas de las plantas hospedadoras, así como los métodos de transformación utilizados para producir las vacunas a base de plantas para enfermedades humanas y animales.

2.2.2. Virus de plantas genéticamente modificado

En este método, se modifica un virus vegetal adecuado para crear un gen quimérico para la proteína de la cubierta viral. Por lo tanto, actúa como un vector para llevar material genético a las células vegetales [6, 38]. Este método da como resultado una expresión transitoria de antígeno en plantas [6, 38]. El virus recombinante expresará la proteína o el péptido deseado como un subproducto de la actividad de replicación viral durante la infección viral en las plantas [28, 38]. Además, la síntesis y acumulación de epítopos de la vacuna se puede lograr modificando las proteínas de la cápside viral [38]. Varias ventajas de la infección mediada por virus de plantas incluyen un alto nivel de expresión de proteínas recombinantes en un corto período de tiempo después de la infección, la facilidad para generar múltiples copias de antígenos en la superficie de la partícula viral y permitir infecciones virales a gran escala en plantas [6, 9, 28, 38]. Sin embargo, los productos de la replicación viral deben purificarse primero de las plantas infectadas antes de ser utilizados para la vacunación [38]. Este método de producción también provocará la muerte de las plantas después de la infección. Por lo tanto, una vez que se ha recolectado la vacuna, es necesario infectar otra planta con el virus recombinante y este procedimiento de reinfección debe realizarse repetidamente para la producción continua de la vacuna [38].

En el desarrollo anterior, el sistema de expresión de virus de plantas involucra principalmente los virus de ARN diseñados como el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus X de la papa (PVX), el virus del mosaico de la alfalfa (AIMV), el virus del mosaico del pepino (CMV) y el virus del mosaico del caupí ( CPMV) como vector de expresión [52]. No se sabe que estos virus se repliquen en células de mamíferos, por lo que actúan como vectores vacunales de replicación alternativos excelentes para el desarrollo de vacunas tanto humanas como veterinarias. Además, la mayoría de los sistemas de expresión han demostrado que los antígenos de la vacuna producidos protegen contra la infección por desafío. Por ejemplo, el CPMV modificado se utilizó para infectar Vigna unguiculata en la producción de algunos antígenos, incluida la proteína de la cápside VP2 del virus de la enteritis del visón (MEV), la proteína de la cápside VP2 del parvovirus canino, Pseudomonas aeruginosa proteína F de la membrana externa, y Staphylococcus aureus Dominio D2 de la proteína de unión a fibronectina. Se ha demostrado que la inyección subcutánea del CPMV quimérico que expresa el antígeno del virus de la enteritis protege a los visones frente al desafío con MEV virulento [53].

El TMV también se ha utilizado para producir varios antígenos en un modelo vegetal. Se propagaron híbridos de TMV que contenían el epítopo del virus de la hepatitis murina (MHV) en plantas de tabaco, seguido de la purificación de las partículas del virus. Los ratones inmunizados con los virus híbridos purificados desarrollaron IgG e IgA séricas específicas para el epítopo y la proteína de la cubierta de TMV. En el estudio, se encontró que el inmunógeno administrado y la protección contra la infección por MHV tenían una correlación positiva [54]. El vector basado en TMV también expresó epítopos del virus de la fiebre aftosa (FMDV) en el tabaco y se utilizaron cobayas, ratones y cerdos para evaluar los efectos protectores del virus recombinante. La mayoría de los animales estaban protegidos contra la exposición al virus de la fiebre aftosa [55]. Pseudomonas aeruginosa La proteína F de la membrana externa también se expresó en tabaco usando TMV. La vacuna quimérica producida ofreció inmunoprotección contra la infección pulmonar crónica por Pseudomonas aeruginosa en un modelo de ratón [56]. Hasta la fecha, cada vez son más los virus de ARN, que también incluyen el virus del mosaico de la papaya (PapMV), el virus del mosaico del bambú (BaMV), el virus del achaparramiento del tomate (TBSV), la viruela de la ciruela y Potyvirus se han añadido a la lista de vectores de expresión utilizados en la producción de vacunas a base de plantas [57].

Con los avances en la biología molecular de los virus de las plantas, los virus de ADN, como los geminivirus, se han desarrollado aún más como uno de los sistemas de expresión de las plantas de última generación [58]. Los geminivirus tienen un pequeño genoma de ADN monocatenario que se replica en el núcleo de las células huésped mediante un mecanismo de replicación en círculo rodante que utiliza un intermedio de ADN bicatenario [59]. Se han construido vectores geminivirales basados ​​en el virus de la enana amarilla del frijol para expresar su proteína iniciadora de la replicación (Rep) para producir una vacuna contra la enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) [60]. En otro ejemplo, se utilizó el sistema de replicón geminiviral para producir un complejo inmune del Ébola (EIC) en hojas de Nicotiana benthamiana. La inmunización subcutánea de ratones BALB / C con EIC purificado dio como resultado la producción de anticuerpos contra el virus del Ébola a niveles comparables a los obtenidos con partículas similares al virus de la glicoproteína del Ébola (GP1) [59]. Además de los dos ejemplos anteriores, el virus de la cabeza rizada de la remolacha (BCTV) y el virus de la enana amarilla del tabaco (TYDV) son los otros vectores de geminivirus que se han utilizado en la producción de diversas vacunas y proteínas terapéuticas como SEB, virus Norwalk VLP, HBVcAg, Proteína Mab del WNVE, proteína HPV-1L1, p24 del VIH-1 tipo C, VP1 del VHA y vitronectina [58].

3. Métodos para aumentar la eficiencia de la entrega de genes

Se pueden aplicar métodos adicionales en la producción de algunas vacunas con el objetivo de mejorar la eficiencia de la entrega de transgenes en los tejidos de la planta huésped. Estos son mediante el uso de estimulantes químicos y sonicación.

3.1. Captación de ADN por estimulación química

Un estimulante químico muy conocido que los investigadores han utilizado para acelerar la absorción de ADN por los protoplastos de las plantas es el polietilenglicol (PEG). El PEG actúa precipitando macromoléculas iónicas (en este caso el ADN), promoviendo la captación del ADN por los protoplastos por endocitosis y permitiendo la expresión transitoria de los genes deseados [70]. La eficacia de la transformación génica mediada por PEG para mejorar la captación de ADN por los protoplastos depende de varios factores, como la concentración de PEG, el período de inoculación y la cantidad de plásmidos [70-72]. Las ventajas de este método son las siguientes: (a) se puede incorporar con otros métodos de administración de genes para mejorar su eficiencia, (b) no causará daño al protoplasto, y (c) este método es rentable ya que existe no se requieren equipos técnicos costosos y no se requiere mucha adaptación para diferentes protoplastos [70]. Sin embargo, puede ser muy difícil de realizar ya que se requiere experiencia para llevar a cabo los procedimientos y la transformación exitosa depende en gran medida del genotipo de los protoplastos [73]. Además, el PEG también puede ser tóxico para los protoplastos y producir una baja tasa de supervivencia y una cesación de la división celular [71]. Debido a la complejidad de este método, la transformación de PEG no se ha utilizado ampliamente en la producción de vacunas a base de plantas. Sin embargo, al generar tabaco transplastómico que expresa un antígeno proteico de 25 kda contra Mycobacterium leprae y Mycobacterium avium, Hassan y col. transformó con éxito el mmpI junto con un adyuvante de linfotoxina-beta (LTB) en cloroplasto de tabaco mediante el método de transformación mediado por polietilenglicol (PEG) [74].

3.2. Sonicación

La sonicación es una técnica que utiliza ondas sonoras para agitar partículas en solución y, con el objetivo de mezclar la solución, aumentar la velocidad de disolución y eliminar los gases disueltos del líquido. En la transformación de plantas, la sonicación provocará la formación de microondas en el tejido de la planta y mejorará la entrega de ADN desnudo al protoplasto de la planta [75]. Sin embargo, se ha informado que la sonicación por sí sola no es un método preferible para la entrega de genes en la soja y los frijoles, ya que causa más efectos negativos en las células vegetales y da como resultado una baja eficiencia de transformación [75, 76]. En muchos estudios, la sonicación ayudó AgrobacteriumLa transformación mediada (SAAT) se utilizaría para inducir la alteración mecánica y la formación de heridas en las células vegetales mediante ondas ultrasónicas [77]. Las células heridas permitirán entonces la penetración de Agrobacterium en la parte más profunda de los tejidos vegetales, aumentando así la probabilidad de que las células vegetales se infecten [76]. Siendo un método muy fácil, de bajo costo y significativo para mejorar AgrobacteriumLa transferencia de genes mediada son los beneficios del método SAAT. Aparte de la aplicación exitosa de SAAT en la transformación de Chenopodium rubrum L. [78] y Beta vulgaris L. [79], este enfoque también se ha aplicado en la producción de recombinantes Escherichia coli holotoxina termolábil de tipo salvaje y Escherichia coli adyuvantes de vacunas LT mutantes en Nicotiana tabacum, en el que los títulos de IgG específicos de LT-B sistémicos más altos se detectaron en aves [80].

Recientemente, otro enfoque llamado la combinación de sonicación más infiltración por vacío asistida Agrobacterium-la transformación mediada había evolucionado para optimizar la eficiencia de Agrobacteriumtransferencia genética mediada [76]. Este enfoque ha transformado con éxito la Fraxinus pennsylvanica hipocótilos para albergar el vector binario pq35GR que contiene la neomicina fosfato transferasa (nptII) y β-gen de fusión de glucuronidasa (GUS) y un gen de proteína fluorescente verde mejorado [81]. Sin embargo, la aplicación de este enfoque combinado todavía es escasa y permanece en la etapa de desarrollo en la investigación de vacunas a base de plantas.

4. Desafíos de las vacunas a base de plantas

Aunque muchas vacunas de origen vegetal que se han producido todavía se encuentran en ensayos clínicos de fase 1, algunas vacunas han avanzado o han completado los ensayos de fase II y III [82]. Estas terapias se produjeron en varias plantas transgénicas como insulina en cártamo transgénico (SemBioSys), factor de crecimiento en cebada transgénica (ORF Genetics), taliglucerasa alfa en zanahoria transgénica (Protalix BioTherapeutics), vacuna contra la influenza aviar en tabaco transgénico (Medicago) y Ébola. Vacuna en tabaco transgénico (Mapp Biopharmaceutical) [82, 83]. Sin embargo, hasta el día de hoy, no existe ninguna vacuna vegetal que haya sido aprobada para su comercialización para el consumo humano. Por lo tanto, vale la pena señalar que, aunque la producción de vacunas a base de plantas se inició casi dos décadas desde 1989 [77], aún deben superarse algunos desafíos para convertirlas en vacunas de alta eficacia. Los problemas que deben abordarse podrían comenzar desde los procesos iniciales hasta la implementación de las vacunas. En general, tres desafíos principales son la selección del hospedador de expresión de antígeno y de la planta, la consistencia de la dosis y la fabricación de vacunas de acuerdo con los procedimientos de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

4.1. Selección del hospedador de expresión de antígenos y plantas

La primera cuestión es la selección de un antígeno y el huésped adecuado para la expresión de la planta [25, 37]. Esta etapa es muy importante en el desarrollo de una vacuna que sea capaz de cumplir con todos los requisitos necesarios porque no todos los antígenos son compatibles con las plantas hospedadoras seleccionadas [37]. La selección adecuada y cuidadosa no solo ayudará a determinar la seguridad de la vacuna producida, sino que también se puede utilizar para producir una vacuna termoestable [37]. Mientras tanto, la identificación de candidatos a antígenos de patógenos pobremente caracterizados con características prometedoras puede realizarse aplicando enfoques genómicos o proteómicos [23].

4.2. Consistencia de la dosis

La consistencia de la dosificación es otro desafío al que se enfrentan los investigadores ya que la dosificación producida puede variar dentro de las plantas de la misma especie, de fruto a fruto y de generación en generación debido al tamaño y madurez de los frutos o plantas [18, 37 ]. Las plantas transgénicas muestran una variabilidad intrínseca en la expresión del antígeno debido a la posición y los efectos pleiotrópicos causados ​​por la integración inespecífica del transgén en el genoma de la planta huésped [25]. Además de eso, también es bastante difícil evaluar la dosis requerida para cada paciente. Los niveles de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas generadas en diferentes individuos pueden variar según los tipos de antígenos expuestos en el cuerpo. Entre dos pacientes con diferente peso corporal y su edad, la dosis de vacuna a base de plantas requerida será diferente. Si este problema no se controla cuidadosamente, se inducirá una tolerancia inmunológica cuando el paciente sufra una sobredosis, mientras que se producirá una reducción de la producción de anticuerpos cuando se administre una dosis insuficiente al paciente [37]. Además de eso, el silenciamiento génico podría inducirse debido a la acumulación de ARNm en las células vegetales transgénicas a medida que se detiene el crecimiento de las plantas y se reduce la formación de frutos mientras aumenta el contenido de antígeno [84]. En tal caso, el consumo de vacunas a base de plantas puede inducir una reacción alérgica y pocos efectos secundarios, como toxicidad en el sistema nervioso central, enfermedad inducida por citocinas y enfermedades autoinmunes [37].

4.3. Fabricación de vacunas según procedimientos GMP

El objetivo final de las vacunas a base de plantas es producir vacunas transgénicas estables que sean seguras para el consumo y, al mismo tiempo, reduzcan el costo de producción. Además de todos los problemas subyacentes que pueden afectar la eficacia de las vacunas a base de plantas, la directriz reguladora regula por parte del Departamento de Agricultura de los EE. UU. (USDA) y la FDA, especialmente el crecimiento de plantas transgénicas, la producción y purificación de vacunas a base de plantas y todas las fases de Se aplicará estrictamente el ensayo clínico hasta la fase comercializable [63]. Por lo tanto, los fabricantes deben garantizar su responsabilidad de seguir las Buenas Prácticas Agrícolas (BPA) y las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) para que la producción de vacunas de origen vegetal, desde el principio hasta el final, esté estrictamente controlada para la gestión de la calidad.

Generalmente, para producir un producto vegetal que pueda cumplir con el estándar de calidad, las instalaciones de biofabricación deben estar bien equipadas para que se puedan lograr los ciclos completos de procesamiento de las vacunas vegetales. Las instalaciones incluyen equipos para el cultivo, infiltración, recolección de plantas y purificación de proteínas de plantas y bacterias [85]. Takeyama y col. también resumió algunas plantas de BPF que producen diversas vacunas, como el antígeno HA de la influenza, la vacuna de la subunidad de la proteína de la cápside de Norovirus y la vacuna contra el cólera a base de arroz [85]. Al mismo tiempo, Kashima et al. informó que para producir una vacuna vegetal que cumpla con los requisitos reglamentarios gubernamentales, se deben tomar en consideración muchos pasos y precauciones. Durante la producción de una vacuna oral contra el cólera a base de arroz, MucoRice-CTB, la agencia de biofabricación estableció con éxito técnicas específicas para mantener la semilla de MucoRice-CTB. La agencia evaluó más a fondo la propagación de la semilla y las semillas almacenadas se renovaron periódicamente para mantener la buena calidad. Además, el cultivo de la planta mediante un sistema hidropónico cerrado ayuda a minimizar las variaciones en la producción de vacunas. El arroz producido fue pulido, pulverizado y empaquetado para hacer el fármaco MucoRice-CTB. Se debe realizar una verificación final de la identidad, potencia y seguridad del producto MucoRice-CTB y solo se liberarán los productos que cumplan con los requisitos de calidad [86].

Sigue siendo un gran desafío mantener el estándar GMP para el producto en la industria de vacunas a base de plantas. Además del equipo, las instalaciones y el método utilizado para producir la vacuna, otras consideraciones que deben tenerse en cuenta son las establecidas en la guía de BPF publicada por la OMS [87, 88]. La directriz de BPF para productos biológicos establece que son necesarias algunas precauciones particulares para la fabricación, el control y la administración de productos biológicos, ya que los procedimientos y procesos utilizados en la producción generalmente conducen a una gran variación en la calidad de los productos. Por lo tanto, los pasos de precaución deben comenzar desde el principio de los procesos de producción. Sin embargo, el control en proceso también es importante durante la fabricación de los productos biológicos. Se requiere personal capacitado para ejecutar los procesos de producción y, por lo tanto, la agencia de biofabricación debe proporcionar la capacitación necesaria al personal. Los edificios para la producción de vacunas deben diseñarse de manera que las operaciones se puedan llevar a cabo sin problemas. Se requiere un diseño especial para la producción de vacunas vegetales, en el que los lotes de semillas deben almacenarse separados de otros materiales. Se seguirán algunas otras reglas generales de BPF para mantener el estándar de calidad de los productos vacunales. Estos incluyen el hecho de que se deben implementar procedimientos operativos estándar para todas las operaciones de fabricación, todos los productos deben estar claramente etiquetados, los registros de procesamiento y distribución de lotes deben mantenerse adecuadamente, y debe haber garantía y control de calidad para monitorear la calidad del producto.

5. Perspectivas futuras

Aunque existen varios desafíos en la producción y aplicación de vacunas a base de plantas, el desarrollo de una vacuna a base de plantas mejor y ampliamente aceptable entre los investigadores aún permanece intacto. La investigación en la producción de vacunas a base de plantas se ha centrado actualmente en el desarrollo de métodos que pueden aumentar la cantidad de antígeno producido en las plantas transgénicas, mejorando así una respuesta inmune significativa. La primera estrategia que se puede aplicar para aumentar la cantidad de antígeno en los tejidos vegetales transgénicos es optimizar la secuencia de codificación de genes bacterianos o virales para que la expresión sea similar a los genes nucleares de plantas [1]. También es importante determinar el compartimento subcelular adecuado en las células vegetales que puede producir una cantidad y calidad óptimas de antígeno.

Además de eso, la fusión de genes que codifican la proteína antigénica con proteínas inmunomoduladoras (adyuvantes de la mucosa) se puede llevar a cabo de manera más extensa ya que se ha demostrado que este enfoque tiene el potencial de aumentar la inmunogenicidad en el antígeno deseado. Los ejemplos de adyuvantes de la mucosa son enterotoxinas bacterianas (subunidad B de la toxina del cólera, CTB), metabolitos secundarios derivados de inmunomoduladores vegetales y de mamíferos y bacterias [89]. Se ha comprobado que esta técnica previene la enfermedad diarreica causada por la toxina del cólera. A través de este método, se inicia el desarrollo de vacunas multicomponente. Se ha demostrado que la fusión de CTB con una proteína enterotoxina de rotavirus y E. coli proteína de adhesión ha proporcionado defensa contra el cólera, rotavirus y enterotoxigenic E. coli a través de la producción de vacuna de subunidad tricomponente en la papa transgénica [89].

Aparte del desarrollo de métodos para aumentar la inmunogenicidad de las vacunas a base de plantas, se anticipan más estudios para superar el problema relacionado con la variabilidad de la dosis en las plantas transgénicas. Esto sigue los descubrimientos de Rigano y sus colegas, quienes demostraron que algunas técnicas de procesamiento de alimentos (procesamiento por lotes y liofilización) podrían mantener la conformación normal y la antigenicidad nativa del material en plantas transgénicas, como tomate, papa y Arabidopsis [25], estandarizando así la concentración de antígenos en las plantas.

6. Observaciones finales

Las vacunas a base de plantas son el tipo emergente de vacunas que tienen un valor terapéutico más alto para tratar muchas enfermedades humanas y animales. Puede obtenerse una expresión génica estable y transitoria basándose en los métodos de administración de genes usados. Con mucho, la transformación de cloroplasto a través del método de suministro de genes de bombardeo biolístico o de partículas se ha considerado una alternativa muy prometedora para una mejor producción de vacunas a base de plantas. No obstante, se continuará desarrollando y mejorando los métodos adecuados de administración de genes para una producción de vacunas óptima y eficaz. También existen algunos problemas bioéticos que surgen de la producción de vacunas a base de plantas, como el riesgo de transferir alérgenos de plantas transgénicas a humanos y animales. Como algunas de las vacunas a base de plantas utilizan bacterias y virus como vectores, los patógenos pueden reactivarse e infectar a otros organismos que los consumen. Los beneficios y ventajas de las vacunas a base de plantas podrán superar los desafíos que enfrenta este interesante producto biológico. Por lo tanto, se prevé que la aprobación regulatoria se otorgará en última instancia para ayudar en el control mundial de enfermedades.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Expresiones de gratitud

El estudio está financiado por el Ministerio de Educación Superior de Malasia, en el marco del Programa de subvenciones para investigación exploratoria (ERGS) [ERGS / 1/2012 / SKK10 / IMU / 03/4].

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Derechos de autor

Copyright & # xa9 2016 Erna Laere et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Modificaciones del método

Varias técnicas y procedimientos nuevos han hecho que la toma de huellas dactilares de ADN sea eficiente y confiable. Los nuevos avances en la tecnología han hecho posible extraer ADN de fuentes diminutas y producir resultados con alta precisión. Algunos de estos se enumeran a continuación:

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Es una técnica que ayuda a sintetizar millones de copias de una región / fragmento específico de una secuencia de ADN. Esta técnica es útil cuando hay poca cantidad de ADN disponible para estudio o investigación. Implica desnaturalizar la cadena de ADN y luego recocerla a temperaturas específicas. Las ADN polimerasas se utilizan para añadir dNTP (desoxirribonucleótidos) en el extremo 3 & # 8242 del ADN para sintetizar una nueva secuencia complementaria. La modificación de la técnica de PCR como RAPD-PCR, AFLP-PCR ayuda a obtener resultados mejores y precisos con errores mínimos.

STR (repeticiones cortas en tándem) y SSR (repeticiones de secuencia simple) son secuencias largas repetidas de 2-6 pares de bases. Estos son únicos para cada individuo y son más cortos que los VNTR. Por lo tanto, producen huellas dactilares de ADN precisas.

Los procesos anteriores se repiten varias veces, hasta que se obtiene una clasificación detallada y, por lo tanto, es posible distinguir entre varios elementos y su estudio. Las etapas intermedias pueden variar en los métodos o productos químicos utilizados, pero el principio sigue siendo prácticamente el mismo, lo que da como resultado la finalización del proceso. Para comprender el proceso en detalle, se puede acercarse a un laboratorio certificado, donde se realizan las pruebas de ADN.

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FUTURAS APLICACIONES DE LA EDICIÓN DE GENOMAS

De las tecnologías emergentes de ingeniería genética revisadas anteriormente, la edición del genoma es la más cercana a ser utilizada para modificar cultivos disponibles comercialmente. Un componente clave de la aplicación eficaz y eficiente de la edición del genoma es comprender las bases bioquímicas, moleculares y fisiológicas de los rasgos agronómicos como la arquitectura de la planta, la fotosíntesis, la resistencia a patógenos y la tolerancia al estrés. Dados los avances en el conocimiento, surgirán objetivos adicionales de edición del genoma, y ​​probablemente involucrarán la manipulación de múltiples genes (ver Capítulo 8). El comité también espera avances en la capacidad de editar genes de plantas con precisión, es decir, realizar cambios precisos en genes específicos sin alterar otros genes. Estos avances a menudo provienen de la investigación básica, cuyas aplicaciones de gran alcance no se anticipan. Por ejemplo, TALENs resultó de un estudio de cómo algunas plantas patógenas Xanthomonas las especies modifican la expresión génica en las células de la planta huésped. El sistema CRISPR / Cas9 resultó del sorprendente descubrimiento de que algunas bacterias tienen un "sistema inmunológico" adaptable para resistir la infección por virus. Los sistemas TALEN y CRISPR / Cas9 marcaron el comienzo de rápidos avances no solo en la facilidad sino también en la gama de posibilidades de edición del genoma. En esta sección, el comité ofrece una descripción general de algunas de las aplicaciones esperadas de esta tecnología de transformación.

Eliminación de reactivos de edición del genoma en cultivos modificados genéticamente

Se prevé que la edición del genoma será útil en la mayoría de los cultivos agrícolas para generar alelos modificados que sean homocigotos en la línea modificada por varias razones: para evitar la segregación del alelo alterado en la progenie derivada, para eliminar la producción del ARNm diana de tipo salvaje y proteína, y para aumentar la dosis del alelo modificado ya que el nivel de transcripción de un gen se correlaciona con el número de alelos. Como se describió anteriormente, la edición del genoma sin ADN a través de CRISPR es posible (Woo et al., 2015). Con los reactivos TALEN y CRISPR / Cas9, se pueden generar mutaciones tanto heterocigotas como homocigotas en la primera generación transformada. Se pueden realizar cribados de biología molecular simples para identificar individuos homocigotos para el alelo modificado. Alternativamente, para especies autocompatibles que se reproducen sexualmente, las plantas transformadas heterocigotas individuales pueden cruzarse con su propio polen y la progenie homocigótica identificada en la segunda generación transformada. Una consideración importante al generar algunas plantas editadas con el genoma es asegurarse de que el reactivo (TALEN, Cas9) no esté presente en la progenie seleccionada. Se pueden generar mutaciones adicionales si los reactivos permanecen activos. En algunas situaciones, es deseable la presencia continua del reactivo. Por ejemplo, los reactivos de edición retenidos pueden actuar como un mutágeno constante y generar varios alelos modificados.

si están presentes suficientes miembros de la familia de genes que podrían ser sustratos para los reactivos. Sin embargo, eso podría no ser deseable en una situación agronómica, ya que la estabilidad del material genético es esencial para la producción comercial. Otro ejemplo en el que es necesaria la presencia continua del reactivo son las aplicaciones de impulso genético.

Gene Drive

En poblaciones naturales, los reactivos de edición del genoma se pueden usar para crear un sistema de impulso genético, en el que se altera la frecuencia de un alelo específico en la población, lo que afecta la probabilidad de que se herede el alelo deseado. Se puede crear un sistema de impulso genético reteniendo los reactivos de edición del genoma en el organismo transgénico para permitir la edición continua de los alelos diana en toda la población cuando los reactivos se incorporan a la línea germinal y se transmiten a otros miembros de la población a través de la reproducción sexual. El uso de CRISPR / Cas9 para crear dicho sistema de edición del genoma se ha denominado reacción en cadena mutagénica (Gantz y Bier, 2015). El impulso genético tiene aplicaciones en el control de plagas de insectos, como mosquitos, y diversas plagas en cultivos (Esvelt et al, 2014). La creación inadvertida de un sistema impulsor de genes CRISPR / Cas9 puede evitarse asegurándose de que las construcciones génicas que codifican los dos casetes 5 para Cas9 y los ARN guía no estén presentes en la planta transgénica que se desarrolla. Hay muchas formas de garantizar esto (Akbari et al., 2015). Una forma es separar genéticamente las construcciones después de que se produzca la edición. Otra forma es emplear la edición del genoma sin ADN o sin transgén (Woo et al., 2015) en la que solo se introducen proteínas y ARN en la planta para lograr la edición de genes.

Rasgos que involucran ganancia versus pérdida de función

La mayoría de los cultivos transgénicos comercializados tienen características de ganancia de función, como resistencia a herbicidas o resistencia a insectos. Solo recientemente se han preparado para la venta comercial los rasgos de pérdida de función en cultivos transgénicos. Un ejemplo es la manzana que no se broncea (véanse los capítulos 3 y 8). El Capítulo 8 describe una serie de características complejas que estaban en la etapa de investigación cuando el comité estaba escribiendo su informe, muchas de ellas (como la eficiencia en el uso del agua, la fijación de nitrógeno y la eficiencia mejorada de la fijación de carbono) exhiben una ganancia de función, o tal vez una combinación de ganancia de función con pérdida de función, y probablemente implicará la introducción de múltiples genes (Cuadro 7-2).

Dado el tiempo y los gastos asociados con el proceso regulatorio, las limitaciones de propiedad intelectual y la cautela del consumidor (ver Capítulo 6),

5 Un casete es una molécula de ADN que contiene varios genes que funcionan colectivamente en un solo proceso.

RECUADRO 7-2Trigo resistente a enfermedades mediante la edición del genoma

Pan de trigo (Triticum aestivum) es un poliploide y contiene tres genomas distintos, que se denominan A, B y D. En cada uno de los tres genomas, un solo gen dominante (TaMLO-A1, TaMLO-B1, o TaMLO-D1) confiere susceptibilidad al patógeno fúngico del mildiú polvoriento Blumeria graminis F. sp. tritici. En cebadaHordeum vulgare), un pariente cercano del trigo harinero, el alelo recesivo del locus ortólogo (Hvmlo) confiere resistencia al patógeno del mildiú polvoroso de la cebada (B & uumlschges et al., 1997). Mediante el uso de un par de TALEN diseñados para apuntar a los tres loci MLO de trigo, se detectaron eventos NHEJ en cada locus MLO que resultaron en mutaciones knockout en los tres loci (Wang et al., 2014 Figura 7-4). En plantas regeneradas en las que los tres loci MLO estaban mutados y eran homocigotos (tamlo-aabbdd), resistencia a B. graminis F. sp. tritici fue observado. Para demostrar si la escisión mediada por TALEN de los loci MLO podría usarse para editar el locus, se cotransformó una molécula donante que codifica la proteína verde fluorescente o una proteína etiquetada con histidina junto con TALEN, lo que resultó en la integración de la molécula donante en el Locus MLO. Este tipo de modificación se denomina & ldquoknock-in. & Rdquo Trabajo preliminar con un único ARN guía CRISPR dirigido a TaMLO-A1 produjo plantas con mutaciones en este locus, lo que indicó la viabilidad de lograr resistencia a las enfermedades en el trigo con dos tecnologías distintas de edición del genoma de nucleasas específicas del sitio.

FIGURA 7-4 Un ejemplo de introducción de un rasgo de ganancia de función a través de dos enfoques de edición del genoma.
FUENTE: Ilustración de C. R. Buell. Imagen de trigo de Wang et al. (2014).
NOTA: A, el genoma poliploide del trigo codifica tres genes MLO dominantes que confieren susceptibilidad al patógeno fúngico del mildiú polvoroso. Se muestran cada uno de los tres loci MLO en cromosomas homólogos, cada uno homocigótico para un locus MLO (MLO-AA, MLO-BB, MLO-DD). Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) dirigidas a los genes MLO se utilizaron para eliminar los tres loci MLO, que luego se autofecundaron para generar líneas de eliminación homocigóticas en los tres loci (mlo-aa, mlo-bb, mlo-dd) . B, el trigo de tipo silvestre es susceptible al patógeno del mildiú polvoroso del trigo, pero el nocaut triple mlo es resistente.

algunas empresas y organizaciones buscan desarrollar los rasgos deseados sin enfoques de ingeniería genética. Los rasgos de pérdida de función, particularmente si solo un gen tiene que ser desactivado, se pueden obtener fácilmente con el enfoque de mutagénesis sin GE porque es más probable que los cambios aleatorios en la secuencia de ADN alteren la función de la proteína que mejoren. En el otro extremo del espectro, los rasgos que requieren la introducción de genes nuevos, o quizás la redirección compleja de la expresión génica a diferentes tipos de tejidos o células, pueden lograrse solo con enfoques de ingeniería genética.

Considere el siguiente ejemplo teórico que tiene como objetivo reducir la concentración de un compuesto tóxico en las hojas de una planta de cultivo potencialmente nueva. Todo el germoplasma disponible de la planta contiene el compuesto tóxico en concentraciones inaceptables. Los estudios de prueba de concepto podrían explorar primero la eficacia de regular a la baja el gen objetivo responsable de la síntesis del compuesto tóxico mediante el uso de ARNi o eliminándolo a través de CRISPR / Cas 9 o TALEN. Una vez que se identifica el objetivo, se podría aplicar un enfoque que no implique la ingeniería genética, como apuntar a las lesiones locales inducidas en los genomas (TILLING). TILLING se basa en la mutagénesis química inicial de una población de plantas seguida de la identificación molecular del alelo mutante requerido y luego se cruza para obtener plantas homocigóticas en ese alelo (Henikoff et al., 2004). No requiere que la planta objetivo sea transformable genéticamente. Aunque el establecimiento de la población TILLING mutante inicial es costoso y la fijación del alelo requerido puede ser compleja en especies de cruzamiento exterior poliploide, el enfoque puede ser rentable si se buscan múltiples rasgos en la misma especie. Las poblaciones de labranza han estado disponibles durante varios años para muchos cultivos y especies modelo (Perry et al., 2003 Comis, 2005 Weil, 2009) y se están utilizando en biotecnología agrícola (Comis, 2005 Slade y Knauf, 2005). Sin embargo, no está claro que los rasgos producidos por TILLING supongan un riesgo menor de efectos no deseados para el medio ambiente o la seguridad alimentaria que los introducidos por los enfoques de ingeniería genética, como el ARNi y la edición del genoma. La mutagénesis química utilizada en TILLING introduce mutaciones aleatorias en el genoma de la planta, aunque la mayoría de las mutaciones pueden eliminarse mediante retrocruzamiento en la mayoría de las especies de cultivos, la planta de cultivo modificada resultante podría tener más cambios desconocidos que el mismo cambio en el gen objetivo de interés provocado. mediante el uso de CRISPR / Cas 9 (aunque la variación somaclonal no será un problema porque TILLING no requiere un paso de cultivo de tejidos).

Existen enfoques tanto de reproducción convencional como de ingeniería genética para la selección de rasgos de ganancia de función, como aumentar la cantidad de un componente beneficioso (por ejemplo, un nutriente o un compuesto farmacéutico útil). Si hay suficiente variación natural en la especie, se puede avanzar en el mejoramiento para una mayor producción mediante el uso de enfoques basados ​​en marcadores o genómicos y el desarrollo de una mejora.

demostró variedad a través de la introgresión asistida por marcadores. Un buen ejemplo de este enfoque es el aumento de la producción del compuesto antipalúdico artemisinina en el ajenjo (Graham et al., 2010). Si la variación natural no está presente, como es el caso de intentar introducir taninos condensados ​​en el follaje para mejorar la calidad del forraje en la alfalfa (Lees, 1992), un enfoque de ingeniería genética puede ser la única opción disponible.Teóricamente, puede ser posible introducir un rasgo de ganancia de función a través de TILLING; de lo contrario, el rasgo puede introducirse mediante la sobreexpresión de una enzima biosintética clave que limita la velocidad o uno o más factores de transcripción reguladores positivos. En el Capítulo 8 se presentan ejemplos de estos enfoques.

Edición de loci de rasgos cuantitativos

No todos los rasgos están gobernados por un solo gen. Muchos rasgos agronómicos son rasgos complejos y están gobernados por múltiples loci genéticos que contribuyen a la variación general en el fenotipo. Los múltiples genes involucrados en rasgos complejos se conocen como loci de rasgos cuantitativos (QTL). Los científicos han identificado una serie de QTL para diversos rasgos agronómicos y de calidad de una amplia gama de especies de cultivos. Sobre la base de las altas tasas de herencia conjunta (ligamiento) con secuencias de ADN específicas, se puede seleccionar una progenie específica de la reproducción convencional para crear combinaciones de QTL que se espera que funcionen bien. Pueden probarse mediante experimentación de campo.

El uso de la selección QTL tiene limitaciones e impedimentos. Primero, para varias especies de cultivos, el retrocruzamiento es difícil o imposible debido a la baja fertilidad sexual, los ciclos prolongados de reproducción, la depresión por endogamia o alguna combinación de los mismos. En segundo lugar, el QTL deseable puede estar estrechamente ligado (heredado) con genes que afectan negativamente a otros rasgos importantes, es decir, "arrastre de enlace mutuo", esto es común entre genes en regiones de cromosomas de baja recombinación y cuando los QTL deseables se encuentran en parientes de cultivos silvestres cuyos genomas son menos propenso a la recombinación con el genoma del cultivo. En tercer lugar, se requiere un esfuerzo considerable para introducir un QTL específico en todas las plantas de interés. Se deben realizar múltiples retrocruces para eliminar los eventos de introgresión no vinculados, lo cual es costoso en términos de poblaciones en crecimiento en el invernadero o en el campo durante varias generaciones. Por lo tanto, la edición del genoma de QTL proporciona un enfoque alternativo para desarrollar variedades de élite en especies cuyos ciclos de reproducción plantean desafíos logísticos.

En el caso de que se conozcan los nucleótidos específicos que gobiernan un QTL, la edición del genoma podría usarse para modificar los nucleótidos en el QTL a los alelos favorables. No todos los QTL se han definido a nivel de genes o alelos para la mayoría de los QTL, solo una región localizada del genoma se ha definido como QTL. Por lo tanto, una región del genoma podría reemplazarse mediante el uso de tecnologías de edición del genoma, aunque los métodos actuales son ineficaces y aún no se conocen las restricciones sobre la longitud del ADN que se puede editar.

RESULTADO: Los métodos de edición del genoma pueden complementar y ampliar los métodos contemporáneos de mejora genética modificando la composición y expresión de los genes y dirigiéndose a los eventos de inserción.

RESULTADO: Los métodos y reactivos de edición del genoma actuales están mejorando rápidamente en precisión y eficiencia.


Un nuevo enfoque de la investigación del ADN podría ser clave para resolver los misterios de las enfermedades mortales

Plasmodium falciparum, el parásito que causa la malaria en los seres humanos, forma protuberancias llamadas "protuberancias" en la superficie de los glóbulos rojos del huésped que le permiten evitar la destrucción y causar inflamación. Crédito: Institutos Nacionales de Salud

Para analizar el genoma o las características genéticas de un organismo vivo, los científicos generalmente se basan en muestras de millones de células. El problema es que el ADN de cada una de nuestras células no es idéntico.

Hasta hace poco, la cantidad de ADN que podía extraerse de una sola célula no podía proporcionar suficiente material para el análisis genético, pero los avances en la genómica unicelular podrían ser la clave para resolver algunos de los misterios de enfermedades como el cáncer, que es el resultado del daño a las células individuales. También podría ayudar a los investigadores a comprender mejor los sistemas corporales complejos, como el cerebro y el sistema inmunológico, que se componen de una variedad de tipos de células, cada uno con sus propias características genéticas únicas.

Como medio para resolver los problemas planteados por la genómica unicelular, un proceso llamado amplificación de genes completos proporciona a los investigadores formas de generar cantidades suficientes de ADN necesarias para el análisis mediante la replicación del material genético extraído de cada célula. El proceso no está exento de desafíos, pero un artículo de Shiwei Liu, un Ph.D. candidata en biología en la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad de Virginia, la profesora de biología de la UVA Jennifer L. Güler y otros, publicados recientemente en la revista Medicina del genoma, describe un enfoque para la amplificación del genoma completo resultante de una colaboración con neurocientíficos de la Facultad de Medicina de la UVA que podría proporcionar un marco eficaz para crear tratamientos nuevos y más efectivos para una variedad de enfermedades.

Güler y Liu estudian el parásito protozoario unicelular, llamado Plasmodium, que causa la malaria, una enfermedad que mata a casi medio millón de personas cada año. No existen vacunas eficaces de uso generalizado para la enfermedad, y uno de los problemas que enfrenta la comunidad médica es que el organismo puede desarrollar rápidamente resistencia a los medicamentos que se han desarrollado para eliminarla. El equipo de Güler ha estado trabajando para comprender los mecanismos celulares que le permiten sobrevivir y cómo la diversidad genética dentro de la población de parásitos afecta su resistencia a los fármacos.

"Si los toma en un nivel de una sola célula, comenzamos a apreciar que las células individuales en una población de células en realidad tienen pequeñas diferencias, y esas pequeñas diferencias pueden no ser notables, pero pueden tener un impacto si interrumpen la forma en que los medicamentos o otros tratamientos funcionan ", dijo Güler.

En los últimos años, los científicos han estado encontrando formas de capturar y extraer ADN de células individuales, lo que hace posible identificar las pequeñas pero críticas diferencias entre células individuales. Sin embargo, el proceso requiere una serie de pasos que crean problemas adicionales para los investigadores que intentan amplificar el ADN, un proceso que implica reproducir suficientes copias idénticas de ese ADN para poder identificar o secuenciar sus componentes. El proceso de amplificación es especialmente desafiante para los investigadores de la malaria.

"El genoma del parásito de la malaria es realmente pequeño, casi 300 veces más pequeño que el genoma humano, por lo que si capturamos un genoma del parásito de la malaria, comenzamos a un nivel mucho más bajo de lo que necesitamos para poder secuenciarlo. tenemos que utilizar un método muy sensible y muy específico para poder amplificarlo ”, explicó Güler. "Luego lo secuencia, y presumiblemente todo en esa secuencia de todas esas copias diferentes va a reflejar ese primer genoma, y ​​aquí es donde entra un gran desafío. Cuando hace esas muchas copias, introduce errores, y puede" Supongamos siempre que esas muchas copias reflejan el genoma inicial. Ese ha sido un gran problema en la genómica unicelular ".

Debido a que el parásito Plasmodium vive en el torrente sanguíneo humano, Güler y su equipo también necesitaban un método que les permitiera amplificar preferentemente el genoma del protozoo sobre su huésped, un problema que es exclusivo para estudiar los organismos que viven dentro de las células de otros organismos. .

La solución surgió como resultado de una colaboración con Mike McConnell, un neurocientífico que trabaja como investigador en el Instituto Lieber para el Desarrollo del Cerebro Maltz Research Laboratories en Baltimore. Güler conoció a McConnell cuando trabajaba en el Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la Facultad de Medicina de la UVA.

McConnell se especializa en el análisis del genoma de una sola célula para las células del cerebro humano y ya había desarrollado estrategias para capturar células individuales. También había trabajado con Ian Burbulis, profesor asistente de bioquímica y genética molecular en UVA, para utilizar un método llamado ciclos de amplificación basados ​​en hibridación múltiple y bucle, o MALBAC, para resolver algunos de los problemas inherentes al proceso del genoma unicelular. amplificación.

Güler reconoció las similitudes en los desafíos a los que se enfrentaban, y su equipo pudo utilizar el método de McConnell para capturar células individuales y también pudo adaptar el método MALBAC para su uso en la reproducción precisa del ADN de Plasmodium al tiempo que limita la contaminación que puede ser causada por el ADN de su anfitrión.


Células dendríticas modificadas por genes de quimiocinas para la terapia del cáncer

John A. Puskas,. James J. Mulé, en Terapia génica del cáncer (tercera edición), 2014

Conclusiones

Actualmente se está desarrollando la modificación genética de las CD humanas para producir quimiocinas localmente como un enfoque inmunoterapéutico contra el cáncer. A medida que la atención del cáncer se vuelve más individualizada, los pacientes con células T antitumorales circulantes preexistentes pueden beneficiarse de este tipo de enfoque novedoso de terapia contra el cáncer. Las áreas de investigación en curso probablemente se centrarán en qué quimiocinas específicas, solas o en combinación, serán las más efectivas para pacientes individuales o tumores específicos para obtener una sólida inmunidad antitumoral. A medida que se realicen más ensayos clínicos en humanos, la información específica sobre los tipos, números, función y especificidad de las células efectoras inmunes reclutadas y localizadas por las quimiocinas selectivas producidas por las CD inyectadas será informativa. De hecho, las CD modificadas genéticamente que secretan quimiocinas pueden desempeñar un papel importante en la mejora de las estrategias de vacunación para pacientes con una variedad de tumores sólidos.


Tecnología de ADN

La tecnología del ADN ha revolucionado la ciencia moderna. Ácido desoxirribonucleico (ADN), o el material genético de un organismo & mdash heredado de una generación a la siguiente & mdash contiene muchas pistas que han desvelado algunos de los misterios detrás de los humanos comportamiento, enfermedad, evolucióny envejecimiento. A medida que los avances tecnológicos conduzcan a una mejor comprensión del ADN, surgirán nuevas tecnologías basadas en el ADN. Avances recientes en la tecnología del ADN, incluida la clonación, PCR, ADN recombinante tecnología, huella de ADN, terapia de genes, La tecnología de microarrays de ADN y la elaboración de perfiles de ADN ya han comenzado a dar forma a la medicina, las ciencias forenses, las ciencias ambientales y la seguridad nacional.

En 1956, la estructura y composición del ADN fue aclarada y confirmada estudios previos más de una década antes que demostraban que el ADN es el material genético que se transmite de una generación a la siguiente. Una nueva herramienta llamada PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se desarrolló poco después de que se descubrió el ADN. La PCR representa uno de los descubrimientos o invenciones más importantes en la tecnología del ADN y ha dado lugar a un premio Nobel en 1993 para Kary Mullis, nacida en Estados Unidos (1949 & ndash).

La PCR es la amplificación de una secuencia específica de ADN para que pueda ser analizada por científicos. La amplificación es importante, especialmente cuando es necesario analizar una pequeña secuencia de ADN en cantidades lo suficientemente grandes para realizar otros análisis moleculares como el ADN. secuenciación. Poco después de que se desarrollara la tecnología de PCR, Ingeniería genética de ADN a través de la tecnología de ADN recombinante se hizo posible rápidamente. El ADN recombinante es ADN que se ha alterado utilizando enzimas derivadas de bacterias llamadas endonucleasas de restricción que actúan como tijeras para cortar el ADN. El patrón que se corta puede coincidir con un patrón cortado por las mismas enzimas de una secuencia de ADN diferente. Los extremos pegajosos que se crean se unen entre sí y, por lo tanto, se puede insertar una secuencia de ADN en otra secuencia de ADN.

Las endonucleasas de restricción también son importantes en la toma de huellas genéticas. En este caso, las enzimas que reconocen secuencias de ADN específicas pueden producir fragmentos de ADN cortando diferentes partes de una cadena larga de ADN. Si hay diferencias en la secuencia debido a una variación heredada, lo que significa que hay ADN adicional o secuencias específicas alteradas de manera que las enzimas de restricción ya no reconocen el sitio, se pueden producir patrones variables. Si estos patrones se utilizan para comparar dos personas diferentes, tendrán un patrón de fragmento o huella dactilar diferente. Las huellas digitales genéticas se pueden utilizar para realizar pruebas de paternidad. En medicina forense, las huellas digitales genéticas se pueden utilizar para identificar a un delincuente en función de si su secuencia de ADN única coincide con el ADN extraído de la escena del crimen. Esta tecnología también puede permitir a los investigadores producir mapas genéticos de cromosomas basados ​​en estas restricciones. enzima huellas dactilares. Debido a que existen muchas enzimas diferentes, se pueden determinar muchas huellas dactilares diferentes.

La tecnología del ADN recombinante también se puede aplicar para empalmar genes en dispositivos moleculares que pueden transportar estos genes a varios destinos celulares. Esta técnica, también llamada gene terapia, se ha utilizado para administrar genes corregidos en individuos que tienen genes defectuosos que causan enfermedades. Empalme de genes también se ha aplicado al medio ambiente. Varios bacterias han sido modificados genéticamente para producir proteinas que descomponen contaminantes químicos nocivos como el DDT. Actualmente, los científicos están investigando la aplicación de esta tecnología para producir plantas y plantas modificadas genéticamente. cultivos que puede producir sustancias que matan insectos. Similar, frutas se puede diseñar para tener genes que produzcan proteínas que ralentizan el proceso de maduración en un esfuerzo por extender su vida útil.

La tecnología de microarrays de ADN, también conocida como chip de ADN, es la última en nanotecnología que permite a los investigadores tener la capacidad de estudiar genoma de una manera de alto rendimiento. Se puede utilizar para la elaboración de perfiles de expresión génica, lo que da a los científicos información sobre qué genes se regulan al alza o a la baja. Se pueden determinar varios perfiles genéticos para estimar cáncer riesgo o para identificar marcadores que puedan estar asociados con la enfermedad. Solo tiene la capacidad de detectar cambios en la expresión génica que sean lo suficientemente grandes como para ser detectados por encima de un nivel de referencia. Por lo tanto, no detecta cambios sutiles en la expresión génica que puedan causar enfermedades o desempeñar un papel en el desarrollo de enfermedades. También se puede utilizar para el genotipado, aunque todavía se está investigando el genotipado de diagnóstico clínico mediante la tecnología de microarrays.

Genes de otros especies también se puede utilizar para agregar nuevos rasgos a un particular organismo. Por ejemplo, bacterias, ratones, y todas las plantas han tenido luminiscentes (luz brillantes) genes de medusas añadidos a sus genomas. Otra razón para agregar genes a un organismo extraño es la fabricación de diversos productos farmacéuticos o nutricionales. Algunas vacas han sido modificadas para que puedan producir humanos. insulina o vitaminas en su leche a granel. Cerdos se han modificado para superar una serie de problemas de trasplante de modo que se pueda realizar un trasplante limitado de órganos de cerdos a humanos, también llamado xenotrasplante.

La tecnología del ADN es un área de investigación relativamente nueva con una enorme controversia. Es probable que continúe siendo una gran parte del debate público y tenga un impacto en todos los aspectos del diagnóstico médico, la terapéutica, la ciencia forense y la elaboración de perfiles genéticos.


Control alienígena

Malyshev ve la capacidad de controlar la absorción de bases de ADN extrañas como una medida de seguridad que evitaría la supervivencia de células extrañas fuera del laboratorio, en caso de que escapen. Pero otros investigadores, incluido Benner, están tratando de diseñar células que puedan producir bases extrañas desde cero, obviando la necesidad de una materia prima.

El grupo de Romesberg está trabajando para obtener ADN extraño para codificar proteínas que contienen aminoácidos distintos de los 20 que juntos componen casi todas las proteínas naturales. Los aminoácidos están codificados por 'codones' de tres letras de ADN cada uno, por lo que la adición de solo dos 'letras' de ADN ajenas expandiría enormemente la capacidad de una célula para codificar nuevos aminoácidos. "Si lees un libro escrito con cuatro letras, no podrás contar muchas historias interesantes", dice Romesberg. "Si te dan más letras, puedes inventar nuevas palabras, puedes encontrar nuevas formas de usar esas palabras y probablemente puedas contar historias más interesantes".

Los usos potenciales de la tecnología incluyen la incorporación de un aminoácido tóxico en una proteína para asegurar que mata solo las células cancerosas y el desarrollo de aminoácidos brillantes que podrían ayudar a los científicos a rastrear reacciones biológicas bajo el microscopio. El equipo de Romesberg fundó una empresa llamada Synthorx en San Diego, California, para comercializar el trabajo.

Ross Thyer, biólogo sintético de la Universidad de Texas en Austin y coautor de un artículo relacionado con News and Views, dice que el trabajo es “un gran paso adelante en lo que podemos hacer”. Debería ser posible conseguir que el ADN extraño codifique nuevos aminoácidos, dice.

“Muchos en la comunidad en general pensaron que el resultado de Floyd sería imposible”, dice Benner, porque las reacciones químicas que involucran al ADN, como la replicación, deben ser exquisitamente sensibles para evitar la mutación.

La E. coli alienígena contiene solo un par de bases de ADN extrañas entre millones. Pero Benner no ve ninguna razón por la que una célula completamente extraterrestre no sea posible. "No creo que haya ningún límite", dice. "Si retrocedes y repites la evolución durante cuatro mil millones de años, podrías encontrar un sistema genético diferente".

Pero crear un organismo totalmente sintético sería un gran desafío. "Muchas veces la gente dirá que creará un organismo completamente a partir de su ADN no natural", dice Romesberg. “Eso simplemente no va a suceder, porque hay demasiadas cosas que reconocen el ADN. Está demasiado integrado en todas las facetas de la vida de una célula ".


Ver el vídeo: How to Make a Genetically Modified Plant (Diciembre 2021).