Información

¿Es correcto utilizar los términos multinucleado y sincitia indistintamente?


Si ve el músculo esquelético, tiene varios núcleos y se dice que es "multinucleado". De manera similar, el músculo cardíaco también tiene varios núcleos, pero se denomina específicamente"sincitial".Así que mi pregunta es: ¿Hay alguna razón detrás de esto o los términos son intercambiables? Enumero las fuentes de las que surgió la pregunta en mi mente:

[Fuente1]

Las fibras musculares individuales se forman durante el desarrollo a partir de la fusión de varias células inmaduras indiferenciadas conocidas como mioblastos en formas largas, cilíndricas, multinucleado células. La diferenciación en este estado se completa principalmente antes del nacimiento. [Fuente2]

El cardiaco sincitio es una red de cardiomiocitos conectados entre sí por discos intercalados que permiten la transmisión rápida de impulsos eléctricos a través de la red, permitiendo que el sincitio actúe en una contracción coordinada del miocardio. [Fuente3]


No, los términos multinucleado y sincitio no son sinónimos en este contexto. La mayoría de los cardiomiocitos no son multinucleares. Para ser claros, sincitio es se usa para referirse a las células multinucleares que se originan a partir de la fusión de células no nucleares, incluido el músculo esquelético, pero eso no es a lo que se hace referencia en el contexto del músculo cardíaco.

La página de Wikipedia sobre sincitio resume esto muy bien:

Por lo tanto, el tejido cardíaco se describe como un sincitio funcional, a diferencia del verdadero sincitio del músculo esquelético.

Los "discos intercalados" del músculo cardíaco están llenos de uniones gap y desmosomas. Los desmosomas mantienen unidas las células físicamente, mientras que las uniones gap permiten que los iones (y moléculas pequeñas) pasen directamente entre las células, formando "sinapsis eléctricas". Esto permite que las señales eléctricas se propaguen entre los miocitos para coordinar la contracción.

Las uniones gap están formadas por proteínas, en lugar de fusiones de la membrana plasmática, por lo que son relativamente pequeñas. Esto significa que no todo en el citoplasma puede pasar a través de ellos, principalmente iones y algunas moléculas pequeñas. Las proteínas, por ejemplo, no atravesarían uniones gap. Por lo tanto, las células que están conectadas a través de uniones gap, como los cardiomiocitos, siguen siendo algo independientes, a diferencia de las células completamente multinucleares.

También hay tipos de neuronas, incluidas algunas en el SNC, que también forman uniones gap y actúan al menos algo en concierto de esta manera.


Solo para agregar algo de información relacionada con la terminología biológica en su conjunto, no solo con el músculo cardíaco (que ya se abordó correctamente en la respuesta aceptada):

Multinucleado y sincitio están no sinónimos y no se pueden utilizar indistintamente.

Como el nombre lo muestra claramente, multinucleado se refiere a una (única) célula que contiene varios núcleos.

Sin embargo, según el mecanismo de formación de dicha célula, se puede clasificar como:

  • Coenocito: cuando una sola célula con un solo núcleo realiza varias divisiones celulares sin dividir el citoplasma (citocinesis);
  • Sincitio: cuando se agregan varias células uninucleadas, formando una sola célula multinucleada.

Por lo tanto, todo sincitio es una célula multinucleada, pero no todas las células multinucleadas son sincitios.


Ameba

Un ameba (/ ə ˈ m iː b ə / escrito con menos frecuencia ameba o ameba plural soy (o) ebas o soy (o) ebae / ə ˈ m iː b i /), [1] a menudo llamado ameboide, es un tipo de célula u organismo unicelular que tiene la capacidad de alterar su forma, principalmente extendiendo y retrayendo pseudópodos. [2] Las amebas no forman un solo grupo taxonómico, sino que se encuentran en todos los linajes principales de organismos eucariotas. Las células ameboides se encuentran no solo entre los protozoos, sino también en hongos, algas y animales. [3] [4] [5] [6] [7]

Los microbiólogos a menudo usan los términos "ameboide" y "ameba" indistintamente para cualquier organismo que exhiba movimiento ameboide. [8] [9]

En los sistemas de clasificación más antiguos, la mayoría de las amebas se ubicaban en la clase o subfilo Sarcodina, un grupo de organismos unicelulares que poseen pseudópodos o se mueven por flujo protoplásmico. Sin embargo, los estudios filogenéticos moleculares han demostrado que Sarcodina no es un grupo monofilético cuyos miembros comparten ascendencia común. En consecuencia, los organismos ameboides ya no se clasifican juntos en un grupo. [10]

Los protistas ameboides más conocidos son Caos carolinense y Amoeba proteus, los cuales han sido ampliamente cultivados y estudiados en aulas y laboratorios. [11] [12] Otras especies bien conocidas incluyen la llamada "ameba devoradora de cerebros". Naegleria fowleri, el parásito intestinal Entamoeba histolytica, que causa la disentería amebiana, y la "ameba social" multicelular o moho mucoso Dictyostelium discoideum.


Examen final A & ampP (Belmont, McGrew)

cavidad corporal ventral
torácica (separada del resto de la cavidad ventral por un diafragma en forma de cúpula. el corazón y los pulmones están protegidos por la caja torácica ósea) y las cavidades abdominopélvicas (cavidad abdominal superior: alberga estómago, intestinos, hígado y otros órganos cavidad pélvica inferior) parcialmente encerrado por la pelvis ósea y contiene el sistema reproductivo, la vejiga y el recto

membranas serosas de la cavidad corporal ventral
membrana muy delgada de doble capa-serosa parietal: parte de la membrana que recubre las paredes de la cavidad-serosa visceral: cubre las superficies externas de los órganos

regiones abdominopélvicas
-región umbilical: más central, incluye ombligo-región epigástrica: inmediatamente superior a la umbilical, recubre la mayor parte del estómago-región púbica (hipogástrica): inmediatamente inferior a la ubilical, abarca el área púbica-regiones inguinales (ilíacas): lateral a hipogástrica, partes superiores suprayacentes de los huesos de la cadera -regiones laterales (lumbares): entre las costillas y las porciones abocinadas en los huesos de la cadera, lateral a las regiones umbilical-hipocondríacas: región epigástrica flanqueante lateralmente y costillas inferiores suprayacentes

cavidad oral
Comúnmente llamada boca, contiene los dientes y la lengua.

cavidad nasal
ubicado dentro y detrás de la nariz

Cavidades orbitarias
en el cráneo albergan los ojos y los presentan en una posición anterior

cavidades del oído medio
cada cavidad del oído medio se encuentra justo medial al tímpano y está tallada en el cráneo óseo. Estas cavidades contienen huesos diminutos que transmiten vibraciones sonoras al órgano de la audición en el oído interno.


2 Drosophila Miogénesis y conocimientos sobre el papel de nautilo

Varios aspectos del desarrollo muscular parecen conservarse entre Drosophila y organismos vertebrados. Entre estos se encuentra la conservación de genes que son críticos para el proceso miogénico, incluidos factores de transcripción como nautilo." Drosophila es un organismo útil para la identificación de moléculas que son esenciales para la miogénesis en ambos Drosophila y en otras especies. Nautilus parece estar involucrado en la especificación y / o diferenciación de un subconjunto específico de células fundadoras del músculo. Como ocurre con varios de sus homólogos vertebrados e invertebrados, es capaz de inducir un programa miogénico de diferenciación que recuerda al de los precursores de los músculos somáticos, cuando se expresa en otros tipos de células. Los estudios han revelado un papel fundamental para Pax-3 en la especificación de un subconjunto particular de células miogénicas, las progenitoras de los músculos de las extremidades. Estas células miogénicas migran del somita a la periferia del organismo, donde se diferencian. Estos mioblastos no expresan MyoD o myf5 hasta que han llegado a su destino y comienzan el proceso morfológico de miogénesis. Luego comienzan a expresar estos genes, posiblemente para poner en acción el plan miogénico. Por lo tanto, al igual que con nautilus, MyoD y myf5 pueden ser necesarios para la manifestación de un compromiso específico del músculo que ya ha ocurrido.


Resultados

Expresión de CIT-K durante el desarrollo testicular

Se ha demostrado previamente que CIT-K es muy abundante en los testículos de ratones adultos (Di Cunto et al., 1998), pero su localización celular y patrón de expresión de desarrollo no se caracterizaron. Para aclarar estos puntos, se analizaron los niveles de proteína CIT-K y la localización en diferentes etapas de desarrollo utilizando un anticuerpo policlonal específico (Di Cunto et al., 2000). Los extractos de células totales preparados a partir del día (P) 4 postnatal y los testículos de ratones adultos mostraron una expresión robusta de CIT-K, comparable con los niveles observados en el cerebelo en desarrollo (Fig. 1A). Curiosamente, no se detectó expresión en los ovarios adultos (Fig. 1A). La inmunohistoquímica realizada con el mismo anticuerpo reveló que, durante la embriogénesis y en los primeros días postnatales, la inmunorreactividad de CIT-K se concentró en los gonocitos (Fig. 1B). En los túbulos adultos, la expresión de CIT-K se localizó en las células germinales del compartimento basal (Fig. 1C) y fue particularmente pronunciada en la diferenciación de espermatogonias de tipo A (Fig. 1C). Por el contrario, la expresión de CIT-K en las células de las capas suprabasales fue muy baja o indetectable (Fig. 1C).

Expresión de CIT-K durante el desarrollo testicular. (A) Se sondaron extractos de proteínas de tejidos de tipo salvaje de ratón mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-CIT-K (panel superior) o anti GAPDH (panel inferior). Las muestras fueron cerebelo en P4 (1), testículo en P4 (2) y P40 (3), ovario en P4 (4). (B-C) Se analizaron secciones de testículos de ratón de tipo salvaje en P4 (B) y P40 (C) mediante inmunohistoquímica con anticuerpos anti-Citron purificados por afinidad. Barras, 50μm.

Expresión de CIT-K durante el desarrollo testicular. (A) Se sondaron extractos de proteínas de tejidos de tipo salvaje de ratón mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-CIT-K (panel superior) o anti GAPDH (panel inferior). Las muestras fueron cerebelo en P4 (1), testículo en P4 (2) y P40 (3), ovario en P4 (4). (B-C) Se analizaron secciones de testículos de ratón de tipo salvaje en P4 (B) y P40 (C) mediante inmunohistoquímica con anticuerpos anti-Citron purificados por afinidad. Barras, 50μm.

La inactivación de CIT-K da como resultado un agotamiento específico de las células germinales testiculares

Ratones heterocigotos para una mutación nula del CIT-K los genes muestran una esperanza de vida y una fertilidad normales. Por el contrario, los ratones CIT-K - / - se caracterizan por un crecimiento reducido y mueren durante las primeras tres semanas posnatales debido a una epilepsia letal (Di Cunto et al., 2000). En P14, si se compara con los controles + / + y +/-, el peso corporal de los ratones - / - se reduce en aproximadamente un 25% (Di Cunto et al., 2000). La autopsia realizada a la misma edad reveló que la mayoría de los órganos somáticos, con la única excepción del cerebro, muestran una reducción de tamaño similar pero mantienen una estructura histológica normal (Di Cunto et al., 2000). Sin embargo, el volumen de CIT-K - / - testículos se redujo en aproximadamente un 70% (Fig. 2A), lo que sugiere un deterioro específico. Usando el examen histológico en animales de control, los espermatocitos maduros parecieron diferenciarse en la capa más interna de los túbulos seminíferos (Fig. 2B). Por el contrario, los testículos de los ratones knock-out estaban gravemente empobrecidos de precursores espermatogénicos en proliferación y diferenciación (Fig. 2C). El epitelio testicular se simplificó drásticamente y parecía consistir principalmente en una única fila de células de Sertoli (Fig. 2C). Se detectó un número comparable de células de Leydig en el estroma intersticial de - / - y animales de control. Otros órganos reproductivos, como los conductos deferentes y el epidídimo, parecían ser normales en los nocauts (datos no mostrados). Sorprendentemente, el análisis histológico de los ovarios P14 de las hembras knockout y de control no mostró grandes diferencias morfológicas entre los genotipos (Fig. 2D, E). En particular, se detectaron varios folículos en reposo y en crecimiento a lo largo de la corteza ovárica de animales - / - (Fig. 2D, E). Dado que no se observaron diferencias significativas entre los controles + / + y +/-, todos los análisis posteriores se realizaron solo en + / + y - / - animales.

Deterioro testicular específico en ratones CIT-K - / -. (A) Vista frontal de los testículos P14 CIT-K + / + y - / -. (B-E) Secciones histológicas de testículos P14 (B, C) y ovarios (D, E) de ratones P14 CIT-K + / + (B, D) y - / - (C, E). Tinción de hematoxilina y eosina, barra, 50 μm.

Deterioro testicular específico en ratones CIT-K - / -. (A) Vista frontal de los testículos P14 CIT-K + / + y - / -. (B-E) Secciones histológicas de testículos P14 (B, C) y ovarios (D, E) de ratones P14 CIT-K + / + (B, D) y - / - (C, E). Tinción de hematoxilina y eosina, barra, 50 μm.

Análisis del bloqueo espermatogénico en testículos CIT-K - / -

Para dilucidar si los testículos postnatales de ratones knockout para CIT-K todavía contienen células espermatogénicas y para establecer en qué etapa de diferenciación ocurre la depleción observada, llevamos a cabo una RT-PCR semicuantitativa de diferentes marcadores espermatogénicos (Tanaka et al., 2000). ). En P8, el análisis de las transcripciones que aparecen en células espermatogénicas tempranas antes de que alcancen la etapa de espermatocitos, como el homólogo de Vasa de ratón (Mvh) y A-Myb (Mettus et al., 1994 Tanaka et al., 2000), no mostró diferencias entre genotipos (Fig. 3A). Por el contrario, los ARNm de Dmc1 y Mlh1, que se expresan en los espermatocitos antes de que alcancen la etapa de paquiteno (Baker et al., 1996 Habu et al., 1996), se redujeron drásticamente en las muestras knockout (Fig. 3A). Sorprendentemente, la expresión de Calmegin, que normalmente comienza en los espermatocitos de paquiteno (Watanabe et al., 1994), no fue detectable en los knockouts (Fig. 3A). En P14, los niveles relativos de expresión del marcador de espermatocitos eran comparables a los de las muestras de P8 (datos no mostrados), y los ARNm de Mvh y A-Myb todavía eran detectables en los testículos knockout (Fig. 3B). Sin embargo, si se compara con los controles, sus niveles de expresión se redujeron claramente en las muestras - / - (Fig. 3B). En conjunto, estas observaciones indican que el epitelio testicular simplificado de los ratones CIT-K - / - todavía contiene células germinales, que son completamente incapaces de diferenciarse como espermatocitos meióticos y sufren un agotamiento progresivo.

Análisis del bloqueo espermatogénico en ratones CIT-K - / -. (A-B) La expresión de los marcadores espermatogénicos indicados se analizó mediante RT-PCR en condiciones semicuantitativas. El ensayo se realizó con ARN total extraído de ratones con inactivación de CIT-K (-) y control de camada (+) en P8 (A) y P14 (B). (C, D) Las células germinales primordiales se identificaron mediante tinción con fosfatasa alcalina de comparables secciones longitudinales de testículos embrionarios E12.5 CIT-K + / + (C) y - / - (D). (E, F) Se identificaron gonocitos y espermatogonias indiferenciadas en secciones de testículos P4 CIT-K + / + (E) y - / - (F) mediante inmunotinción anti-ciclinaD1. (G) Se determinó el número total de gonocitos y espermatogonias indiferenciadas en secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina de testículos de ratones CIT-K + / + (barras abiertas) y - / - (barras cerradas) en los tiempos indicados. Los valores se expresan como porcentaje del control. Las barras de error son desviación estándar, PAG& lt0.01.

Análisis del bloqueo espermatogénico en ratones CIT-K - / -. (A-B) La expresión de los marcadores espermatogénicos indicados se analizó mediante RT-PCR en condiciones semicuantitativas. El ensayo se realizó con ARN total extraído de ratones con inactivación de CIT-K (-) y control de compañero de camada (+) en P8 (A) y P14 (B). (C, D) Las células germinales primordiales se identificaron mediante tinción con fosfatasa alcalina de comparables secciones longitudinales de testículos embrionarios E12.5 CIT-K + / + (C) y - / - (D). (E, F) Se identificaron gonocitos y espermatogonias indiferenciadas en secciones de testículos P4 CIT-K + / + (E) y - / - (F) mediante inmunotinción anti-ciclinaD1. (G) El número total de gonocitos y espermatogonias indiferenciadas se determinó en secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina de testículos de ratones CIT-K + / + (barras abiertas) y - / - (barras cerradas) en los tiempos indicados. Los valores se expresan como porcentaje del control. Las barras de error son desviación estándar, PAG& lt0.01.

Para determinar si las células germinales masculinas de los ratones knockout para CIT-K ya están comprometidas durante el desarrollo embrionario, se analizaron secciones seriadas de embriones masculinos + / + y - / - en diferentes etapas de desarrollo mediante histología e histoquímica de fosfatasa alcalina. Como se muestra en la Fig. 3C, D PGC se detectaron fácilmente en las crestas genitales de embriones de control y knockout, y no se observaron células ectópicas positivas para fosfatasa alcalina, lo que indica que la especificación y migración de precursores espermatogénicos no se ven gravemente afectadas por la ausencia de CIT-K. Sin embargo, su número se redujo significativamente en los ratones knockout ya en E12.5 (Fig. 3C, D). Por consiguiente, en E14.5 el número de gonocitos en el lumen de los cordones seminíferos CIT-K - / - se redujo a aproximadamente el 60% de los controles (Fig. 3G). Después del nacimiento, las células que muestran las características morfológicas de los gonocitos y las espermatogonias de tipo A fueron fácilmente detectables en secciones histológicas de testículos knockout (datos no mostrados), de acuerdo con el análisis de RT-PCR. Para confirmar aún más la presencia de estas células, realizamos en las mismas muestras la detección inmunohistoquímica de ciclinaD1, que ha sido reconocida recientemente como un marcador específico (Beumer et al., 2000). Como se muestra en la Fig. 3F, se detectaron células positivas para ciclinaD1 en el lumen tubular y en la membrana basal de los túbulos knockout, lo que indica además que estaban presentes tanto gonocitos como espermatogonias de tipo A. Sin embargo, si se compara con los testículos embrionarios, el número relativo de células germinales se redujo aún más, siendo solo el 30% del control en P4 (Fig. 3E, G). Estos datos indican que, además de las espermatogonias diferenciadoras, incluso las PGC y los gonocitos están significativamente comprometidos por la ausencia de CIT-K.

Pérdida apoptótica de precursores espermatogénicos CIT-K - / -

Para investigar si el agotamiento observado de los precursores de células germinales testiculares fue causado por una proliferación reducida o un aumento de la muerte celular, se determinaron los índices apoptóticos y proliferativos de las células tubulares testiculares en los testículos embrionarios y postnatales de animales de tipo salvaje y knockout mediante caspasa anti-activada. -3 inmunotinción y marcaje BrdU, respectivamente.

Como se muestra en la Fig. 4A, B, el número de células apoptóticas detectadas en el lumen de los cordones seminíferos en E14.5 aumentó claramente en secciones de embriones - / - frente a + / +. El aumento relativo fue incluso más significativo cuando los recuentos absolutos se normalizaron para el número reducido de gonocitos observado en los knockouts (Fig. 4E).

Pérdida apoptótica de precursores espermatogénicos en ratones CIT-K - / -. Los embriones E14.5 de entrecruzamiento heterocigótico de CIT-K se marcaron durante 1 hora en el útero con BrdU y luego se procesaron para inmunohistoquímica. (A, B) Los gonocitos apoptóticos se identificaron mediante inmunohistoquímica para la Caspasa-3 activada, como células intratubulares positivas (puntas de flecha rojas). El ensayo se realizó en secciones comparables de testículos CIT-K + / + (A) y - / - (B). Las células intersticiales mostraron una positividad citoplásmica de fondo en las muestras de control y knockout. (C, D) El índice de proliferación tubular se determinó en secciones adyacentes a las utilizadas para el ensayo de apoptosis, marcadas por inmunotinción anti-BrdU. (E) Representación gráfica de los índices apoptóticos (Cas-3) y proliferativos (BrdU) en E14.5 en testículos de CIT-K + / + (barras abiertas) y - / - (barras cerradas). Los valores se expresan como el aumento relativo en comparación con el control. Las barras de error muestran la desviación estándar, PAG& lt0.01.

Pérdida apoptótica de precursores espermatogénicos en ratones CIT-K - / -. Los embriones E14.5 de entrecruzamiento heterocigótico de CIT-K se marcaron durante 1 hora en el útero con BrdU y luego se procesaron para inmunohistoquímica. (A, B) Los gonocitos apoptóticos se identificaron mediante inmunohistoquímica para la Caspasa-3 activada, como células intratubulares positivas (puntas de flecha rojas). El ensayo se realizó en secciones comparables de testículos CIT-K + / + (A) y - / - (B). Las células intersticiales mostraron una positividad citoplásmica de fondo en las muestras de control y knockout. (C, D) El índice de proliferación tubular se determinó en secciones adyacentes a las utilizadas para el ensayo de apoptosis, marcadas por inmunotinción anti-BrdU. (E) Representación gráfica de los índices apoptóticos (Cas-3) y proliferativos (BrdU) en E14.5 en testículos de CIT-K + / + (barras abiertas) y - / - (barras cerradas). Los valores se expresan como el aumento relativo en comparación con el control. Las barras de error muestran la desviación estándar, PAG& lt0.01.

Sorprendentemente, a pesar del número reducido de gonocitos, el índice de marcaje BrdU de los cordones seminíferos knockout aumentó aproximadamente 2,5 veces (Fig. 4C, E). Se obtuvieron resultados similares en P4 (datos no mostrados).

En conjunto, las observaciones anteriores indican que el notable agotamiento de las células germinales testiculares que se produce en los ratones knockout para CIT-K está provocado por la pérdida apoptótica progresiva de precursores embrionarios y posnatales.

Citocinesis defectuosa en precursores espermatogénicos CIT-K - / -

Se ha demostrado previamente que CIT-K es necesario para la citocinesis en poblaciones específicas del sistema nervioso central (SNC) en desarrollo, pero no en los otros tejidos somáticos que lo expresan en niveles significativos (Di Cunto et al., 2000). Para abordar si el aumento de la muerte celular de los precursores testiculares CIT-K - / - se correlaciona con un deterioro específico de este proceso, preguntamos si un aumento en las células germinales que muestran una morfología binucleada o multinucleada podría detectarse en los knockouts. El examen de secciones semifinas obtenidas de testículos postnatales reveló que el número de gonocitos y espermatogonias con al menos dos núcleos aumentó aproximadamente cuatro veces en las muestras - / - (Fig. 5A, C). La microscopía electrónica de secciones ultrafinas, obtenidas de las mismas muestras, demostró que estas células no eran elementos mononucleares adyacentes sino sincitias reales (Fig. 5D), lo que indica un bloqueo de citocinesis. Sorprendentemente, se observaron muchas células con más de dos núcleos en los túbulos CIT-K - / -, pero nunca en las muestras de control (Fig.5A, B, D), lo que indica que las células deficientes en citocinesis pueden volver a entrar en el ciclo celular y someterse a múltiples rondas de síntesis de ADN.

Citocinesis defectuosa en CIT-K - / - células germinales masculinas indiferenciadas. (A, B) Se analizaron secciones semifinas de testículos P4 CIT-K + / + (A) y - / - (B) mediante microscopía óptica. Las puntas de flecha rojas apuntan a espermatogonias de tipo A que muestran más de un núcleo. (C) El porcentaje de células germinales indiferenciadas que muestran una morfología binucleada / multinucleada se determinó en secciones semifinas mediante microscopía óptica. Las barras de error muestran la desviación estándar, PAG& lt0.005. (D) Imagen de microscopía electrónica de un espermatogonio P4 CIT-K - / - tipo A, que muestra tres núcleos rodeados por el mismo citoplasma. (E) Inmunohistoquímica anti-ciclinaD1 realizada en testículo P4 CIT-K - / -, que muestra un espermatogonio multinucleado que expresa altos niveles de esta proteína. (F) Campo de alta potencia de inmunotinción de Caspasa-3 anti-activada, realizada en testículos P4 CIT-K - / -. La punta de flecha roja indica una célula binucleada apoptótica temprana. Barras, 20 μm.

Citocinesis defectuosa en CIT-K - / - células germinales masculinas indiferenciadas. (A, B) Se analizaron secciones semifinas de testículos P4 CIT-K + / + (A) y - / - (B) mediante microscopía óptica. Las puntas de flecha rojas apuntan a espermatogonias de tipo A que muestran más de un núcleo. (C) El porcentaje de células germinales indiferenciadas que muestran una morfología binucleada / multinucleada se determinó en secciones semifinas mediante microscopía óptica. Las barras de error muestran la desviación estándar, PAG& lt0.005. (D) Imagen de microscopía electrónica de un espermatogonio P4 CIT-K - / - tipo A, que muestra tres núcleos rodeados por el mismo citoplasma. (E) Inmunohistoquímica anti-ciclinaD1 realizada en testículo P4 CIT-K - / -, que muestra un espermatogonio multinucleado que expresa altos niveles de esta proteína. (F) Campo de alta potencia de inmunotinción de Caspasa-3 anti-activada, realizada en testículos P4 CIT-K - / -. La punta de flecha roja indica una célula binucleada apoptótica temprana. Barras, 20 μm.

Curiosamente, en la inmunohistoquímica de ciclinaD1 notamos que muchos de los gonocitos binucleados y multinucleados y las espermatogonias muestran una alta inmunorreactividad para esta proteína (Fig. 5E).

Para establecer un vínculo directo entre el bloqueo de la citocinesis y la inducción de apoptosis en las células germinales testiculares knockout, primero intentamos cuantificar el porcentaje de células poliploides que experimentan apoptosis mediante análisis FACS después de un doble marcaje con yoduro de propidio y anticuerpos anti-caspasa-3. como se informó anteriormente para el cerebro (Di Cunto et al., 2000). Sin embargo, probablemente debido a la baja relación entre las células germinales y de soporte en las etapas analizadas (P4 y P8), no se obtuvieron resultados significativos (datos no mostrados). Por lo tanto, para abordar el mismo punto, intentamos establecer el porcentaje de células positivas para Caspasa-3 activadas que muestran claramente morfología mononucleada frente a binucleada o multinucleada. Una posible complicación para este tipo de análisis es que las células en las últimas etapas del proceso apoptótico a menudo sufren condensación y fragmentación nuclear (Walker et al., 1988), lo que hace imposible evaluar el número original de núcleos. Por lo tanto, las células que muestran núcleos condensados ​​y fragmentados se excluyeron de los recuentos. Usando estos criterios, no pudimos identificar células apoptóticas tempranas con más de un núcleo en secciones de tipo salvaje (número total de células puntuadas = 92 en 50 secciones). Por el contrario, aproximadamente el 10% de las células positivas para Caspasa-3 mostraron una morfología binucleada o multinucleada en los knockouts (Fig. 5F, número total de células puntuadas = 250 en 25 secciones).

En conjunto, estas observaciones indican que la ausencia de CIT-K da como resultado una citocinesis anormal y poliploidización de precursores espermatogénicos, que pueden ir seguidas de la reentrada en el ciclo celular o la inducción de la muerte celular programada.


La inhibición de Sca-1 da como resultado una miogénesis defectuosa y una proliferación sostenida de mioblastos

Las células T que sobreexpresan Sca-1 homotípicamente se agregan cuando se cultivan in vitro, lo que sugiere que Sca-1 es capaz de mediar la adhesión célula-célula (Bamezai y Rock, 1995). Se han utilizado anticuerpos anti-Sca-1 para inhibir la agregación de timocitos que expresan Sca-1 en sus superficies (Bamezai y Rock, 1995 English et al., 2000), lo que sugiere que los anticuerpos específicos bloquean la unión de Sca-1 a su ligando no identificado. Mientras que se ha demostrado que la reticulación de algunos anticuerpos monoclonales anti-Sca-1 estimula la activación de las células T, se ha demostrado que la unión de otros, como los anticuerpos derivados de D7 y E13, no es activante (Bamezai y Rock, 1995), coherente con su papel en la inhibición de la agregación. Para examinar directamente el papel de Sca-1 en la separación y diferenciación del ciclo celular de mioblastos, cultivamos células C2C12 en presencia de anticuerpos anti-Sca-1 que se ha demostrado que bloquean las interacciones de Sca-1 in vitro.

El clon E13-161.7 se generó originalmente contra células `pre-T 'de ratón BALB / c (Aihara et al., 1986), mientras que el clon D7 se generó contra la línea de células T de ratón dependiente de interleucina 2 (IL-2) CTL- L (Ortega y col., 1986). Aunque ambos anticuerpos reaccionan con Sca-1, reconocen distintos epítopos ya que D7 es incapaz de bloquear la unión de E13-161.7 (Bamezai y Rock, 1995). En nuestros experimentos, el tratamiento con anticuerpos no alteró la expresión de Sca-1, según lo determinado por inmunotransferencia (datos no mostrados). Mientras que el tratamiento con cualquier anticuerpo solo no produjo una diferencia significativa en la fusión de mioblastos o la síntesis de ADN, en comparación con las células no tratadas o las células tratadas de manera similar con anti-CD34, que es un marcador de células madre primitivo que también se encuentra en los mioblastos C2C12 (Beauchamp et al., 2000) , los dos anticuerpos anti-Sca-1 en combinación bloquearon la formación de miotubos y la proliferación sostenida de mioblastos en comparación con las células de control no tratadas, similar a los efectos observados con el tratamiento con PIPLC (índice de fusión 0,30 ± 0,06 frente a 0,60 ± 0,05, PAG& lt0.001 11 ± 3% versus 3 ± 1% núcleos positivos para BrdU, PAG& lt0.001) (Fig. 3A, B). Estos efectos sobre la diferenciación de mioblastos y la síntesis de ADN pudieron observarse hasta a los 10 días de tratamiento con anticuerpos, con una reversión completa de estos efectos tras la eliminación del anticuerpo (datos no mostrados).

Sca-1 es esencial para la abstinencia del ciclo celular de los mioblastos y la formación de miotubos durante la diferenciación. (A) El índice de fusión [número de núcleos en células fusionadas (≥2 núcleos) / núcleos totales] disminuyó en células cultivadas durante 5 días en medios de diferenciación en presencia de anticuerpos E13-161.7 y D7, en comparación con células no tratadas (CNT) o células tratadas con anticuerpo solo o con anticuerpo contra CD34, un marcador de células madre primitivo que también se encuentra en mioblastos C2C12. Los datos mostrados son la media ± s.e.m. (norte= 3 * diferencia significativa, PAG& lt0.05). (B) El porcentaje de células positivas para BrdU aumentó en células cultivadas durante 5 días en medio de diferenciación en presencia de anticuerpos E13-161.7 y D7, en comparación con células no tratadas (CNT) o células tratadas con anticuerpo solo o anticuerpo anti-CD34. Los datos mostrados son la media ± s.e.m. (norte= 3 * diferencia significativa, PAG& lt0.05). (C) El análisis de inmunotransferencia demostró la regulación a la baja de la expresión de Sca-1 en células C2C12 transfectadas de forma estable con Sca-1 antisentido (AS), en comparación con células transfectadas con vector vacío (SHAM). Se utilizó β-actina como control. Se muestran los resultados típicos del clon 6. (D) La citometría de flujo demostró una disminución en la subpoblación de células C2C12 que expresan Sca-1 en cultivos desarrollados durante 2 días en medio de diferenciación (Día 2) y transfectados de manera estable con Sca-1 antisentido (AS naranja), en comparación con las células transfectadas con vector vacío (S rojo) (* diferencia significativa, PAG= 0,035). Hubo una disminución pequeña, pero no estadísticamente significativa, en el porcentaje de células que expresan Sca-1 en cultivos en proliferación (Pro) transfectados de manera estable con Sca-1 antisentido (AS azul), en comparación con las células transfectadas con vector vacío (S verde) (PAG= 0,4). Las puertas (barra gris vertical) se establecieron mediante la unión inespecífica del anticuerpo conjugado con PE en cada experimento. Se muestra un perfil representativo con valores medios para el porcentaje de células Sca-1 positivas y negativas dadas (norte= 3). (E) El índice de fusión [número de núcleos en células fusionadas (≥2 núcleos) / núcleos totales] disminuyó en las células que expresan Sca-1 antisentido (AS) y se cultivó durante 5 días en medios de diferenciación, en comparación con las células que expresan el vector vacío (SHAM ). Los datos mostrados son la media ± s.e.m. (norte= 4 * diferencia significativa, PAG& lt0,05) (F) El porcentaje de células positivas para BrdU se incrementó en las células que expresan Sca-1 antisentido (AS) y se cultivaron durante 5 días en medio de diferenciación, en comparación con las células que expresan el vector vacío (SHAM). Los datos mostrados son la media ± s.e.m. (norte= 4 * diferencia significativa, PAG& lt0.05).

Sca-1 es esencial para la abstinencia del ciclo celular de los mioblastos y la formación de miotubos durante la diferenciación. (A) El índice de fusión [número de núcleos en células fusionadas (≥2 núcleos) / núcleos totales] disminuyó en células cultivadas durante 5 días en medios de diferenciación en presencia de anticuerpos E13-161.7 y D7, en comparación con células no tratadas (CNT) o células tratadas con anticuerpo solo o con anticuerpo contra CD34, un marcador de células madre primitivo que también se encuentra en mioblastos C2C12. Los datos mostrados son la media ± s.e.m. (norte= 3 * diferencia significativa, PAG& lt0.05). (B) El porcentaje de células positivas para BrdU aumentó en células cultivadas durante 5 días en medio de diferenciación en presencia de anticuerpos E13-161.7 y D7, en comparación con células no tratadas (CNT) o células tratadas con anticuerpo solo o anticuerpo anti-CD34. Los datos mostrados son la media ± s.e.m. (norte= 3 * diferencia significativa, PAG& lt0.05). (C) El análisis de inmunotransferencia demostró la regulación a la baja de la expresión de Sca-1 en células C2C12 transfectadas de forma estable con Sca-1 antisentido (AS), en comparación con las células transfectadas con vector vacío (SHAM). Se utilizó β-actina como control. Typical results from clone 6 are shown. (D) Flow cytometry demonstrated a decrease in the subpopulation of Sca-1-expressing C2C12 cells in cultures grown for 2 days in differentiation medium (Day 2) and stably transfected with Sca-1 antisense (AS orange), compared with cells transfected with empty vector (S red) ( * significant difference, PAG=0.035). There was a small, but not statistically significant, decrease in the percent Sca-1-expressing cells in proliferating cultures (Pro) stably transfected with Sca-1 antisense (AS blue), compared with cells transfected with empty vector (S green) (PAG=0.4). Gates (vertical gray bar) were established by nonspecific PE-conjugated antibody binding in each experiment. A representative profile is shown with mean values for percent Sca-1-positive and -negative cells given (norte=3). (E) Fusion index [number of nuclei in fused cells (≥2 nuclei)/total nuclei] was decreased in cells expressing Sca-1 antisense (AS) and grown for 5 days in differentiation media, compared with cells expressing empty vector (SHAM). Data shown are mean±s.e.m. (norte=4 * significant difference, PAG<0.05) (F) Percent BrdU-positive cells was increased in cells expressing Sca-1 antisense (AS) and grown for 5 days in differentiation media, compared with cells expressing empty vector (SHAM). Data shown are mean±s.e.m. (norte=4 * significant difference, PAG& lt0.05).

Previously, it has been shown that D7 antibody alone can inhibit thymocyte aggregation by 80-90% (Bamezai and Rock, 1995) however, D7 was unable to block myotube formation in our studies in the absence of E13-161.7 antibody. This suggests that the mechanism for Sca-1-mediated myoblast differentiation is different from its mechanism for aggregation in thymocytes, perhaps involving other pro-differentiation events that are myoblast specific.

To determine whether Sca-1 expression is necessary for myoblast cell-cycle withdrawal and differentiation, we made stable cell lines expressing sense and antisense versions of full-length Sca-1. Sca-1-overexpressing cells behaved no differently than sham-transfected or untransfected cells (data not shown), and were not included in subsequent experiments. This suggested that Sca-1 does not confer a gain of function in cells already expressing Sca-1. Antisense-expressing cells showed a significant downregulation of Sca-1 expression, compared with a cell line stably transfected with empty vector (Fig. 3C,D). When grown in differentiation media, Sca-1 antisense-expressing cells displayed a fusion defect with short, paucinuclear myotubes (fusion index 0.09±0.07 versus 0.65±0.05 PAG<0.001) (Fig. 3E), and retained a higher proliferation index (29±4% versus 3±1% BrdU-positive nuclei PAG<0.001) (Fig. 3F), compared with untransfected or sham-transfected cells. These data demonstrated that Sca-1 is necessary for proper cell-cycle withdrawal and myotube formation during C2C12 differentiation.

Because others have shown that myoblasts that fail to differentiate undergo apoptosis, we also analyzed Sca-1 antisense-expressing cells for cell death and p21 expression. Compared with control C2C12 cells, which showed Sca-1 antisense-expressing cells, which continue to proliferate in differentiation medium, failed to induce p21 expression and demonstrated an increase in apoptosis (C.L.E., J.E.L. and H.S.B., unpublished). Although these data suggest that Sca-1 might influence p21 expression, and consequently protect against apoptosis, how Sca-1 couples to p21 expression remains to be determined.

Sca-1 inhibition arrests myoblast differentiation

Since experiments with blocking antibodies and antisense directed against Sca-1 suggested that Sca-1 regulates myoblast cell-cycle withdrawal and myotube formation, we wanted to determine whether blocking Sca-1 affected the expression of skeletal muscle differentiation markers. We grew C2C12 cells expressing Sca-1 antisense in differentiation medium for five days and co-stained these cells with antibodies against Myf5, MyoD and myogenin, as markers of specific stages of C2C12 differentiation (Fig. 4) (Sabourin and Rudnicki, 2000 Shimokawa et al., 1998). Myf5 and MyoD were observed both in >90% of proliferating control and antisense-expressing cells (PAG>0.1), whereas MyoD and myogenin were found in differentiated control (90% and 50%, respectively) and antisense (95% and 60%, respectively) cells, with no significant difference in the percent positive cells for either myogenic regulatory factor between control and antisense-expressing cells (PAG>0.1) (Fig. 4A). However, expression of the earliest marker of myogenic commitment, Myf5 (Beauchamp et al., 2000), persisted in cells expressing Sca-1 antisense grown under differentiation conditions (78%±12% Myf5-positive nuclei in antisense-expressing cells at day 5 versus 4%±3% in control C2C12 cells PAG=0.019) (Fig. 4A). To determine whether the Myf5-positive, Sca-1 antisense-expressing cells grown under differentiating conditions comprised the pool of proliferating cells previously detected (Fig. 3F), we labeled cells with BrdU, and co-stained with antibodies against BrdU and Myf5. The percentages of BrdU-positive control and antisense-expressing cells in proliferating and differentiating cultures were the same as reported above (Fig. 3F). However, the majority of Sca-1 antisense-expressing, Myf5-positive cells were actively proliferating (Fig. 4B). These studies demonstrate that inhibiting Sca-1 expression results in a proliferating pool of mononuclear myoblasts that persist in an early stage of differentiation, despite culture under conditions that would result in myotube formation in wild-type cells.

Sca-1 downregulation blocks myogenesis. Untransfected, control C2C12 cells (C) and cells expressing Sca-1 antisense (AS) were grown under proliferation conditions and in differentiation medium for 5 days (as described for Fig. 3). They were then metabolically labeled with BrdU and stained with DAPI to identify nuclei, with antibody against BrdU (red) to detect DNA synthesis, and with antibodies against Myf5 (green), MyoD (green) and myogenin (green) as markers of myoblast differentiation. Barra, 50 micras. (A) Whereas proliferating (Pro) control and antisense cells expressed Myf5 and MyoD, and myogenin was expressed under differentiation conditions in both cell lines, expression of the early myogenic marker Myf5 persisted in Sca-1 antisense cells under differentiation conditions. Quantitative analysis provided in text. (B) Wild-type cells were negative for Myf5 and BrdU after 5 days in differentiation medium, whereas Sca-1 antisense cells grown in differentiation medium for 5 days were positive for both Myf5 and BrdU. Quantitative analysis provided in text.

Sca-1 downregulation blocks myogenesis. Untransfected, control C2C12 cells (C) and cells expressing Sca-1 antisense (AS) were grown under proliferation conditions and in differentiation medium for 5 days (as described for Fig. 3). They were then metabolically labeled with BrdU and stained with DAPI to identify nuclei, with antibody against BrdU (red) to detect DNA synthesis, and with antibodies against Myf5 (green), MyoD (green) and myogenin (green) as markers of myoblast differentiation. Barra, 50 micras. (A) Whereas proliferating (Pro) control and antisense cells expressed Myf5 and MyoD, and myogenin was expressed under differentiation conditions in both cell lines, expression of the early myogenic marker Myf5 persisted in Sca-1 antisense cells under differentiation conditions. Quantitative analysis provided in text. (B) Wild-type cells were negative for Myf5 and BrdU after 5 days in differentiation medium, whereas Sca-1 antisense cells grown in differentiation medium for 5 days were positive for both Myf5 and BrdU. Quantitative analysis provided in text.

Sca-1 is necessary for appropriate regulation of Fyn activity during myogenesis

Some GPI-anchored proteins signal through Src-family tyrosine kinases (Horejsi et al., 1998 Marmor and Julius, 2000). Specifically, Sca-1/Ly-6A/E has been shown to signal through Fyn during T-cell activation in vitro (Lee et al., 1994). However, whereas in vitro crosslinking of Sca-1 in T cells results in Fyn autophosphorylation (Lee et al., 1994), observations with Sca-1-null mice suggest that Sca-1 downmodulates lymphocyte responses (Stanford et al., 1997). Recently, Fyn activity has been implicated in the regulation of anti-apoptotic pathways in differentiated myotubes, but specifically has been shown to be inactive during earlier stages of myogenesis (Laprise et al., 2002).

To determine whether Sca-1 function in myoblasts is mediated through Fyn, we assayed Fyn and Src activity in myoblasts stimulated to form myotubes. Both wild-type and Sca-1 antisense-expressing cells demonstrated constitutive Src activity, independent of differentiation stage or Sca-1 expression (Fig. 5A, bottom). Fyn activity was elevated in wild-type cells at day 5 in differentiation medium (Fig. 5A, top), consistent with the previously demonstrated role of Fyn in protecting differentiated myotubes against apoptosis (Laprise et al., 2002). By contrast, Fyn activity was elevated in Sca-1 antisense myoblasts at day 2 in differentiation medium, compared with wild-type cells (PAG=0.012) (Fig. 5A, top). This time point coincides with the transient increase in Sca-1 expression observed during myoblast cell-cycle withdrawal and early differentiation (Shen et al., 2003). This finding suggested that inappropriate Fyn activity at an earlier stage of myogenesis might provide a mechanism for the sustained proliferation and arrest in myogenic differentiation seen in Sca-1 antisense cells.

Fyn mediates Sca-1 function in myogenesis. (A) Fyn and Src kinase activities were measured in wild-type C2C12 cells (C white bars) and cells expressing Sca-1 antisense (AS gray bars). Cells grown in differentiation media for 2 and 5 days demonstrated an appropriate increase in Fyn activity in control and antisense-expressing cells at day 5 (top), low levels of Src activity at all time points (bottom), and an inappropriate increase in Fyn activity at day 2 in cells expressing Sca-1 antisense (top). Data shown are mean±s.e.m. (norte=3 * significant difference, PAG& lt0.05). Pro, proliferating cells. (B) Control (solid white or grey) or mutant-expressing plasmids (hashed bars), both co-expressing GFP, were transfected into Sca-1 antisense (AS) or wild-type C2C12 (C) cells. Cells were grown in differentiation media for 5 days. The ratio of GFP-expressing (i.e. transfected) mononuclear cells:myotubes (≥2 nuclei) was lower in antisense cells (AS) transfected with dominant-negative Fyn-K299M compared with antisense cells transfected with control plasmid expressing GFP alone (GFP), and higher in wild-type (C) cells transfected with constitutively active Fyn-Y531F compared with GFP-transfected wild-type cells. Data shown are mean±s.e.m. (norte=3 * significant difference, PAG& lt0.05).

Fyn mediates Sca-1 function in myogenesis. (A) Fyn and Src kinase activities were measured in wild-type C2C12 cells (C white bars) and cells expressing Sca-1 antisense (AS gray bars). Cells grown in differentiation media for 2 and 5 days demonstrated an appropriate increase in Fyn activity in control and antisense-expressing cells at day 5 (top), low levels of Src activity at all time points (bottom), and an inappropriate increase in Fyn activity at day 2 in cells expressing Sca-1 antisense (top). Data shown are mean±s.e.m. (norte=3 * significant difference, PAG& lt0.05). Pro, proliferating cells. (B) Control (solid white or grey) or mutant-expressing plasmids (hashed bars), both co-expressing GFP, were transfected into Sca-1 antisense (AS) or wild-type C2C12 (C) cells. Cells were grown in differentiation media for 5 days. The ratio of GFP-expressing (i.e. transfected) mononuclear cells:myotubes (≥2 nuclei) was lower in antisense cells (AS) transfected with dominant-negative Fyn-K299M compared with antisense cells transfected with control plasmid expressing GFP alone (GFP), and higher in wild-type (C) cells transfected with constitutively active Fyn-Y531F compared with GFP-transfected wild-type cells. Data shown are mean±s.e.m. (norte=3 * significant difference, PAG& lt0.05).

We also tested whether anti-Sca-1 antibodies, capable of producing a similar though less-robust effect on myoblast differentiation, likewise affected Fyn activity. In contrast with the upregulation of Fyn activity in Sca-1 antisense-expressing cells at 2 days in differentiation medium, we observed no detectable difference in Fyn activity in cells treated with antibodies compared with untreated cells or cells treated with anti-CD34 antibody (data not shown). Since the alteration in Fyn activity with antisense expression was significant but modest (Fig. 5A), and antisense expression probably has a more consistent effect on Sca-1 than antibody blockade, the ability to detect an alteration in Fyn activity with antibody blockade might fall below our threshold for detection. We did observe that antisense expression had a more-significant effect on BrdU incorporation and myoblast fusion, compared with antibody treatment, as shown in Fig. 3 (fusion index 0.30±0.06 with antibody treatment versus 0.09±0.07 with antisense expression 11±3% BrdU-positive nuclei with antibody treatment versus 29±4% with antisense expression), which is consistent with this explanation.

Why should there be such variability between antibody blockade and antisense expression? We showed that there is variability in Sca-1 expression, with Sca-1 + and Sca-1 - populations present at various times during differentiation (Fig. 1A). Such `shifting' antigen concentrations might explain the incomplete effect of antibody treatment on BrdU incorporation and myoblast differentiation, and the failure to detect a measurable change in Fyn activity. To evaluate further the role of Fyn in Sca-1-mediated myogenesis, we co-expressed a dominant-negative mutant of Fyn and GFP (K299M) (Ko et al., 2002) in Sca-1 antisense-expressing cells and found that the ratio of transfected myoblasts:myotubes (as indicated by GFP expression) after five days in differentiation medium was lower in cells expressing dominant-negative Fyn compared with cells expressing GFP alone (2.3±0.7 versus 5.7±1.6 PAG=0.006) (Fig. 5B). Conversely, we co-expressed a constitutively active form of Fyn and GFP (Y531F) (Maulon et al., 2001) in wild-type C2C12 cells and found that the ratio of transfected myoblasts:myotubes at five days in differentiation medium was higher in cells expressing active Fyn compared with cells expressing GFP alone (4.9±1.7 versus 1.7±0.8 PAG=0.044) (Fig. 5B). We also monitored BrdU incorporation in transfected cells, and observed that >90% of nuclei in mononuclear cells were BrdU positive (data not shown). These studies demonstrated that dominant-negative Fyn rescued the Sca-1 antisense phenotype, whereas active Fyn produced the Sca-1 antisense phenotype in wild-type C2C12 cells. It is important to note that whereas expression of Sca-1 antisense produced a tenfold change in myoblast fusion and BrdU incorporation, the effect of constitutively active Fyn was less pronounced. Although this may, in part, be explained by technical differences between transient transfection of mutant Fyn versus stable, constitutive expression of Sca-1 antisense, it also supports the possibility that Fyn alone may not be solely responsible for mediating Sca-1 effects. However, our observations suggest that the effects of Sca-1 in differentiating myoblasts are mediated at least in part by Fyn, that Sca-1 expression couples to the downregulation of Fyn activity during early myogenesis, and that inappropriate activation of Fyn is associated with sustained myoblast proliferation and a defect in myotube formation.

The role of Sca-1 in myoblast differentiation and cell-cycle withdrawal may be analogous to its role in T cells, where the absence of Sca-1 results in a more rapid and prolonged T-cell proliferative response (Stanford et al., 1997). Our findings also suggest that Fyn activity is temporally regulated during myoblast differentiation. Normally, Fyn activity is upregulated in differentiated myotubes, and is necessary for protecting post-mitotic muscle cells from apoptosis (Laprise et al., 2002). Downregulation of Sca-1 by antisense leads to premature activation of Fyn, which may be responsible for sustained proliferation. This suggests a role for Sca-1 in either suppressing Fyn activity or influencing the integration of Fyn with other signaling pathways that converge on the early myogenic program.

Although a role for Fyn in cellular proliferation and survival has been established in a variety of cell types (Resh, 1998), how Sca-1 couples to Fyn is not known. Plasma membrane microdomains couple signaling in space and time between GPI-anchored proteins on the extracellular surface and signaling proteins compartmentalized in the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane, such as non-receptor protein tyrosine kinases and G proteins (Alonso and Millan, 2001 Matko and Szollosi, 2002). Transmembrane-spanning coreceptors also coalesce in these microdomains, and may be required for transmitting signals from GPI-anchored proteins (Werlen and Palmer, 2002). Whether Sca-1 signals directly through Fyn, or brings components of membrane microdomains together that ultimately regulate Fyn activation, remains to be demonstrated.


Review of the taxonomic history and nomenclature of the yellow-green algae

The taxonomic history of the yellow-green algae is reviewed with emphasis on classification above the rank of genus. Numerous nomenclatural situations in need of rectification or clarification are discussed. At the ordinal level Heterocapsales is rejected because Heterocapsa is a genus of dinoflagellates. As a substitute name Heterogloeales is proposed. At the family level Hetero-gloeaceae is proposed to replace Heterocapsaceae, an invalid name, while Heterococcaceae is proposed to replace both Heterocloniaceae, an invalid name, and Heterodendraceae, an illegitimate name. At the generic level Brachynematella is proposed as a substitute name for the later homonym Brachynema Ålvik , Sphagnoikos for the later homonym Fremya P. A. Dangeard , Heterocalycina for the later homonym Heterocalyx Bursa , Xanthonema for the later homonym Heterothrix Pascher , and Radiosphaerella for the later homonym Radiosphaera Pascher . Meringosphaera subg. Eumeringosphaera secta. Raphidosphaera is elevated to generic rank. The type species of Bumilleria is shown to be B. borziana Wille rather than the universally cited B. sicula Borzì . The type species of Characiopsis is shown to be C. borziana Lemmeemann rather than C. minuta ( Braun ) Borzi or (C. pyriformis ( Braun ) Borzì . The type species of Neonema is shown to be N. quadratum Pascher rather than N. pumilum (W. and G. S. West ) Pascher . The type species of Pseudo-staurastrum is shown to be P. enorme ( Ralfs ) Chodat rather than P. hastatum ( Reinsch ) Bourrelly . A summary of names of higher taxa in the yellow-green algae is appended. For each name is given an indication of its status in accordance with the International Code of Botanical Nomenclature and a general guide to its application.

Offered in memory of the late Professor Dr. Bohuslav Fott .


Abstracto

The transition zone (TZ) of eukaryotic cilia and flagella is a structural intermediate between the basal body and the axoneme that regulates ciliary traffic. Mutations in genes encoding TZ proteins (TZPs) cause human inherited diseases (ciliopathies). Here, we use the trypanosome to identify TZ components and localize them to TZ subdomains, showing that the Bardet-Biedl syndrome complex (BBSome) is more distal in the TZ than the Meckel syndrome (MKS) complex. Several of the TZPs identified here have human orthologs. Functional analysis shows essential roles for TZPs in motility, in building the axoneme central pair apparatus and in flagellum biogenesis. Analysis using RNAi and HaloTag fusion protein approaches reveals that most TZPs (including the MKS ciliopathy complex) show long-term stable association with the TZ, whereas the BBSome is dynamic. We propose that some Bardet-Biedl syndrome and MKS pleiotropy may be caused by mutations that impact TZP complex dynamics.

Cilia, or flagella (the two terms are used here interchangeably), are multifunctional organelles that were present in the last common eukaryotic ancestor (1). Defects in cilia are responsible for pleiotropic human diseases (called ciliopathies) and their function is essential for pathogenesis in protozoan parasites (2, 3).

During ciliogenesis, a microtubule organizing center called the “basal body” docks at the membrane. Basal bodies are built from nine microtubule triplets and two microtubules from each triplet extend to form a transition zone (TZ) and, ultimately, the axoneme. Thus, the TZ represents a structural junction between the basal body and the axoneme.

As expected from its strategic position between the basal body and the axoneme, the TZ acts as a “ciliary gate” that controls ciliary composition and function (4). Many ciliopathies are caused by defects in complexes that associate with the TZ, including Meckel syndrome (MKS), Joubert syndrome and Bardet-Biedl syndrome (BBS). Studies using murine kidney epithelial cells and embryos suggest that the MKS complex demarcates the ciliary membrane by forming a diffusion barrier at the base of the cilium (5 ⇓ –7). On the other hand, the BBS complex (BBSome) is an adapter for intraflagellar transport (IFT) complexes that cross the TZ barrier to transport sensory proteins between the ciliary membrane and the cell body (8, 9).

The TZ has distinctive structural features. At the proximal boundary of the TZ, where the basal body C tubule terminates, a “terminal plate” crosses the TZ. Studies in Tetrahymena suggest that the terminal plate contains pores for the passage of IFT “trains” that deliver axonemal components to the distal tip of flagella (10). Striated transitional fibers radiate from the distal end of the basal body triplets to join the plasma membrane (11 ⇓ ⇓ –14), forming blades thought to create a physical barrier preventing vesicles from entering the ciliary lumen. Electron microscopy (EM) studies in Clamidia suggest that the junction of the transitional fibers and the membrane provides a docking site for IFT particles (15). Y-shaped linkers (or “Y linkers”) extend from the outer microtubule doublets of the TZ to the flagellar membrane, generating a stable (i.e., detergent resistant) membrane domain (16).

The distal boundary of the TZ is defined by the start of the nexin links and dynein arms on the outer axonemal doublets (13, 17), a location somewhat distal to that of the start of the central pair of microtubules in motile cilia. The basal plate anchors at least one microtubule of the central pair (18, 19) and is derived from two electron-dense discs that cross the distal TZ (20).

Although multiple studies have addressed the composition of flagella and basal bodies in a variety of systems (3, 21 ⇓ ⇓ ⇓ –25), biochemical studies on the TZ have been limited by difficulties in obtaining sufficient material of high quality. Recent elegant work used the specific biology of Clamidia to purify TZ remnants from cell walls after axoneme disassembly, identifying proteins specific to green algae as well as orthologs of candidate ciliopathy genes (26).

Trypanosoma brucei is an excellent system to study ciliary biology, having unique tractability among flagellated cells. Trypanosomes possess a basal body pair that subtends a single flagellum and whose duplication reflects that of the mammalian centriole. The trypanosome flagellum exhibits the canonical features of the TZ and the trypanosome genome encodes much of the known conserved biology required for TZ function (such as IFT, MKS, and BBS proteins) (27, 28). Therefore, insights gained from trypanosome TZ biology are likely to apply to other eukaryotic cell types.

Here, we identified protein components of the TZ and nearby structures, using an innovative proteomic approach with general applicability for the biochemical analysis of discrete cytoskeletal structures. We leverage this proteome to uncover basic information about the function and dynamics of the TZ, providing insights into how ciliopathies might cause pleiotropic diseases.


Studies of HS in PM tissues

Although the bulk of neuropathology research in the past decades has been carried out on surgical tissue with its obvious advantages [optimally preserved tissues, homogeneous clinical cohorts and access to up-to-date electroencephalography (EEG) and neuroimaging studies] we should not neglect the ongoing contribution that autopsy samples can provide in the study of HS in epilepsy. Primarily, PM tissues enable comparisons of HS occurring in epilepsy syndromes other than TLE (also known as secondary HS 7 ), the effects of a lifetime of seizures on the severity of hippocampal neuronal loss and its associated pathology 186 , enable study of the bilaterality of HS 73 , the extent of involvement along the entire length of the hippocampus 25 (Figure 5) and to address degeneration in wider networks that have been implied from quantitative MRI studies in TLE 20, 187, 188 , in particular the amygdala, cortex 189 , thalamus 190 and cerebellum 191 . Neuropathology studies have, from the outset, recognized that more extensive pathology may accompany HS 15, 21 , the hippocampus being the epicentre of a wider process. Experimental data support widespread changes occurring following induced seizures 192 which could equally contribute to epileptogenesis. Involvement of wide networks has been shown in TLE 193, 194 and functional and structural imaging of TLE indicates altered brain connections or connectome in TLE 195, 196 . As such, in recent years there has been a move away from a ‘hippocampocentric’ view of TLE 197, 198 addressing contribution from other brain regions. The main studies have investigated (i) electrophysiological evidence to support origin of seizures from extrahippocampal structures 199, 200 (ii) if wider disease offers the explanation for poor outcomes (in terms of seizure-freedom) following localized surgery and (iii) if severity (or progression) of any extrahippocampal pathology correlates with comorbidities, such as cognitive decline.

Variability of hippocampal sclerosis (HS) in post-mortem and surgical samples. (A) Surgical hippocampectomy specimens, which on histological examination correlated to (i) end folium gliosis with no evidence of sclerosis (ii) ILAE Type 3 HS (end-folium sclerosis) (iii) ILAE type 2 HS (CA1 predominant sclerosis) and (iv) ILAE type 1 HS (classical hippocampal sclerosis). In all of the images the arrow indicates the pyramidal cell layer of CA1. (B) A 9.4T MRI image of a post-mortem hippocampus from a patient with longstanding epilepsy and ILAE type 2 (CA1 predominant pattern) of HS at this level (shown in C in a luxol fast blue/cresyl violet preparation), although in other levels the pattern was type 1 (classical). The MRI has the ability to identify subfields and white matter tracts and, indistinctly (arrowed), the dentate gyrus. Improved high fields sequences in the future may be able to identify and define patterns of HS pre-operatively. The MRI image was provided with courtesy of Dr Sofia Eriksson at the Department of Clinical and Experimental Epilepsy, UCL, Institute of Neurology. (D para I) Paired sections of hippocampus from one hemisphere labelled with (D para F) GFAP/counterstained with cresyl violet and (GRAMO para I) calretinin: at the level of the subthalamic nucleus (STNc D, GRAMO), lateral geniculate nucleus (LGNc mi, H) and hippocampal tail (F, I). Classical pattern (ILAE type 1) HS is seen in the anterior levels with sprouting of calretinin-positive fibres visible in the dentate gyrus (arrow) at this low magnification in the tail gliosis and neuronal loss is visible in the CA4 region of the hippocampal tail. Bar is equivalent to approximately 3 mm (D para I).

The cellular and pathological basis of structural changes in extrahippocampal regions associated with HS typically manifests as neuronal loss and gliosis with few studies exploring the contribution of interneuronal populations 189, 201 . It remains to be established whether any more extended ‘network’ changes arise as a result of the same initial insult causing HS, if they are subsequent to HS through retrograde/anterograde degeneration, or if they arise independently. In PM series it is also possible to explore the long-term effects of seizures on the brain and any predisposition to neurodegenerative disease or accelerated ageing processes in HS. It has been observed from a patient cohort closely followed for decades at the National Society for epilepsy, Chalfont centre, that patients with pathology proven HS/TLE at PM were less likely to go into terminal seizure remission with advanced age compared with other epilepsies 8 . It has also been shown in this same PM cohort that accelerated tau accumulation in epilepsy was not associated with the severity of seizures and was also independent of the presence of HS but correlated with acquired and accumulative traumatic brain injury incurred from frequent seizures 202 . Continued donation of brain tissues from patients with epilepsy to tissue bank resources [for example the Epilepsy Society Brain and Tissue Bank at University College London (UCL)] will enable further studies of HS in the future.


Chapter 2 - Yeasts Pathogenic to Humans

The medically significant yeasts comprise more genera than the traditionally held pathogens in the genera Candida and Cryptococcus. Clinically important yeast forms can also be found among the endemic dimorphic fungi, the dematiaceous molds, and even a noncultureable fungus. Collectively, these fungal pathogens exhibit either teleomorphs of the ascomycota or basidiomycota, or their anamorphic forms express morphological and genetic features consistent with one of these taxa. They comprise a diverse spectrum of fungi that have found the means, primarily by exploiting a host organism's weakened immune system, to become noteworthy mycotic agents. Furthermore, they portend the potential for the spectrum of fungal pathogens to become wider and deeper in the number of etiological agents derived from normally benign species. Vigilance by the general as well as the medical mycologist must be maintained to better understand how to address the future challenges likely to be posed to public health by fungi, particularly the yeasts.


Ver el vídeo: Infección por virus sincitial respiratorio (Diciembre 2021).