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D6. Estudiar el Interactoma - Biología


Sistema híbrido de levadura dos

Los factores de transcripción deben hacer más que unirse a objetivos aguas arriba (elementos de respuesta) en el ADN. Este método de dos híbridos de levadura ha permitido la determinación de los socios de unión a proteínas, parte de lo que ahora se denomina interactoma.

Figura: Levadura de dos híbridos

Complementación de fragmentos de proteínas (PFC) (Tarassov, K. et al)

Un gen que codifica un fragmento de una enzima informadora, dihidrofolato reductasa (DHFR), se fusiona con un gen para una proteína cebo y se inserta en un plásmido. Un segundo gen que representa el segundo fragmento de una enzima informadora está vinculado a posibles genes de proteínas diana. En una célula transformada con ambos plásmidos, el gen indicador finalmente mostrará actividad enzimática solo si la proteína cebo traducida se une a una proteína diana traducida, permitiendo que los dos fragmentos de la enzima interactúen y se plieguen colectivamente en una actividad enzimática holoactiva. El gen informador era un mutante de DHFR resistente a un inhibidor, el metotrexato. La actividad funcional de la DHFR conduce al crecimiento celular en presencia de metotrexato.

Figura: Complementación de fragmentos de proteínas

Purificación de afinidad en tándem (TAP) (Rigaut, G. et al)

Un método genérico de purificación de proteínas para la caracterización de complejos de proteínas y la exploración de proteomas. Nature Biotechnology 17. 1030 (1999): Un gen para una proteína cebo se une secuencialmente a genes que codifican dos etiquetas separadas, una para la proteína A (que se une a la inmunoglobulina G - IgG) y un péptido que se une a la calmodulina (que se une a la proteína calmodulina en un proceso que requiere calcio. Entre los genes para las dos etiquetas hay una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido enlazador corto sensible a la proteasa. La construcción del gen se introduce en la levadura y se induce la expresión. Las células se lisan y el extracto se aplica a perlas de cromatografía de afinidad que contienen covalentemente IgG unida, que se une a la etiqueta de Proteína A. Después de un lavado extenso, la proteína cebo unida, con las proteínas diana asociadas, se eluye por proteólisis del enlazador peptídico. El eluido se aplica a una segunda columna de afinidad que contiene calmodulina unida covalentemente. Después del lavado, el La trampa y las proteínas diana asociadas se eluyen con un quelante de calcio (EGTA o EDTA) como interacción de la calmodulina con la segunda etiqueta, calmodulina. péptido de unión, requiere calcio. Las proteínas diana eluidas pueden identificarse mediante PAGE 2D o espectrometría de masas.

Figura: Purificación por afinidad en tándem

Se realizó una comparación reciente de los métodos Y2H, PFC y TAP (Jensen, L. y Bork, 2008; Yu, H et al, 2008). Como era de esperar, el Y2H fue el mejor para determinar las interacciones de las proteínas nucleares, el TAP para las proteínas citoplasmáticas y abundantes y el PFC para las proteínas transmembrana. Todos sufren algo en la identificación de complejos de proteínas transitorios.


Proyectos Interactome en CCSB

El mapeo de interactomas humanos es el proyecto insignia de CCSB. Un primer mapa del interactoma binario humano (Rual et al Naturaleza 2005) se obtuvo mediante selección de levadura de dos híbridos (Y2H) para interacciones directas binarias dentro de una matriz "Espacio I" de

8.000 x 8.000 ORF contenidos en Human ORFeome v1.1 (Rual et al Genome Res 2004). Hemos desarrollado un marco empírico que mide cuantitativamente los parámetros de integridad del cribado, sensibilidad del ensayo, sensibilidad del muestreo y precisión, y usamos este marco para estimar el tamaño del interactoma binario humano como

130.000 ± 32.000 interacciones binarias (Venkatesan et al Métodos Nat 2009). Usando una nueva estrategia de secuenciación de próxima generación para identificar pares de interacción (Yu et al Métodos Nat 2011), hemos realizado una pantalla Y2H para interacciones dentro de una matriz "Espacio II" de

13.000 x 13.000 ORF contenidos en Human ORFeome v5.1. Informamos

14.000 nuevas interacciones binarias directas (Rolland et al Cell 2014), lo que eleva el número total de interacciones binarias únicas a

Los virus dependen intrínsecamente de su célula huésped durante el curso de la infección y pueden provocar fenotipos patológicos similares a los que surgen de mutaciones (Gulbahce et al PLoS Comput Biol 2012). Aplicamos una tubería integrada sistemática para investigar a escala del genoma las perturbaciones de las redes del interactoma del huésped inducidas por productos génicos individuales codificados por miembros de cuatro familias de virus tumorales de ADN funcionalmente relacionadas, pero biológicamente distintas: polimavirus, papilomavirus, adenovirus y Epstein-Barr. virus (Rozenblatt-Rosen et al Naturaleza 2012). Mediante dos híbridos de levadura, examinamos 123 ORF virales contra

13.000 ORF humanos, obteniendo 454 interacciones binarias validadas entre 53 proteínas virales y 307 proteínas diana humanas. Mediante la purificación por afinidad en tándem seguida de espectrometría de masas (TAP-MS), mapeamos de manera reproducible 3.787 asociaciones de co-complejos virales-hospedantes que involucran 54 proteínas virales y los productos de 1.079 genes del hospedador identificados sin ambigüedades. más

Las plantas tienen características únicas que evolucionaron en respuesta a desafíos ambientales y ecológicos. Faltan relatos de las complejas redes celulares que subyacen a las funciones específicas de las plantas. Informamos un mapa de interacción proteína-proteína binaria de todo el proteoma a partir de un tamaño de espacio de búsqueda de

8.000 x 8.000 ORF para la red interactoma de la planta Arabidopsis thaliana. Este mapa de interactoma contiene

6.200 interacciones altamente confiables entre

2% del total Arabidopsis interactoma binario biofísico. más

W orm Interactome versión 8 contiene 3864 interacciones proteína-proteína binarias para C. elegans ensamblado a partir de la pantalla de dos híbridos de levadura de alto rendimiento WI-2007 (1.816 nuevas interacciones informadas en Simonis et al Métodos Nat 2009) la pantalla de dos híbridos de levadura de alto rendimiento WI-2004 (1.735 interacciones informadas en Li et al Ciencia 2004) y un compendio de datos de pantallas de dos híbridos de levadura de rendimiento medio (554 interacciones). más

Y este Interactome versión 1 (CCSB-YI1) contiene interacciones proteína-proteína de dos híbridos de levadura de alta calidad para S. cerevisiae. Incluye 1.809 interacciones entre 1.278 proteínas, que comprenden

10% del interactoma binario de levadura completo estimado en

18.000 ± 4.500 interacciones (Yu et al Ciencia 2008). Para obtener un interactoma de levadura binario más completo, CCSB-YI1 se combinó con conjuntos de datos de Ito-core y Uetz-screen para producir la unión Y2H, que contiene 2.930 interacciones binarias entre 2.018 proteínas,

20% de todo el interactoma binario de levadura. más

F ragmentoma: muchas interacciones proteína-proteína están mediadas a través de dominios modulares plegables de forma independiente. Los esfuerzos de todo el proteoma para modelar redes de interactomas necesariamente han descuidado la organización modular de proteínas. Desarrollamos una estrategia experimental de "fragmentoma" para identificar de manera eficiente los dominios de interacción (Boxem et al Cell 2008). Usamos esta estrategia para generar una red interactoma basada en dominios para proteínas involucradas en C. elegans divisiones de células embrionarias tempranas.

H uman Interactome Mapping Project es el proyecto insignia de CCSB. En 2005 se publicó un primer borrador del mapa del "Espacio-I" del interactoma humano, que describe las interacciones dentro de la matriz de ORF de 8000x8000 contenidos en el ORFeome humano v1.1 (Rual et al.). Hemos utilizado estos datos para desarrollar un marco conceptual que incorpora la integridad de la pantalla, la capacidad de detección del ensayo y la saturación de la pantalla para estimar el tamaño del interactoma humano (Venkatesan et al, presentado). Actualmente, se está trabajando para mapear el espacio II (12kx12k) y III (16k x 16k) del interactoma humano con una cobertura triple.

C. hlamydomonas reinhardtii es un organismo "bioenergético" prometedor capaz de producir gas hidrógeno y otros recursos "biocombustibles". En este proyecto financiado por GTL del Departamento de Energía, estamos: i) verificando y definiendo experimentalmente las estructuras de transcripción de

2.000 genes relacionados metabólicamente y clonando sus marcos de lectura abiertos (ORF) ii) identificación de interacciones proteína-proteína entre los productos génicos metabólicos y iii) construcción de mapas de interacción de proteínas y redes metabólicas que finalmente permitirán el desarrollo de predicciones comprobables de C. reinhardtii fisiología, incluida la letalidad genética y las tasas de crecimiento en condiciones ambientales definidas. más


Interactoma BioPlex

El genoma humano codifica instrucciones para producir aproximadamente 20.000 proteínas diferentes y ndash en conjunto, el proteoma y ndash cuyas actividades median la mayoría de los procesos biológicos tanto a nivel celular como de organismo. El proteoma puede verse como constelaciones de proteínas que interactúan y que se ensamblan para formar una miríada de complejos, compartimentos y vías de transducción de señales que organizan proteínas individuales de acuerdo con una función biológica compartida. Por lo tanto, comprender el interactoma y el conjunto completo de interacciones proteína-proteína humana y las condiciones en las que ocurren será esencial para desarrollar una comprensión a nivel de sistemas de la célula humana.

Desde 2012, hemos estado perfilando interacciones de proteínas en células humanas a través de espectrometría de masas de purificación por afinidad y analizando sistemáticamente las interacciones para todas las proteínas humanas accesibles a escala de proteoma. Aprovechando los clones disponibles en el ORFeome humano (v. 8.1) desarrollado por Marc Vidal y David Hill en el Dana Farber Cancer Center, hemos estado expresando versiones C-terminalmente etiquetadas con HA-FLAG de cada proteína humana para inmunopurificación y LC-MS. identificación de socios vinculantes. Luego, hemos estado combinando estos perfiles de interacción por miles para crear una serie de modelos del interactoma humano con una escala en constante aumento. Mientras que el primero, BioPlex 1.0, incluido

24.000 interacciones entre 8.000 proteínas (Celda 2015), BioPlex 2.0 cobertura ampliada a

57.000 interacciones entre 11.000 proteínas (Naturaleza 2017). El más reciente, BioPlex 3.0, incluye casi 120.000 interacciones entre casi 15.000 proteínas y es el modelo derivado experimentalmente más completo del interactoma humano hasta la fecha (Celda 2021). Debido a que la posición de la red de cada proteína refleja su localización subcelular, función biológica y asociación de enfermedades, estas redes han sido herramientas poderosas para el estudio de miles de proteínas no caracterizadas. También han proporcionado una miríada de conocimientos sobre la modularidad y la organización interactivas.

Debido a que las interacciones de proteínas dependen del contexto, ahora estamos perfilando sistemáticamente interacciones de proteínas en múltiples líneas celulares además de las células 293T. Más recientemente, lanzamos una red complementaria resultante de AP-MS de 5.522 cebos en células HCT116 (Celda 2021). Esta segunda red a escala de proteoma, que abarca 71.000 interacciones entre 10.531 proteínas, complementa nuestra red 293T y revela una remodelación significativa de células específicas. Sobre la base de estos emocionantes resultados, ahora estamos trabajando para completar

10,000 IP & # 8217s en celdas HCT116 y en los próximos años se crearán redes de interacción específicas de línea celular adicionales. ¡Vuelve aquí a menudo para ver las actualizaciones!

El proyecto BioPlex es una colaboración entre los laboratorios Gygi y Harper dentro del Departamento de Biología Celular a Escuela Médica de Harvard y es dirigido por Ed Huttlin, Wade Harper, y Steve Gygi. Las tuberías de cultivo celular y bioquímica están dirigidas por Laura Pontano Vaites. El sitio web de BioPlex fue desarrollado por Devin Schweppe.


El análisis del interactoma del citomegalovirus humano identifica los centros de degradación, las asociaciones de dominios y las funciones de las proteínas virales

El citomegalovirus humano (HCMV) modula ampliamente las células huésped, regulando negativamente las proteínas humanas & gt900 durante la replicación viral y degradando ≥133 proteínas poco después de la infección. El mecanismo de degradación de la mayoría de las proteínas del huésped sigue sin resolverse y las funciones de muchas proteínas virales no están completamente caracterizadas. Realizamos un análisis de interactoma basado en espectrometría de masas de 169 proteínas de HCMV de la cepa canónica Merlin expresadas de forma estable y etiquetadas, y dos proteínas de HCMV no canónicas, en células infectadas. Esto identificó una red de interacciones de & gt3400 virus-huésped y & gt150 virus-proteína virus, proporcionando información sobre las funciones de múltiples genes virales. El análisis de dominio predijo la unión de la proteína viral UL25 a los dominios SH3 de la proteína adaptadora NCK-1. Se identificaron proteínas de interacción viral para 31/133 dianas de hospedador degradadas. Finalmente, se encontró que la proteína ORFL147C no canónica no caracterizada interactúa con elementos de la maquinaria de empalme de ARNm, y un estudio mutacional sugirió su importancia en la replicación viral. Los datos del interactoma serán importantes para futuros estudios de la infección por herpesvirus.

Palabras clave: biología computacional interacción huésped-patógeno humano citomegalovirus humano evasión inmune enfermedad infecciosa microbiología interacción proteína-proteína sistemas proteómicos biología sistemas virología virus.

Declaracion de conflicto de interes

LN, KN, BR, RA, LS, JN, JD, SS, EW, AD, GW, RS, EH, MW No se declaran intereses en competencia

Cifras

Figura 1 .. Esquema de la estrategia de PI.

Figura 1 .. Esquema de la estrategia de PI.

Se generaron y analizaron muestras de PI en técnica ...

Figura 1 — Suplemento de figura 1 .. Más detalles de…

Figura 1 — Suplemento de figura 1 .. Más detalles del interactoma.

Figura 1 — figura suplementaria 2 .. Más detalles de…

Figura 1 — figura suplementaria 2 .. Más detalles de las interacciones.

( A ) Número de HCIP por…

Figura 2 .. Análisis sistemático de los datos del interactoma ...

Figura 2. El análisis sistemático de los datos del interactoma predice funciones novedosas para las proteínas virales.

Figura 2 — figura del suplemento 1 .. Caminos enriquecidos con…

Figura 2 — Suplemento de figura 1 .. Vías enriquecidas con p. 33% de los componentes identificados interactuaron con… 0.05 & gt

Figura 2 — figura suplementaria 2 .. Más detalles de…

Figura 2 — figura suplementaria 2 .. Más detalles de las interacciones según la clase temporal de proteínas virales.

Figura 3 .. Validación de datos de interactome por…

Figura 3 .. Validación de datos del interactoma por co-IP.

( A ) Co-IPs que validan que UL72…

Figura 4 .. Interacción entre UL25 y NCK1…

Figura 4 .. Interacción entre UL25 y NCK1 identificada por análisis de asociación de dominio.

Figura 4 — Suplemento de la figura 1 .. Datos de interacción completos…

Figura 4 — Suplemento de figura 1 .. Datos de interacción completos para UL25 y UL26, anotados como se describe en…

Figura 5 .. UL42 identificado como un concentrador ...

Figura 5 .. UL42 identificado como un centro de destrucción de E3 por una combinación de interactoma ...

Figura 5 — figura del suplemento 1 .. Validación de la interacción…

Figura 5 — figura del suplemento 1 .. Validación de la interacción entre UL42 y NEDD4 (panel izquierdo) y NEDD4L…

Figura 6 .. Los interactores HCMV ORFL147C funcionan en…

Figura 6. Los interactores HCMV ORFL147C funcionan en la unión, corte y empalme y transcripción del ARN.

Figura 6 — figura suplementaria 1 .. Más detalles de…

Figura 6: suplemento de la figura 1. Más detalles de las interacciones ORFL147C y la construcción del virus ΔORFL147C.

Figura 7 .. Superposición de funciones a las que se dirige…

Figura 7 .. Superposición de funciones dirigidas por diferentes virus.

( A ) Análisis de DAVID de…

50.000 interacciones cebo-presa sin filtrar de KSHV para indicar la expresión de proteínas (Davis et al., 2015). Posteriormente, se excluyeron tanto las presas interactuantes de alta confianza de los cebos de KSHV como los interactores de primer grado de estas presas del interactoma humano (Huttlin et al., 2017), para dejar una lista de proteínas que solo interactuaron con HCMV. Los valores p ajustados de Benjamini-Hochberg se muestran para cada vía. Los detalles completos de las proteínas virales y del huésped que interactúan se dan en el archivo complementario 7B.


Redes de interacción proteína-proteína

Interacciones proteína-proteína (PPI) son esenciales para casi todos los procesos en una célula, por lo que comprender los PPI es crucial para comprender la fisiología celular en estados normales y patológicos. También es esencial en el desarrollo de fármacos, ya que los fármacos pueden afectar a los IBP. Redes de interacción proteína-proteína (PPIN) son representaciones matemáticas de los contactos físicos entre proteínas en la célula. Estos contactos:

  • son específicos
  • ocurren entre regiones de unión definidas en las proteínas
  • tienen un significado biológico particular (es decir, cumplen una función específica)

La información de PPI puede representar interacciones tanto transitorias como estables:

  • Se forman interacciones estables en complejos de proteínas (por ejemplo, ribosoma, hemoglobina)
  • Las interacciones transitorias son interacciones breves que modifican o transportan una proteína, lo que conduce a cambios adicionales (por ejemplo, proteína quinasas, importinas de poros nucleares). Constituyen la parte más dinámica del interactoma

El conocimiento de los PPI se puede utilizar para:

  • asignar roles putativos a proteínas no caracterizadas
  • agregar detalles detallados sobre los pasos dentro de una vía de señalización
  • caracterizar las relaciones entre proteínas que forman complejos multimoleculares como el proteasoma

El interactoma

los interactome es la totalidad de los IBP que ocurren en una célula, un organismo o un contexto biológico específico. El desarrollo de técnicas de detección de PPI a gran escala, especialmente la purificación por afinidad de alto rendimiento combinada con espectrometría de masas y el ensayo de dos híbridos de levadura, ha provocado una explosión en la cantidad de datos de PPI y la construcción de interactomas cada vez más complejos y completos ( Figura 16). Esta evidencia experimental se complementa con la disponibilidad de algoritmos de predicción de PPI. Mucha de esta información está disponible a través de bases de datos de interacción molecular como IntAct.

Figura 16 Interactomas de levadura (izquierda) y humanos (derecha) obtenidos utilizando el método híbrido levadura-dos. Imágenes reimpresas con permiso de Macmillan Publishers Ltd: Jeong et al. Nature 2001. 411 (3) y Rual et al. Nature 2005: 437 (4).

Es importante enfatizar una vez más las limitaciones de los datos PPI disponibles. Nuestro conocimiento actual del interactoma es tanto incompleto y ruidoso. Los métodos de detección de PPI tienen limitaciones en cuanto a la cantidad de interacciones verdaderamente fisiológicas que pueden detectar y todos encuentran falsos positivos y negativos.

En las próximas páginas veremos algunas de las propiedades de las redes de interacción proteína-proteína y las implicaciones de estas propiedades para la biología.


18 F-9-O-hexadeutero-3-fluoropropoxil - (+) - dihidrotetrabenazina deuterada (D6-FP - (+) - DTBZ): un agente de formación de imágenes del transportador de monoamina vesicular 2 (VMAT2)

Los transportadores vesiculares de monoamina 2 (VMAT2) en el cerebro sirven como transportadores para empaquetar monoamina en vesículas para la neurotransmisión normal del SNC. Varios agentes de formación de imágenes VMAT2, [11 C] - (+) - DTBZ, dihidrotetrabenazina y [18 F] FP - (+) - DTBZ (9-O-fluoropropil - (+) - dihidro tetrabenazina, también conocida como [18 F] AV- 133), son útiles para estudiar los cambios en la función cerebral relacionados con la transmisión de monoaminas mediante imágenes in vivo. Se ha informado de análogos deuterados que se dirigen a los sitios de unión de VMAT2.

Métodos

Un nuevo deuterado [18 F] 9-O-hexaduterofluoropropil - (+) - dihidrotetrabenazina, [18 F] D6-FP - (+) - DTBZ, [18 F]1, se preparó como un agente de formación de imágenes VMAT2. Este agente 18 F que se dirigió a VMAT2 se evaluó mediante estudios de unión in vitro, biodistribución in vivo y estudios de imágenes de microPET en roedores.

Resultados

La reacción de radiomarcaje de un paso condujo al [18 F] D6-FP - (+) - DTBZ, [18 F] deseado1, que mostró una excelente afinidad de unión a VMAT2 (Ki = 0.32 ± 0.07 nM) comparable a la de FP - (+) - DTBZ (Ki = 0.33 ± 0.02 nM) usando [18 F] FP - (+) - DTBZ y estriado de rata homogeneizados de membrana. La biodistribución in vivo en ratas normales mostró que 1, exhibió una captación cerebral excelente y una proporción alta comparable entre el cuerpo estriado y el cerebelo (objetivo / fondo) 1 h después de la inyección (proporción de 6,05 ± 0,43 frente a 5,66 ± 0,72 para [18 F] FP - (+) - DTBZ frente a [18 F ]1, respectivamente). Los estudios de imágenes de MicroPET en ratas confirman además que el cuerpo estriado con alta concentración de VMAT2 estaba claramente delineado en el cerebro de rata normal después de la inyección intravenosa de [18 F]1. Observamos cambios menores del metabolismo en el plasma de rata entre estos dos agentes; sin embargo, los cambios mostraron poco efecto sobre la captación y retención cerebral regional.

Conclusiones

Los resultados que se informan aquí respaldan el uso de [18 F] D6-FP - (+) - DTBZ, [18 F]1, como agente de formación de imágenes de PET in vivo para la unión de VMAT2 en el cerebro.


El análisis del interactoma celular de la proteína K7 del virus vaccinia identifica tres mecanismos de transporte como socios de unión para K7

La identificación de las proteínas que interactúan entre el virus y el huésped contribuirá a comprender cómo el poxvirus explota la maquinaria celular del huésped. El gen del virus de la vacuna K7R codifica una proteína K7 conservada en la mayoría de los ortopoxvirus. Para obtener información sobre la biología de K7, investigamos el interactoma celular de K7 mediante pulldown de GST junto con espectrometría de masas. Las principales categorías de proteínas identificadas contenían componentes de mecanismos de tráfico. Seleccionamos componentes clave de tres maquinarias de transporte, incluidos coatomer, retromer y CHEVI para confirmar aún más sus capacidades de unión a K7. El motivo de di-lisina de K7 es necesario para su interacción con el coatómero, mientras que las leucinas C terminales en K7 son críticas para la asociación del retrómero. Nuestro estudio descubre el interactoma viral-huésped de vaccinia K7 y revela tres mecanismos de transporte de huésped como socios de unión de K7, que podrían tener un papel importante en los ciclos de vida del poxvirus.

Palabras clave: CHEVI Coatomer K7 Retromer Vaccinia virus.


Análisis completo del interactoma huésped-virus del SARS-CoV-2

La interacción proteína-proteína del huésped-virus es el componente clave del ciclo de vida del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo. Llevamos a cabo un estudio exhaustivo del interactoma entre el virus y las células huésped utilizando estrategias de etiquetado de proximidad y purificación por afinidad en tándem e identificamos 437 proteínas humanas como proteínas de interacción de alta confianza. La caracterización funcional y la validación adicional de estas interacciones aclararon cómo las distintas proteínas virales del SARS-CoV-2 participan en su ciclo de vida y descubrieron posibles dianas farmacológicas para el tratamiento de COVID-19. Los interactomas de dos proteínas virales codificadas por SARS-CoV-2 clave, NSP1 y proteína N, se compararon con los interactomas de sus contrapartes en otros coronavirus humanos. Estas comparaciones no solo revelaron las vías comunes del huésped que estos virus manipulan para su supervivencia, sino que también mostraron interacciones proteína-proteína divergentes que pueden explicar las diferencias en la patología de la enfermedad. Este interactoma integral de la enfermedad por coronavirus-2019 proporciona valiosos recursos para comprender y tratar esta enfermedad.


Ubiquitina: de la señalización a la enfermedad

El recambio de proteínas a través del sistema de ubiquitina es un medio central por el cual se controla la abundancia de proteínas reguladoras. Muchas de estas proteínas están involucradas en cascadas de transducción de señales relacionadas con la proliferación celular, los puntos de control y el cáncer. Este laboratorio emplea enfoques proteómicos y genéticos para descubrir sistemas de señalización clave, ubiquitina ligasas y circuitos reguladores que controlan varias vías biológicas. Las áreas de investigación amplias se describen en el enlace de INVESTIGACIÓN anterior.

Además del sistema de ubiquitina, el laboratorio también está explorando los mecanismos subyacentes a la homeostasis del proteoma a gran escala, incluido el sistema de autofagia y el control de calidad mitocondrial en enfermedades como la enfermedad de Parkinson. Por ejemplo, la proteína PARKIN, que se encuentra mutada en las formas familiares de inicio temprano de la enfermedad de Parkinson, es una ubiquitina ligasa que controla la degradación de las mitocondrias dañadas a través del proceso de autofagia (denominado mitofagia). Nuestro trabajo en esta área se centra en el uso de enfoques proteómicos para identificar dianas de la ubiquitina ligasa PARKIN y cómo PARKIN activa el proceso de mitofagia (Sarraf et al., Naturaleza, 2013). También hemos ampliado nuestro trabajo mitocondrial para comprender cómo se establecen las redes mitocondriales y cómo estos complejos se desregulan en la enfermedad mitocondrial. Nuestra primera publicación en esta área apareció en Molecular and Cellular Biology (Guarani et al., MCB, 2014), donde identificamos un componente novedoso del aparato de ensamblaje del Complejo I de la cadena de transporte de electrones. Estudios posteriores han revelado un componente novedoso de un complejo de unión de crestas llamado MICOS (eLife, 2015). La nueva proteína transmembrana QIL1 une múltiples componentes de MICOS en la membrana interna mitocondrial. En colaboración con Manuel Schiff, demostramos que QIL1 está mutado en la encefalopatía mitocondrial fetal de inicio temprano y que las células de los pacientes han alterado las uniones de las crestas y la estructura mitocondrial (eLife, 2016). Recientemente, también hemos explorado la respuesta de la proteína desplegada miticondrial utilizando proteómica y RNA-Seq, identificando roles para el procesamiento de Pre-RNA en UPR mitocondrial (Munch et al., Naturaleza, 2016). Más recientemente, hemos examinado sistemáticamente las funciones de las 6 proteínas ATG8 en células humanas utilizando métodos de edición de genes, proteómica y biología celular basados ​​en CRISPR (Pontano-Vaites et al., MCB, 2016). También hemos examinado sistemáticamente la ribofagia en una serie de condiciones de estrés distintas, identificando agentes de estrés que inducen la ribofagia y también la degradación de otras proteínas citosólicas (An y Harper, Biología celular de la naturaleza, 2016). Usando proteómica en células sometidas a estrés nutricional, identificamos un nuevo receptor -TEX264- para el recambio de una amplia gama de proteínas ER, la llamada ER-fagia (An et al., Célula molecular 2019). A esto le siguió un análisis sistemático del recambio de proteínas mediante autofagia y sobre estrés nutricional, incluido un análisis detallado de los ribosomas (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32612236/). Este artículo también empleó proteómica basada en ANA para examinar sistemáticamente las tasas de traducción y degradación de las proteínas 8000.

Para ayudar en nuestros estudios proteómicos, hemos desarrollado varias herramientas y métodos proteómicos que facilitan los estudios cuantitativos de las vías de señalización y modificaciones de proteínas como la fosforilación y ubiquitilación. Un sistema clave es nuestra plataforma de proteómica llamada CompPASS (Comparative Proteomics Analysis Software Suite) (Sowa et al., Celda, 2009). CompPASS está diseñado para ayudar a facilitar la identificación de proteínas candidatas en interacción de alta confianza a partir de datos de IP-MS / MS. El sitio web de CompPASS contiene todos los datos del artículo de Cell que describe el interactoma de la enzima deubiquitinante, el interactoma de autofagia (Naturaleza, 2010) y ERAD interactome (Biología celular de la naturaleza, 2011), así como herramientas para navegar por estos datos y un tutorial de CompPASS. Se puede acceder a este software haciendo clic en el icono de CompPASS (a continuación). Hemos utilizado este enfoque para examinar los socios de interacción de cientos de proteínas involucradas en la transducción de señales y enfermedades. Recientemente, hemos desarrollado un nuevo método llamado proteómica de captura con adaptador paralelo para identificar sustratos de ligasas cullin-RING, y lo hemos aplicado a toda la familia SCF-FBXL de E3, identificando numerosos sustratos candidatos (Tan et al., Célula molecular, 2013). Ahora hemos extendido esto a la red p97, identificando una gran colección de dominios UBDX que contienen proteínas asociadas al adaptador y el papel de una de ellas en la ciliogénesis (Raman et al., Biología celular de la naturaleza, 2015)

Recientemente hemos informado en Naturaleza el uso de proteómica cuantitativa para identificar sistemáticamente proteínas enriquecidas con autofagosomas, con el objetivo principal de identificar nuevos cargadores y receptores de carga. Entre las nuevas proteínas enriquecidas autofagosómicamente se encontraba NCOA4, una proteína citoplasmática que demostramos que se localiza en vesículas autofagosómicas en respuesta a la activación de la autofagia. La identificación imparcial de las proteínas asociadas a NCOA4 reveló cadenas pesadas y ligeras de ferritina, componentes de una estructura de jaula llena de hierro que protege a las células de las especies de hierro reactivas, pero que se degrada mediante autofagia para liberar hierro a través de un mecanismo desconocido. Descubrimos que el suministro de ferritina a los lisosomas requería NCOA4, y la incapacidad de las células deficientes en NCOA4 para degradar la ferritina conduce a una disminución del hierro intracelular biodisponible. Nuestro trabajo identifica al NCOA4 como un receptor de carga selectivo para el recambio autofágico de ferritina (ferritinofagia) fundamental para la homeostasis del hierro y proporciona un recurso para una mayor disección de la conectividad del receptor de carga autofagosomal.

Además, con Gygi Lab hemos desarrollado proteómica diGLY como un enfoque para la identificación de sitios de ubiquitilación en proteínas de manera dinámica y cuantitativa (Kim et al., Célula molecular 2011). Este sistema puede usarse para caracterizar el proteoma modificado con ubiquitina y para identificar sitios de ubiquitilación mediante ligasas de ubiquitina específicas. Ahora hemos combinado esto con la proteómica cuantitativa basada en el etiquetado de masas en tándem (TMT) para examinar miles de sitios de ubiquitilación de una manera dependiente de la señal. Usando este sistema, hemos mapeado extensamente la ubiquitilación de mitocondrias dependiente de PARKIN (Rose et al., Sistemas celulares, 2016).


Ver el vídeo: Microarreglos de anticuerpos para la detección de proteínas en suero (Diciembre 2021).