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6: Crecimiento microbiano / bacteriano - Biología


Parte 1 Replicación, transcripción y traducción del ADN

Replicación de ADN

I. ADN cromosómico


A. Dogma central de la genética / flujo de información en las células
-Figura de base: flujo de información genética p

1. El ADN se replicará y se transmitirá a las "células hijas".

B. Estructura del ADN: figura 8.3 Doble hebra (2 hebras de ADN), "doble hélice" helicoidal, antiparalela


1. Dos hebras unidas por enlaces de hidrógeno entre bases complementarias dentro de la hélice
2. Fuerte estructura externa de "azúcar-fosfato"; enlace de enlaces de fosfodiéster covalentes
nucleótidos
3. Hebras de ADN: polímeros de nucleótidos
4. Nucleótidos: 3 componentes. Azúcar = desoxirribosa, fosfato, base nitrogenada
5. Bases nitrogenadas de ADN

una. purinas (2 anillos) = adenina (A) y guanina (G)
pirimidinas (1 anillo) = timina (T) y citosina (C)
B. Reglas de Chagraff: cantidad de A = T y cantidad de C = G; esto se debe a
reglas complementarias de emparejamiento de bases
A = T forman 2 enlaces de hidrógeno
G = C forma 3 enlaces de hidrógeno
*C. El apareamiento de bases complementarias permite la replicación precisa del ADN.

6. Desoxirribosa: pentosa de 5 carbonos. C1 'unido covalentemente a una base nitrogenada.
C3 ’= OH libre (cola)
C5 ’vinculado al grupo fosfato (cabeza)
7. Cromosomas procariotas ver figura; La mayoría de las bacterias tienen un solo cromosoma circular. 1 copia de cromosomas = "células haploides" (la mayoría de las células humanas tienen 2 copias de cromosomas lineales y se denominan "células diploides", ver "cromosomas eucariotas).
8. Topoisomerasas y girasa bacteriana
-Topoisomerasas; Enzimas que "superenrollan" el ADN o alivian el superenrollamiento de diferentes tipos de toposiomerasas en E. coli.
Superenrollamientos de ADN tipo I / III "relajados"
Tipo II = Girasa bacteriana: introduce superenrollamientos negativos
“Mediante la acción de las topoisomerasas, la molécula de ADN se puede enrollar y relajar alternativamente. Debido a que el enrollamiento es necesario para empaquetar el ADN en los confines de una célula y la relajación es necesaria para que el ADN se pueda replicar (y transcribir), estos dos procesos complementarios ... juegan un papel importante en el comportamiento del ADN en la célula. "
Brock Biology of Microorganisms 8th edition p 185)
-La girasa bacteriana participa en el superenrollamiento / alivio del superenrollamiento del ADN
-antibióticos quinolonas (por ejemplo, ácido nalidíxico) y fluoroquinolonas (como
ciprofloxacina) y novobiocina inhiben la girasa bacteriana e interfieren con
Replicación / transcripción de ADN; ver p

C. Síntesis de ADN por ADN polimerasas fig ___; Mesa _____

1. La ADN polimerasa requiere una hebra molde (guía), una hebra de cebador con un grupo 3'OH libre, sustratos / precursores activados = nucleósidos trifosfatos

* 2. ADN replicado en dirección de 5 'a 3' (5 '-> 3'). Los nucleótidos entrantes solo se pueden agregar a la cola 3'OH de una cadena de ADN en crecimiento

3. El oxígeno de los grupos 3'OH realiza un ataque nucleofílico en el átomo de fósforo más interno del nucleósido trifosfato entrante. El pirofosfato se separa y será hidrolizado por las fosfatasas celulares con la liberación de energía para impulsar la síntesis. El nucleótido está unido a la cadena del cebador mediante un enlace fosfodiéster (enlace éster = enlace entre el alcohol y el ácido)

4. Si no hay 3'OH presente, la cadena de ADN no se puede alargar = terminación de la cadena de ADN. Uso de trifosfatos de didesoxinucleósidos como análogos de bases y en reacciones de secuenciación de ADN.

II. Replicación del cromosoma bacteriano

higo ____

A. Recordar el cromosoma bacteriano: ADN bicatenario circular singular en el citoplasma

B. La replicación del ADN comienza en un sitio específico "ori" = origen de replicación

C. La replicación del ADN procede bidireccionalmente desde ori, con formación de burbuja de replicación y 2 horquillas de replicación. Horquillas de replicación = regiones donde d.s. ADN desenrollado, forma s.s. Plantillas de ADN, la ADN polimerasa hace una copia complementaria de la plantilla de ssDNA parental.

D. La replicación del ADN es semiconservativa. Se utiliza 1 hebra de ADN "antigua" parental como plantilla o guía
para la síntesis de 1 nueva cadena de ADN hija.
-resultado: 1 cromosoma padre -> 2 cromosomas hijos. Cada cromosoma hijo es una copia del cromosoma padre. Cada cromosoma hijo consta de 1 hebra de ADN padre antiguo y 1 hebra de ADN hija nueva. 1 hebra parental se "conserva" en cada nuevo cromosoma hijo

E. Enzimas / proteínas involucradas en la síntesis de ADN. CONOZCA PARA EXAMEN. Fig 8___ Tabla ___

1. * Topoisomerasas ex Bacterial Gyrase; involucrado en el superenrollamiento del ADN / alivio de
superenrollamiento (objetivo de quinolonas ex ciprofloxacina "cipro" utilizado para tratar / prevenir
ántrax por inhalación)

1. Helicasa: desenrolla el ADN ds, rompe los enlaces H entre las bases, forma la plantilla de ADN ss

2. Las proteínas de unión de una sola hebra SSBP se unen, estabilizan y protegen el ssDNA

3. ARN Primasa: una ARN polimerasa que no requiere una cadena de cebadores para iniciar la síntesis de cebadores. Sintetiza una hebra corta de cebador de ARN complementario con el grupo 3'OH libre utilizando ADN ss como plantilla. Crea un cebador de ARN, lo que permite que la ADN polimerasa inicie la síntesis de ADN. (La ARN polimerasa no se “corrige” y, por lo tanto, puede cometer muchos errores).

4-5. ADN polimerasa: requiere cadena de cebador, molde y nucleósidos trifosfatos activados (dATP, dTTP, DCTP, dGTP). Debe tener una plantilla de ADN. Sintetiza la hebra de ADN complementaria utilizando la hebra parental como plantilla / guía. La ADN polimerasa tiene "capacidad de corrección de pruebas", "verifican" cada nucleótido que agregan, eliminan si es incorrecto y agregan el nucleótido correcto. Las ADN polimerasas tienen alta fidelidad, cometen muy pocos errores. Tasas de error originales 10-4; después de la corrección, tasa de error = 10-9, es decir, una base incorrecta en cada 109 bases agregadas E. coli: La ADN polimerasa III realiza la mayor parte de la síntesis de ADN
ADN polimerasa I: eliminará el cebador de ARN y lo reemplazará con la secuencia de ADN

6. Ligasa: une secuencias cortas de ADN (llamadas fragmentos de Okazaki) en "lagging
hebra ”tarea ver inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos. ¿Qué son los análogos de nucleótidos? ¿Cuáles son sus usos?

Comparar y contrastar ADN polimerasas bacterianas y ARN polimerasas
Nota: ss = hebra sencilla ds = hebra doble P = fosfato
Visión general:
Las ADN polimerasas sintetizan ADN complementario utilizando una plantilla / guía de ADN
adn
Secuencia de bases de plantilla Ex ssDNA: A T A G G C
Secuencia de ADN complementaria T A T C C G adn
sintetizado por ADN polimerasa


Las ARN polimerasas sintetizan secuencias de ARN complementarias utilizando ADN como
plantilla / guía
adn
Secuencia de bases de plantilla Ex ssDNA: A T A G G C
Secuencia de ARN complementaria U A U C C G rna
sintetizado por ARN polimerasa


La síntesis de ADN y ARN requiere la entrada de energía, tanto ATP como precursores cargados.

Comparar y contrastar la ADN polimerasa y la ARN polimerasa celular
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ADN polimerasa ARN polimerasa
Plantilla / guía ss DNA ssDNA
Sintetizar ADN complementario ARN complementario
Precursores cargados desoxiadenosina tri-P = dATP adenosina tri-P = ATP
desoxitimidina tri-P = dTTP uridina tri-P = UTP
desoxicitodina tri-P = dCTP citodina tri-P = CTP
desoxiguanosina tri-P = dGTP guanosina tri-P = GTP
se requiere imprimación? sí No
revisión / edición? sí * no
-------------------------------------------------------------------------------------------------
* Corrección / edición de ADN polimerasa
Las polimerasas tienen una tasa de error "normal" o "intrínseca" de aproximadamente
10 -4 – 10 -5 nucleótidos (esto significa que las polimerasas introducen el nucleótido incorrecto
cada 10.000 a 100.000 nucleótidos). Las ADN polimerasas tienen la capacidad de "corregir
y editar ”sus errores. Si introducen el nucleótido incorrecto, pueden eliminar o
“Extirpe” el nucleótido incorrecto y vuelva a intentar hacer una coincidencia correcta. Esto reduce el
tasa de error de las ADN polimerasas a aproximadamente 10-9 – 10 -10 (o solo uno incorrecto
nucleótidos cada 1.000.000.000 - 10.000.000.000 nucleótidos). La ARN polimerasa no puede
corregir o editar para que la ARN polimerasa cometa muchos errores (una de las razones
Los virus de ARN, por ejemplo, el VIH, mutan tan rápidamente ... más adelante)

Procariota de transcripción

Revisar el flujo de información en la celda
ADN --------> ARN ---------> Proteína

replicación transcripción traducción


I. Codigo genetico: relación uno a uno entre codón específico (base 3 específica
secuencia) y un aminoácido

II. Transcripción bacteriana: uso de ADN como plantilla / guía para sintetizar ARN complementario.
La información del ADN se reescribe en la secuencia de ARN. Higo ___

A. Primer paso en la expresión genética

B. Productos de la transcripción

1. ARN mensajero = ARNm: se traducirá en un aminoácido específico
secuencia de una proteína
2. ARN de transferencia = ARNt: molécula "traductora" real, reconoce tanto una
codón específico y aminoácido específico
3. ARN ribosómico = ARNr: combinado con proteínas ribosomales, formará
el ribosoma, el "banco de trabajo" en el que el ARNm se traduce en un aminoácido específico
secuencia / polipéptido / proteína

4. productos de ARN adicionales

III. Promotores y ARN polimerasas bacterianas

UNA. Promotores: secuencias de ADN específicas que señalan los puntos de "inicio" del gen
transcripción. El factor sigma / subunidad de la ARN polimerasa se une a los promotores para
iniciar la transcripción


B. Polimerasas de ARN bacteriano: complejo enzimático que reconoce los promotores del ADN, se une
al promotor y sintetiza una copia de ARN complementaria usando ADN como
plantilla / guía

1. E. coli ARN polimerasa: 2 subunidades, subunidad sigma y núcleo
una. ssubunidad / factor de igma= "Cerebros" de la ARN polimerasa. Viaja a lo largo del ADN hasta que alcanza un promotor, se une al promotor
B. subunidad central: se une a sigma unido al promotor. El "caballo de batalla" de la ARN polimerasa, lleva a cabo la síntesis real de ARN. Requiere precursores activados y hebra de plantilla, NO REQUIERE PRIMER (comparar con la ADN polimerasa). Sintetiza ARN en 5 '- a-> 3', similar a la ADN polimerasa. Por lo tanto, ninguna capacidad de corrección de pruebas cometerá más errores que la ADN polimerasa.
C. La subunidad sigma caerá después de que los primeros ribonucleótidos se hayan unido, el núcleo continúa solo. Nota: el núcleo comenzaría la transcripción aleatoria del ADN sin la dirección de la subunidad sigma. ARNm policistrónico (prok. solamente)

IV. Terminación de la transcripción (muy simplificada)

UNA. terminadores: Secuencias de ADN que señalan señales de parada de la transcripción. ARN
La polimerasa libera ADN cuando se encuentra la secuencia del terminador de la transcripción.

Traducción bacteriana higo


I. Traducción: secuencia de bases de ARN traducida a una secuencia de aminoácidos de una proteína. El ARNm es una plantilla para
síntesis de polipéptidos. Segundo paso en la expresión genética.

UNA. La traducción del ARNm en una cadena polipeptídica es posible gracias al código genético:

1. código genético: relación uno a uno entre un codón (secuencia específica de 3 bases)
y un aminoácido específico.
Figura __ Tabla de códigos genéticos

ejemplos
ARNm codón = aminoácido
GAC = aspartato
CCU = prolina
UUG = leucina
Codigo genetico: Redundante (más de un codón para cada aminoácido) pero específico (cada codón
codifica información para 1 aminoácido solamente). Universal; la mayoría de los organismos celulares usan el mismo código genético;
algunas excepciones

B. Requiere traducción ARNt, aminoácidos, ATP / GTP, ribosomas y ARNm

C. ARNt = ARN de transferencia. Molécula adaptadora / traductora. Única molécula que puede "reconocer"
aminoácido correcto Y codón correcto

1. estructura: ARN ss, tallo y bucle
una. sitio de unión de aminoácidos en un extremo
B. anticodón que "reconoce" (forma enlaces H con) el codón del ARNm
2. * 45 ARNt diferentes para 20 aminoácidos diferentes; "Bamboleo" permite que algunos tRNA
unirse a más de un codón (dolor de base "relajado" / inadecuado entre 3 bases de codn
y anticodón)

D. aminoacil tRNA sintetasas *: "cargar" el aminoácido adecuado en el tRNA adecuado = activación de aminoácidos. 20 transferasas diferentes para 20 aminoácidos diferentes / aminoácido de ARNt x + ATP + ARNtx -> ARNtx: aminoácido x + AMP + 2 P * "ARNt cargado" o "aminoácido activado"

E. Ribosomas: 70S en procariotas. 2 subunidades 30S (subunidad pequeña) + 50S (subunidad grande) S = Unidad Svedberg, se usa para expresar tasas de sedimentación, ultracentrifugación

hecho de ARNr y proteínas ribosomales. "Workbench" en el que se realizará el ARNm
traducido en un polipéptido. 16s rRNA se une a RBS (sitio de unión ribosomal en mRNA). 23s rRNA actúa como ribozima, forma enlaces peptídicos entre aminoácidos
Sitios E, P y A.

F. Mecánica de la traducción: texto. El GTP se hidroliza durante la traducción.

Iniciación de la traducción (nota: el tRNA-f met puede unirse primero a la subunidad 30S antes de que la subunidad 30S se una
RBS)

1. La subunidad 30S reconoce el sitio de unión ribosómico de la secuencia RBS / Shine-Dalgarno.
Complementario a la secuencia de rRNA 16s del ribosoma.
2. La traducción comienza en el codón de inicio AUG más cercano al sitio de unión ribosomal
3. Un ARNt iniciador: la metionina (más precisamente una formil metionina en las bacterias) ingresa
el sitio de unión "P" o peptidilo del ribosoma. Un tRNA encaja en el sitio de unión
cuando sus pares de bases anticodón con el codón de ARNm
4. La subunidad ribosómica 50S más grande se une al complejo.
5. Se requieren proteínas adicionales llamadas factores de iniciación para llevar todos los componentes
juntos

Elongación de traducción: los aminoácidos se agregan uno por uno al primer aminoácido. Proteína adicional
factores de alargamiento necesarios

1. Un segundo ARNt debidamente cargado ingresa al sitio de unión "A" o aminoacilo del
ribosoma, que lleva el siguiente aminoácido.
2. Formación de enlaces peptídicos. El ARNr 23s de una subunidad grande cataliza la formación de péptidos
enlace entre el aminoácido en el sitio P y el aminoácido en el sitio A (el ARNr actúa como una "ribozima", catalizador de ARN)
-el aminoácido del tRNA en el sitio P se transfiere al enlace de aminoácidos del tRNA en el sitio A
3. Ahora el ribosoma se mueve "corriente abajo" por un codón. El dipéptido portador del ARNt ahora está en el sitio P, el sitio A está vacío.
4. Un nuevo ARNt cargado de aminoácidos apropiadamente ingresa al sitio A
5. El ribosoma cataliza la formación de enlaces peptídicos entre el dipéptido y el nuevo entrante
aminoácidos. El tripéptido es transportado por tRNA en el sitio A
6. Translocación:
7. Requiere energía (GTP)

Terminación de la traducción

1. El ribosoma alcanza uno de los 3 codones sin sentido / codones de parada: UAA, UGA, UAG
2. El factor de liberación se une a un sitio, hace que el polipéptido y el ribosoma se liberen de
ARNm (por activación de ribozima)

G. El ARNm policistrónico en procariotas permite la expresión génica coordinada en procariotas

El ARNm codifica más de un gen, por lo que los ribosomas pueden producir de manera coordinada varios
diferentes proteínas. Por ejemplo, 3 genes para proteínas involucradas en el transporte / metabolismo de lactosa en E. coli son
transcrito en una sola molécula de ARNm. Los ribosomas traducen los 3 en proteínas al mismo tiempo
H. Transcripción y traducción simultáneas solo en procariotas. Los ribosomas pueden unirse
ARNm y comenzar la traducción antes de que finalice la transcripción. Muy eficiente. Higo ____

Parte 2

Genética microbiana: ADN polimerasa, ARN polimerasas. Transcripción

Comparar y contrastar ADN polimerasas bacterianas y ARN polimerasas

Nota: ss = hebra sencilla ds = hebra doble P = fosfato

Visión general:

Las ADN polimerasas sintetizan ADN complementario utilizando una plantilla / guía de ADN

___________________ADN

Secuencia de bases de plantilla Ex ssDNA: A T A G G C

Secuencia de ADN complementaria T A T C C G ADN

sintetizado por ADN polimerasa

Las ARN polimerasas sintetizan secuencias de ARN complementarias utilizando ADN como plantilla / guía

___________________ADN

Secuencia de bases de plantilla Ex ssDNA: A T A G G C

Secuencia de ARN complementaria U A U C C G ARN

sintetizado por ARN polimerasa

La síntesis de ADN y ARN requiere la entrada de energía, tanto ATP como precursores cargados (ver más abajo)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ADN polimerasa ARN polimerasa

Plantilla / guía ss DNA ssDNA

Sintetizar ADN complementario ARN complementario

Precursores cargados desoxiadenosina tri-P = dATP adenosina tri-P = ATP

desoxitimidina tri-P = dTTP uridina tri-P = UTP

desoxicitodina tri-P = dCTP citodina tri-P = CTP

desoxiguanosina tri-P = dGTP guanosina tri-P = GTP

se requiere imprimación? sí No

revisión / edición? Sí No

-------------------------------------------------------------------------------------------------

* Corrección / edición de ADN polimerasa

Las polimerasas tienen una tasa de error "normal" o "intrínseca" de aproximadamente

10 -4 – 10 -5 nucleótidos (esto significa que las polimerasas introducen el nucleótido incorrecto cada 10.000 a 100.000 nucleótidos). Las ADN polimerasas tienen la capacidad de "corregir y editar" sus errores. Si introducen el nucleótido incorrecto, pueden eliminar o "escindir" el nucleótido incorrecto y volver a intentar hacer una coincidencia correcta. Esto reduce la tasa de error de las ADN polimerasas a aproximadamente 10-9 – 10 -10 (o solo un nucleótido incorrecto cada 1,000,000,000 - 10,000,000,000 nucleótidos). La ARN polimerasa no puede corregir o editar su trabajo, por lo que la ARN polimerasa comete muchos errores (una de las razones por las que muchos virus de ARN, por ejemplo el VIH, mutan tan rápidamente ... más tarde)

Transcripción Procariota sección repetida

Revisar el flujo de información en la celda

ADN --------> ARN ---------> Proteína

replicación transcripción traducción

I. Codigo genetico: relación uno a uno entre un codón específico (secuencia específica de 3 bases) y un aminoácido

II. Transcripción: uso de ADN como plantilla / guía para sintetizar ARN complementario. La información del ADN se reescribe en la secuencia de ARN.

UNA. ARN mensajero = ARNm: se traducirá en una secuencia de aminoácidos específica de una proteína

2. transferencia de ARN = ARNt: molécula "traductora" real, reconoce tanto un codón específico como un aminoácido específico

3. ARN ribosómico = ARNr: combinado con proteínas ribosomales, formará el ribosoma, el "banco de trabajo" en el que el ARNm se traduce en una secuencia de aminoácidos / polipéptido / proteína específicos

III. Promotores y ARN polimerasas

  1. Promotores: secuencias de ADN específicas que señalan los puntos de "inicio" de la transcripción de genes. El factor sigma / subunidad de la ARN polimerasa se une a los promotores para iniciar la transcripción.

B. Polimerasas de ARN: complejo enzimático que reconoce los promotores de ADN, se une al promotor y sintetiza una copia de ARN complementaria utilizando ADN como plantilla / guía

1. coli Polimerasa de ARN: 2 subunidades, subunidad sigma y núcleo

una. subunidad sigma / factor= "Cerebros" de la ARN polimerasa. Viaja a lo largo del ADN hasta que alcanza un promotor, se une al promotor

B. Sintetiza ARN en 5 '-to-> 3', similar a la ADN polimerasa. Sin capacidad de revisión por lo tanto cometerá más errores que la ADN polimerasa

C. ARNm policistrónico (prok. solamente)

IV. Terminación de la transcripción

  1. terminadores: Secuencias de ADN que señalan señales de parada de la transcripción. La ARN polimerasa libera ADN cuando se encuentra la secuencia del terminador de la transcripción

Parte 3

Genética microbiana

Regulación procariota de la expresión genética

Regulación de la transcripción: Operones y operadores

Vocabulario

genes estructurales: genes que codifican información para una proteína

"Expresión genética" = transcripción (+ traducción al describir genes estructurales)

-para nuestra discusión en clase, asumiremos que cuando se transcribe un gen estructural, el ARNm se traducirá en proteína por lo tanto, la "expresión génica" da como resultado la producción de proteínas

-ase = final común para las enzimas

lactosa: también llamado "azúcar de la leche", la lactosa es un disacárido de glucosa y galactosa unido por un glucosídico

vínculo. lactosa = galactosa-glucosa

promotor: Secuencia especial de ADN a la que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

operón: Secuencia de ADN que codifica sitios promotores y operadores y genes estructurales que controlan.

operador: Secuencia especial de ADN a la que se pueden unir las proteínas represoras para bloquear la transcripción del ARN.

polimerasa; el interruptor "on-off" para la transcripción

proteínas alostéricas: proteínas que pueden tener 2 formas diferentes

laca proteína represora: una proteína alostérica que tiene 2 formas:

  1. una forma activa en el que el represor enlazar con el operador lac y bloquea la transcripción de los genes estructurales del operón lac cuando la lactosa está ausente y …
  2. ... una forma inactiva que no poder vincular el operador lac. La forma inactiva es dominante cuando la lactosa está presente y la alolactosa inductora se une a la proteína represora lac.

Notas introductorias de supervivencia:

La expresión génica y la síntesis de proteínas son costosas para las células (requiere muchos "componentes básicos" y

energía.

(De Bauman) ... la mayoría de los genes bacterianos son expresado constantemente = expresión constitutiva. Estos genes incluyen genes para ARNt, ARNr y genes estructurales para proteínas que se necesitan constantemente, por ejemplo, proteínas ribosómicas y enzimas utilizadas en la glucólisis.

Sin embargo, algunos productos genéticos pueden ser necesarios solo en determinadas condiciones. Por ejemplo, el gen que codifica la enzima beta-galactosidasa solo necesita expresarse si lactosa está presente en el medio ambiente. La beta-galactosidasa es el equivalente bacteriano de la "lactasa" humana. Cataliza la hidrólisis del enlace glicosídico entre los residuos de glucosa y galactosa en el azúcar de la leche, lactosa:

Lactosa-> beta-galactosidePlaza bursátil norteamericana -> glucosa + galactosa

Las bacterias que pueden activar y desactivar la transcripción de genes como la beta-galactosidasa tendrán una ventaja de supervivencia sobre otras bacterias que no pueden regular la expresión génica (¿Por qué?)

Regulación de la expresión génica bacteriana: control de la transcripción

1. 3 tipos de expresión genética

-constituyente: transcripción continua (y síntesis continua de proteínas codificadas)

-inducible: fabricado solo cuando el sustrato o la molécula de señal están presentes ex enzimas para el transporte / metabolismo de lactosa en E. coli

-represible: producido solo cuando la molécula señal es escasa

2. Operón: grupo de genes cuya transcripción se activa o desactiva coordinadamente; bajo el control del operador y promotor

3. Operador: secuencia de ADN específica que se encuentra entre el promotor y el primer codón del gen. Las proteínas represoras se unen al operador y bloquean la capacidad de la ARN polimerasa para unirse al promotor / transcribir genes estructurales "aguas abajo". Las proteínas represoras son proteínas alostéricas. Tienen un sitio de unión para una secuencia de operador de ADN y un segundo sitio de unión para una molécula "inductora", p. Ej. alolactosa en el laca operón (o una molécula "correpresora", p. ej. trp operón)

C. Operones inducibles. La transcripción génica se activa solo cuando está presente el sustrato / señal. Por lo general, genes para enzimas catabólicas, ejemplo: E. coli laca operón. Jacob y Monod 1961

1. El operón Lac consta de 3 genes estructurales (lacZ, Y y A), promotor y operador.

El operón Lac es inducible.

Producto genético estructural (enzima / proteína de transporte)

lacZ beta-galactosidasa

de encaje proteína de transporte de lactosa / galactósido permeasa

laca galactósido transacetilasa

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

2. Gen regulador / represor, lacI

LacI es el laca proteína represora.

La proteína represora lac es una proteína de unión al ADN, que cuando está activa puede unirse al operador lac, bloqueando la transcripción / expresión de lacZ, Y y A en ausencia de lactosa (nota de supervivencia: sería un desperdicio para la bacteria producir estas proteínas si la lactosa no está presente). El gen represor Lac tiene su propio promotor y se expresa constitutivamente. El gen represor lac NO es parte del operón lac

3. operón lac cuando NO HAY LACTOSA DISPONIBLE (relleno de dibujos animados a continuación, las líneas de puntos dobles representan una sola hebra de ADN)

ADN ___________________________________________________________

------------------------------------------------------------------------------------------------

lac I Promotorlaca Operadorlaca lacZ lacY lacA

¿Cómo debería verse tu caricatura?

La proteína represora lac se une al operador lac en ausencia de lactosa, bloquea la transcripción de los genes lac por la ARN polimerasa. Nota: toda represión es "con fugas", es decir, el represor se une y libera al operador de una manera dependiente de la concentración. Cuando no hay lactosa, la mayoría de las proteínas represoras están en forma activa, bloqueando la mayor parte (pero no toda) de la transcripción de los genes estructurales de lac)

4. AÑADIR LACTOSA: (¿En qué se diferencia su caricatura de la anterior?) Lactosa-> inductor alolactosa se une al sitio alostérico en el represor lac, hace que cambie de forma, por lo que ya no puede unirse al operador.

ADN ___________________________________________________________

------------------------------------------------------------------------------------------------

lac I Promotorlaca Operadorlaca lacZ lacY lacA

ADN ___________________________________________________________

------------------------------------------------------------------------------------------------

lac I Promotorlaca Operadorlaca lacZ lacY lacA

5. Ahora la ARN polimerasa puede comenzar a transcribir los genes lac y la célula puede producir proteína de transporte y beta-galactosidasa, la célula comienza a transportar y descomponer la lactosa a un ritmo elevado.

6. Cuando se agota la lactosa, los niveles de alolactosa caen / liberan el represor lac, el represor recupera su forma, se une al operador, desactiva la transcripción del gen lac

ADN ___________________________________________________________

------------------------------------------------------------------------------------------------

lac I Promotorlaca Operatorlac lacZ lacY lacA

Que pasaria si…..

Y si….

E. coli tenía una mutación de modo que el represor lac no podía unirse al ADN?

““ Tuvo una mutación para que la proteína represora lac mutante NO pudiera unirse a la alolactosa, el inductor?

"" Tenía una mutación de modo que el operador no podía unirse a la proteína represora lac normal?

Sección eliminada de semestres anteriores:

I. Regulación del metabolismo: 2 formas.

A. Cambiar la actividad de las enzimas: sitios alostéricos / enzimas alostéricas

1.Los sitios de unión distintos del sitio activo = sitios alostéricos, se unen a los "efectores"

2. la unión del efector cambia la forma tridimensional de la enzima

3. 2 tipos de efectores:

una. Activadores alostéricos: se unen al sitio alostérico, cambian la enzima para que esté MÁS ACTIVA / encendida / activa la enzima

B. Inhibidores alostéricos: se unen al sitio alostérico, cambian la forma de la enzima para que sea menos activa / desactivada / inhibe la enzima

ej: inhibición del producto final

4. Proporciona una respuesta rápida a los cambios en los sustratos, la necesidad de productos finales.

B. Cambiar la expresión de genes que regulan la transcripción (o incluso la traducción)

Mutaciones

Evolución y selección natural

Unidad y diversidad de vida

Todos los organismos celulares comparten ciertos rasgos como resultado de compartir (o "descender de") un ancestro común (las primeras células procariotas primitivas). Sin embargo, la increíble diversidad de organismos vivos es asombrosa. ¿Cómo surgió tal diversidad?

La diversidad de la vida se explica por la evolución, un cambio en la composición genética de una población de organismos.

La "materia prima" de la evolución es la variabilidad genética, las diferencias genéticas entre los individuos de una población de organismos. ¿Cómo surge la variabilidad genética?

La variabilidad genética surge a través de mutaciones aleatorias, cambios en la secuencia de ácidos nucleicos de los organismos, transferencia horizontal de genes en microbios y recombinación sexual.

Mutaciones aleatorias: estas mutaciones generalmente ocurren cuando las enzimas que copian la información genética antes de que una célula se divida cometen un error. A modo de ejemplo, la enzima ADN polimerasa debería copiar la secuencia de ADN a continuación con precisión.

Abreviaturas de bases de ADN:

A = adenina T = timina G = guanina C = citosina

Información genética original, secuencia de bases de ADN de ADN bicatenario

A-T- C- G- G

T- A- G- C- C

ADN original

La ADN polimerasa debe hacer una copia precisa del ADN antes de que la célula se divida, de modo que cada célula "hija" reciba una copia precisa de la información genética de la célula madre:

A-T- C- G- G

T- A- G- C- C copia 1

A-T- C- G- G /

T- A- G- C- C ---  Copias de ADN polimerasa

ADN original A-T- C- G- G

T- A- G- C- C

copia 2

Cuando la célula original se divide, ambas células "hijas" recibirán una copia del ADN, copias exactas del ADN de la célula "madre".

Una fuente de variabilidad genética ocurre cuando la ADN polimerasa comete un error al copiar el ADN original como se muestra a continuación:

A-T- C- G- G

T- A- G- C- GRAMO* ,<-mistake = mutación copia 1

A-T- C- G- G /

T- A- G- C- C ---  Copias de ADN polimerasa

ADN original A-T- C- G- G

T- A- G- C- C

copia 2

En este caso, la ADN polimerasa cometió un error en la copia n. ° 1 (en lugar de una "C", utilizó una "G"). Esta es una mutación, un cambio en la secuencia del ADN. Como resultado, el gen mutado podría codificar información para una variedad diferente de proteína. Esta proteína diferente podría cambiar alguna característica de la "célula hija" que recibe la copia del ADN mutante. Este organismo mutante podría ser un mejor competidor en comparación con el miembro "normal, no mutante" de su población (o el mutante podría ser menos capaz de competir con sus colegas "normales").

Si los recursos son limitados, las "variantes" o mutantes que son mejores competidores sobrevivirán en mayor número que sus vecinos no mutantes. Los mutantes tendrán más descendencia que los miembros no mutantes de la población, que son competidores más débiles. La mutación que permitió a la variante competir mejor se transmitirá a su descendencia. Con el tiempo, la forma mutante de la información genética será transportada por una mayor proporción de la población superviviente, otra forma de decir que la frecuencia del gen mutante aumenta en la población. Por lo tanto, el acervo genético o la composición genética de la población ha cambiado con el tiempo y la población de organismos ha "evolucionado" (y la población se adapta mejor al medio ambiente con el tiempo).

Este mecanismo anterior que describe "cómo" ocurre la evolución se llama "selección natural", un concepto desarrollado por Charles Darwin y Alfred Wallace en el siglo XIX. (Darwin y Wallace no fueron los primeros en describir la evolución, pero fueron los primeros en describir el proceso de selección natural).

La explicación de Darwin y Wallace de la evolución por selección natural se basa en cinco suposiciones (fuente: Keeton and Gould’s Biology 4th edition, Norton Publishers)

1. En cada generación nacen muchos más individuos de los que sobrevivirán y se reproducirán (limitación de los recursos ambientales, competencia por los recursos)

2. Existe variación entre los individuos de una población.

3. Los individuos con ciertas características tienen más posibilidades de sobrevivir y reproducirse que los individuos con otras características.

4. Algunas de las diferencias que dan como resultado la supervivencia y la reproducción diferenciales son hereditarias.

5. Se ha dispuesto de un gran lapso de tiempo para realizar cambios

Selección natural vs selección artificial

Cuando la "naturaleza" elige qué variantes compiten mejor por los recursos naturales y, por lo tanto, sobrevivirán y se reproducirán a tasas más altas que otras variantes, se producirá la "selección natural". Sin embargo, si los seres humanos crían organismos selectivamente por rasgos específicos, o si los seres humanos cambian intencionalmente el medio ambiente (por ejemplo, mediante el uso excesivo de antibióticos), se produce la "selección artificial". El uso excesivo / indebido de antibióticos en todo el mundo ha seleccionado artificialmente un número creciente de bacterias resistentes a los antibióticos.

Evolución de bacterias resistentes a los antibióticos

Dado que las bacterias se reproducen tan rápidamente, sus poblaciones no necesitan "grandes períodos de tiempo" para evolucionar. La resistencia a los antibióticos puede evolucionar en unos pocos años (incluso en unas pocas semanas) dentro de algunas poblaciones de bacterias.

Evolución de cepas variantes de virus ARN: VIH e influenza

Todos los organismos celulares tienen ADN como información genética. La enzima que copia el ADN, las ADN polimerasas, tienen "alta fidelidad", es decir, estas enzimas cometen relativamente pocos errores porque tienen la capacidad de "editar o corregir" su trabajo y corregir muchos de sus errores. Las tasas de error de la ADN polimerasa son aproximadamente un nucleótido incorrecto por 108-109 nucleótidos.

Por el contrario, algunos tipos de virus (patógenos acelulares) utilizan ARN como su información genética. Las enzimas que copian el ARN, las ARN polimerasas, carecen de la capacidad de corregir errores, por lo que las ARN polimerasas tienen una tasa de error muy alta (un nucleótido incorrecto cada 104-105 nucleótidos). En consecuencia, muchos virus de ARN, como el virus de la influenza y el VIH, tienen tasas de mutación muy altas, por lo que las “poblaciones” de virus de la influenza y el VIH evolucionan rápidamente. La alta tasa de mutación de estos virus da como resultado una rápida resistencia a los medicamentos y enormes desafíos en la producción de vacunas.

Selección natural en pocas palabras

1. Cada especie produce más descendencia de la que puede sobrevivir.

2. La descendencia compite entre sí por recursos limitados

3. Los organismos de cada población varían

4. Los organismos con características / variaciones más favorables tienen más probabilidades de sobrevivir y producir más descendencia.

Resultado:… ..en consecuencia, los genes variantes se "propagan" a través de la población a lo largo del tiempo, la composición genética de los cambios de población y los cambios / evoluciona de la población con el tiempo = "Evolución"

Transferencia horizontal de genes en bacterias

Transferencia de material genético entre procariotas: transformación, transducción, conjugación

I. Recombinación genética y recombinación homóloga un intercambio de secuencias de ADN mediante cruzamiento permite la integración de ADN homólogo "extraño" en el cromosoma del huésped bacteriano. Reemplaza los alelos bacterianos con alelos "extraños".

1. El ADN cromosómico homólogo monocatenario "extraño" se alinea con las secuencias homólogas del ADN cromosómico bacteriano del huésped.

2. Fragmento de ADN del ADN del hospedador escindido, reemplazado por una secuencia de ADN extraña: altera el genotipo de las células (el alelo "nativo" se reemplaza por un alelo extraño)

3. Requiere muchas enzimas, incluidas las enzimas / proteínas de recombinación, nucleasas, ligasas

II. Transformación: captación de ADN "desnudo" del medio ambiente por parte de células bacterianas competentes.

1. ADN plasmídico o ADN cromosómico

2. Algunas cepas bacterianas naturalmente competentes. Las proteínas de superficie especiales reconocen y absorben ADN desnudo estrechamente relacionado del medio ambiente (recuerde los experimentos de Griffith con Streptococcus pneumoniae). Otras cepas bacterianas pueden volverse competentes mediante el tratamiento con productos químicos (por ejemplo, frío + tratamiento con cloruro de calcio utilizado en el laboratorio para crear células competentes de E. coli; absorción permitida de ADN plasmídico bicatenario)

3. Streptococcus pneumoniae competente permite el paso de ADN monocatenario a través de la membrana celular (la segunda cadena suele estar degradada).

4. Cuando la célula competente se transforma con ADN, las células se denominan "transformantes". El ADN cromosómico puede sufrir recombinación genética con ADN bacteriano si están presentes secuencias homólogas.

III. Transducción. Proceso de transferencia de ADN en el que los bacteriófagos transportan el ADN de una bacteria a otra. 2 tipos: generalizado y especializado.

1. Transducción generalizada:(genes bacterianos transferidos al azar) Recuerde el ciclo reproductivo lítico. Hacia el final del ciclo, el ADN cromosómico bacteriano se empaqueta accidentalmente en cabezas / cápsides de fagos en lugar de ADN de fagos. Esto crea un fago defectuoso ya que carece de su propio material genético, pero aún puede ser liberado, adherirse a una nueva bacteria e inyectar el ADN en una nueva bacteria huésped. Este ADN puede reemplazar la región homóloga del cromosoma bacteriano. La célula bacteriana ahora lleva ADN recombinante.

2. Transducción especializada (solo se transfieren genes bacterianos específicos). Requiere bacteriófago templado. El ADN del fago se integra en el cromosoma bacteriano del hospedador, generalmente en un sitio específico. Posteriormente, el profago puede inducirse a entrar en el ciclo lítico. Cuando el profago se escinde del cromosoma, a veces se extrae un pequeño tramo de ADN bacteriano adyacente. Los genes bacterianos se empaquetan con ADN de fagos y se inyectan en un nuevo huésped bacteriano.

IV. Conjugación. Transferencia directa de material genético entre 2 bacterias que se unen temporalmente. El modelo usa E. coli (las bacterias gram positivas usan un proceso ligeramente diferente).

1. Transferencia unidireccional de ADN: la célula donante (macho) transfiere material genético a la célula receptora (hembra)

2. El macho usa apéndices de proteínas, pili sexuales huecos, para adherirse a la hembra

3. Se forma un puente citoplásmico temporal entre 2 células, lo que proporciona un camino para la transferencia de ADN.

4. La "masculinidad", la capacidad de formar pili sexuales y transferir ADN durante la conjugación, resulta de la presencia de una secuencia de ADN especial llamada factor F = factor de fertilidad. El factor F puede existir integrado en el cromosoma o como plásmido, por lo tanto es un episoma (episoma = elemento genético que puede replicarse como plásmido o como parte de un cromosoma bacteriano; los virus templados como lambda también califican como episomas).

5. Los plásmidos de memoria son elementos de ADN extracromosómicos, autorreplicantes, que por lo general portan genes "extra". Estos genes pueden conferir ventajas de supervivencia para las bacterias que viven en condiciones estresantes. Por ejemplo, los "plásmidos R" son plásmidos que llevan genes de resistencia a los antibióticos y permiten que las células huésped sobrevivan en presencia de la presión de los antibióticos.El factor F facilita la recombinación genética, lo que podría ser ventajoso en un entorno cambiante que ya no favorece las cepas de bacterias existentes (Campbell, Biology 5th ed)

6. Plásmido F: El factor F en su forma de plásmido se llama plásmido F. Consta de aprox. 25 genes, la mayoría involucrados en la producción de pilus sexuales.

una. Las células F + (machos) contienen plásmido F; El plásmido F generalmente se replica y pasa a las células hijas. La condición F + es "contagiosa" ya que puede transmitirse a las células femeninas, convirtiéndolas en machos F + después de la conjugación.

B. Las células F (hembras) carecen de plásmido F

C. El plásmido F se replica en el macho y una copia se pasa a la hembra, convirtiéndola en macho F +. Solo la copia del plásmido F se transfiere durante la conjugación F + x F-

7. Transferencia de genes bacterianos y de Hfr durante la conjugación

una. si el factor F está integrado en el cromosoma bacteriano, la bacteria se denomina célula Hfr (alta frecuencia de recombinación)

B. Hfr actúa como un macho, forma pilus sexuales, copia el factor F, comienza a transferir la copia de F a la pareja F, pero ahora el factor F también lleva consigo una copia de parte del ADN cromosómico bacteriano.

-temporalmente, la hembra es diploide hasta que se produce la recombinación genética y se intercambian segmentos de ADN (el ADN extirpado se degrada)

-La hembra se convierte en célula recombinante; Por lo general, el apareamiento se interrumpe antes de que se transfiera el cromosoma completo y el factor F, por lo que generalmente sigue siendo mujer.

V. Plásmidos de resistencia y transposones

1. R = plásmidos de resistencia, portan genes de resistencia a antibióticos y / o resistencia a metales pesados, p. ej. resistencia al mercurio. Ejemplo de enzimas para destruir antibióticos. Las betalactamasas destruyen el anillo betalactámico de penicilina, ampiciilina y antibióticos relacionados, genes de mercurio reducatasa.

2. Los plásmidos R pueden portar múltiples genes de resistencia a los antibióticos y pueden copiarse y transferirse entre bacterias mediante conjugación y transformación.

3. Algunos plásmidos R llevan 10 genes de resistencia a antibióticos; pensamiento evolutivo vinculado a los transposones

4. Transposones son elementos genéticos transponibles, fragmentos de ADN que pueden moverse de un lugar a otro (los "genes saltarines" de Barbara McClintock en los años 40-50; premio Nobel 1983 a los 81 años). Algunos dicen que los transposones ("Tn") nunca existen de forma independiente, algunos Tn grampositivos pueden violar esta regla.

5. Los transposones pueden haber movido múltiples genes de resistencia a antibióticos a plásmidos R

6. Secuencias de inserción (IS): los transposones más simples. Lleva 1 gen solo para la enzima transposasa entre corchetes por repeticiones invertidas, al revés, versiones al revés entre sí. La transposasa se une a las repeticiones invertidas y reconoce los sitios de destino. La transposasa corta las secuencias objetivo e inserta IS. "Cortar y pegar transposición"

7. Transposones compuestos: genes adicionales, por ejemplo, para resistencia a antibióticos en sándwich entre 2 IS. Probablemente involucrado en la evolución de plásmidos R

Hoja de trabajo de mutaciones

Lea el capítulo 8 Tortora p; vea el final del folleto para un buen sitio web y algunas notas resumidas

1. ¿Qué es una mutación?

2. Describa lo siguiente y proporcione un ejemplo específico de cada uno:

una. mutación puntual / sustitución de bases

B. mutación silenciosa / neutra

C. mutación sin sentido

D. mutación sin sentido

mi. mutaciones de cambio de marco

3. ¿Cuál de las mutaciones enumeradas anteriormente es potencialmente más dañina para las células? ¿Por qué?

4. a. ¿Qué son las “mutaciones espontáneas”?

B. ¿Cuál es la tasa aproximada de mutación espontánea en una célula?

C. Por el contrario, ¿cuál es la tasa aproximada de mutación espontánea en un virus de ARN?

5. Al replicar el ADN, las células tienen 2 formas iniciales de "corregir errores", la edición / corrección y la reparación de desajustes. Describe cada uno a continuación

una. edición / corrección de pruebas

B. reparación de desajustes.

- en la reparación de desajustes, ¿cómo saben las enzimas de reparación cuál es la hebra de plantilla correcta y qué hebra debe repararse? (respuesta: la hebra de plantilla "más antigua" estaría metilada, consulte la descripción de metilasas en la p. 231. La hebra recién sintetizada no estaría metilada (todavía). Las enzimas reparadoras (llamadas "exinucleasas" o más generalmente "endonucleasas”) En consecuencia, se corta la parte de la hebra sin metilar que no se empareja correctamente con la hebra de plantilla metilada. Luego, la ADN polimerasa I se reemplaza con el ADN correcto, la ligasa une covalentemente la sección reparada con el resto de la cadena de ADN)

5. ¿Qué son los mutágenos?

Radiación como mutágeno p230

6. ¿Qué es la radiación no ionizante? ¿Radiación ionizante?

7. El ADN absorbe al máximo la radiación electromagnética de longitud de onda λ = _____nm. (respuesta λ = 260 nm)

8.Cómo radiación ultravioleta (UV) causar daño al ADN? Dibuja y rotula una caricatura para ayudar a ilustrar tu respuesta. Dibuje y rotule dímeros de timina

9. Las células bacterianas tienen 3 formas de reparar el daño del ADN causado por la irradiación UV, específicamente reparando los dímeros de timina. Describa cada uno a continuación (vea las notas al final del folleto).

una. reparación de luz / fotorreactivación por fotoliasa: El enlace covalente del dímero de timina se hidroliza en presencia de luz.

B. reparación oscura = reparación por escisión de nucleótidos (utilizada para reparar una amplia gama de daños en el ADN)

El dímero de -timina y los nucleótidos circundantes se cortan / escinden, el espacio se llena con ADN polimerasa I y se une mediante ligasa.

C. Respuesta SOS: reparación altamente propensa a errores ("último esfuerzo" para prevenir la muerte celular en bacterias)

10 ¿Qué es el “Prueba de Ames”?

11. Explique cómo las mutaciones pueden provocar resistencia a los antibióticos.

12. Las mutaciones humanas pueden aumentar la resistencia a algunas enfermedades infecciosas. Los seres humanos que portan el gen mutante, el “alelo de células falciformes”, pueden ser más resistentes a la muerte causada por _____________- y los seres humanos que portan el alelo de fibrosis quística pueden ser más resistentes a la muerte provocada por _________________ (rellene los espacios en blanco)

ver: http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch7G.htm

Mecanismos de reparación del ADN (del sitio arriba)

Sistema de reparación

Enzimas / Proteínas

notas

"Edición / corrección de pruebas"

Polimerasas de ADN

Reparación de desajustes (repara bases no coincidentes no corregidas mediante revisión)

-Dam metilasa, proteínas Mut, exonucleasa, ADN polimerasa I, ADN ligasa

Inmediatamente después de la replicación, la hebra de ADN molde ha sido metilada (por Represa metilasa en E. coli), pero la hebra recién sintetizada aún no está metilada. Por lo tanto, se pueden distinguir la hebra plantilla y la nueva hebra.

Reparación de ADN dañado / alterado

-Reparación de bases dañadas / alteradas = "Escisión de base"

Las bases de ADN pueden modificarse / alterarse mediante desaminación o alquilación. En E. coli, ADN glicosilasas puede reconocer bases alteradas y cortar bases solamente, creando un “sitio básico” llamado sitio AP. Endonucleasas AP eliminar el nucleósido en el sitio AP y los nucleótidos circundantes, el espacio se rellena con ADN polimerasa I y terminado por ADN ligasa

Reparación del ADN dañado

Daño por rayos UV, dímeros de timina

"Reparación ligera" / "fotorreactivación"

Reparación ligera, fotoliasa

Daño al ADN que causa distorsiones, p. Ej. Daño por rayos UV, dímeros de timina

"Reparación oscura" = nucleótido reparación de escisión

-Proteínas Uvr /endonucleasas (corte el dímero de timina + 12 nucleótidos), ADN polimerasa I, ADN ligasa

Reparación SOS: respuesta hecha en una situación de "vida o muerte", activada cuando tanto daño en el ADN que se detiene la síntesis de ADN

Muy propenso a errores

Proteínas / enzimas SOS

Rec A: se une al ADN dañado para iniciar la reparación de la recombinación

ADN polimerasas IV / V (también llamadas "ADN mutasas"), que carecen de revisión y sintetizan ADN para llenar los espacios cuando falta la plantilla

Genera muchas mutaciones

actualización 1.3.2016 K. Carberry-Goh DVM, PhD Sac City College


Tipos de crecimiento que tienen lugar en las bacterias

El crecimiento diaúxico es un crecimiento difásico representado por dos curvas de crecimiento intervenidas por una fase de retardo corta producida por un organismo que utiliza dos sustratos diferentes, uno de los cuales es la glucosa. Cuando E. coli crece en un medio que contiene glucosa y lactosa, usa glucosa preferentemente hasta que se agota la glucosa.

Luego, después de una breve fase de retraso durante la cual la bacteria sintetiza las enzimas necesarias para el uso de lactosa, se reanuda el crecimiento con lactosa como fuente de carbono. Si este crecimiento difásico de E. coli se traza con respecto a la densidad bacteriana frente al tiempo, dos curvas de crecimiento siguen una tras otra intervenidas por una fase de retardo corta para producir una curva de crecimiento diaúxica o difásica (Fig. 19.3).

La enzima necesaria para el uso de lactosa es la β-galactosidasa, que divide la lactosa en glucosa y galactosa, y la bacteria utiliza la glucosa para su crecimiento. La galactosa también se puede utilizar, pero solo después de que se convierta en glucosa. Se ha demostrado que el crecimiento de E. coli en un medio que contiene tanto glucosa como galactosa produce una curva de crecimiento diaúxica (difásica) como en el caso de la glucosa y la lactosa.

Se ha encontrado una respuesta similar en el caso de otros azúcares como arabinosa, maltosa, sorbitol, etc. cuando se utilizan en combinación con glucosa por E. coli. Cada uno de estos azúcares se utiliza solo después de que se haya agotado la glucosa en el medio de crecimiento.

La causa del crecimiento diauxico (difásico) es compleja y no se comprende por completo, se considera que la represión de catabolitos o el efecto de la glucosa probablemente juegan un papel en ella. En la represión catabólica del operón lac de E. coli, la glucosa ejerce un efecto inhibidor sobre la transcripción de los genes lac.

Como resultado, las enzimas de utilización de lactosa no se sintetizan, incluso si la lactosa está presente en el medio. Cuando la glucosa es completamente consumida por E. coli, la bacteria ahora es competente para transcribir los genes del operón lac, lo que resulta en la producción de las enzimas necesarias que ayudan a metabolizar la lactosa.

Escribe # 2. Crecimiento sincrónico:

El crecimiento sincrónico de una población bacteriana es aquel durante el cual todas las células bacterianas de la población son fisiológicamente idénticas y se encuentran en la misma etapa del ciclo de división celular en un momento dado. El crecimiento sincrónico ayuda a estudiar etapas particulares o el ciclo de división celular y sus interrelaciones.

En la mayoría de los cultivos bacterianos, las etapas del ciclo de crecimiento y división celular son completamente aleatorias y, por lo tanto, resulta difícil comprender las propiedades durante el curso del ciclo de división utilizando tales cultivos. Para superar este problema, los microbiólogos han desarrollado técnicas de cultivo sincrónico para encontrar el crecimiento sincrónico de la población bacteriana.

El cultivo sincrónico es aquel en el que el crecimiento es sincrónico, es decir, todas las células bacterianas de la población son fisiológicamente idénticas y se encuentran en la misma etapa del ciclo de división celular en un momento dado.

Se puede obtener un cultivo sincrónico manipulando las condiciones ambientales, como cambiando repetidamente la temperatura o añadiendo nutrientes frescos a los cultivos tan pronto como entran en la fase estacionaria, o mediante la separación física de las células mediante centrifugación o filtración.

Un método excelente y más utilizado para obtener cultivos sincrónicos es la técnica de Helmstetter-Cummings (figura 19.4) en la que se filtra un cultivo bacteriano no sincronizado a través de un filtro de membrana de nitrato de celulosa.

Las células bacterianas débilmente unidas se lavan del filtro, dejando algunas células estrechamente asociadas con el filtro. El filtro ahora está invertido y se permite que fluya medio fresco a través de él.

Las nuevas células bacterianas, que se producen por división celular y no están ligeramente asociadas con el filtro, se lavan en el efluente. Por lo tanto, todas las células del efluente se forman nuevamente y, por lo tanto, se encuentran en la misma etapa del ciclo de crecimiento y división. Por tanto, el efluente representa una cultura sincrónica.

Escribe # 3. Crecimiento continuo: quimiostato y turbidostato:

A diferencia de los estudios en cultivo por lotes donde el crecimiento exponencial de la población bacteriana está restringido solo durante unas pocas generaciones, a menudo es deseable mantener un crecimiento exponencial prolongado de la población bacteriana para estudios genéticos y bioquímicos y en procesos industriales.

Esta condición se obtiene cultivando bacterias en un cultivo continuo, un cultivo en el que se suministran nutrientes y se eliminan continuamente los productos finales.

Por lo tanto, un cultivo continuo es aquel en el que la fase de crecimiento exponencial de la población bacteriana se puede mantener a una tasa constante (crecimiento en estado estable) durante un largo período de tiempo mediante el suministro continuo de medio fresco desde un depósito a la cámara de crecimiento y eliminando continuamente exceso de volumen de medio de cultivo de la cámara de crecimiento a través de un desbordamiento de sifón.

Al hacerlo, los microbios nunca alcanzan la fase estacionaria porque los productos finales no se acumulan para actuar como inhibidores del crecimiento y los nutrientes no se gastan por completo.

Los sistemas de cultivo continuo pueden funcionar como quimiostatos o turbidostatos. En un quimiostato (Fig. 19.5), la tasa de flujo se establece en un valor particular con la ayuda de un regulador de tasa de flujo y la tasa de crecimiento del cultivo se ajusta a esta tasa de flujo. Es decir, el medio estéril se introduce en el recipiente a la misma velocidad a la que se elimina el medio que contiene microorganismos.

En un turbidostato (Fig. 19.6), el sistema incluye un dispositivo sensor óptico (dispositivo fotoeléctrico) que monitorea continuamente la densidad del cultivo en el recipiente de crecimiento y controla la tasa de dilución para mantener la densidad del cultivo a una tasa constante. Si la densidad del cultivo se vuelve demasiado alta, la tasa de dilución aumenta y si es demasiado baja, la tasa de dilución disminuye.

El turbidostato se diferencia del quimiostato en muchos aspectos. La tasa de dilución en un turbidostato varía en lugar de permanecer constante y su medio de cultivo carece de un nutriente limitante. El turbidostato funciona mejor a altas tasas de dilución, mientras que el quimiostato es más estable y eficaz a bajas tasas de dilución.


Crecimiento de bacterias: 4 fases principales

La fase de retraso representa un período de crecimiento activo durante el cual las bacterias se preparan para la reproducción, sintetizando ADN, varias enzimas inducibles y otras macromoléculas necesarias para la división celular. Por lo tanto, durante esta fase, puede haber un aumento de tamaño (volumen) pero no un aumento en el número de células. La fase de retraso puede durar una hora o más, y cerca del final de esta fase, algunas células pueden duplicar o triplicar su tamaño.

La fase de retraso es necesaria antes del inicio de la división celular debido a una variedad de razones. Si las células se toman de un cultivo antiguo o de un cultivo refrigerado, es posible que las células sean viejas y carezcan de ATP, cofactores esenciales y ribosomas.

Si el medio es diferente de aquel en el que la población microbiana estaba creciendo anteriormente, las células necesitarían nuevas enzimas para utilizar nuevos nutrientes en el medio.

Sin embargo, estas deficiencias son satisfechas por las células durante la fase de retraso. Por lo tanto, la fase de retraso es generalmente más larga si las células se toman de un cultivo viejo o refrigerado. Por el contrario, si las células se extraen de un cultivo joven de crecimiento vigoroso (población microbiana) y se inoculan en un medio nuevo de composición idéntica, la fase de retardo puede ser corta o incluso estar ausente.

2. Fase de crecimiento logarítmico o exponencial:

Las células bacterianas preparadas para la división celular durante la fase de retraso entran ahora en la fase logarítmica o la fase de crecimiento exponencial durante la cual las células se dividen a una velocidad máxima y su tiempo de generación alcanza un mínimo y permanece constante.

El crecimiento en esta fase es bastante equilibrado (es decir, todos los constituyentes celulares se sintetizan a velocidades constantes entre sí), por lo tanto, los cultivos de fase logarítmica, los más uniformes en términos de propiedades químicas y fisiológicas, se utilizan generalmente en estudios bioquímicos y fisiológicos.

Dado que el tiempo de generación es constante, una gráfica logarítmica de crecimiento durante la fase logarítmica produce una línea casi recta. Esta fase se llama fase logarítmica porque el logaritmo de la masa bacteriana aumenta linealmente con el tiempo, y fase de crecimiento exponencial porque el número de células aumenta como una función exponencial de 2 n (es decir, 2 1, 2 2, 2 3, 2 4, 2 5 y así sucesivamente).

La fase logarítmica también representa el momento en que las células bacterianas son más activas metabólicamente y, en la producción industrial, este es el período de máxima actividad y eficiencia.

3. Fase estacionaria:

Dado que las bacterias crecen en un volumen constante de medio de cultivo por lotes y no se agregan nutrientes frescos, el crecimiento de la población bacteriana finalmente cesa y la curva de crecimiento se vuelve horizontal. Esta fase de crecimiento en bacterias se alcanza a un nivel de población de alrededor de 109 células por ml.

El cese del crecimiento puede deberse al agotamiento de los nutrientes disponibles o a la acumulación de productos finales inhibidores del metabolismo. El cese del crecimiento también puede deberse a O2 disponibilidad particularmente en el caso de aerobios. El oxígeno no es muy soluble y puede agotarse tan rápidamente que solo las células de la superficie del cultivo pueden encontrar la concentración de oxígeno necesaria para un crecimiento adecuado.

Tarde o temprano, las células bacterianas comienzan a morir y el número de tales células equilibra el número de células recién nacidas y la población bacteriana se estabiliza. Este estado de crecimiento, durante el cual el número total de células viables permanece constante debido a que no hay un aumento neto adicional en el número de células y la tasa de crecimiento es exactamente igual a la tasa de muerte, se denomina fase estacionaria.

La transición entre las fases logarítmica y exponencial y estacionaria implica un período de crecimiento desequilibrado durante el cual los diversos componentes celulares se sintetizan a ritmos desiguales. En consecuencia, las células en la fase estacionaria tienen una composición química diferente a las de la fase exponencial.

4. Fase de muerte o declive:

Después de un tiempo, la cantidad de células moribundas comienza a exceder la cantidad de células recién nacidas y, por lo tanto, la cantidad de células bacterianas viables presentes en un cultivo discontinuo comienza a disminuir.

Esta condición representa la muerte de la fase de declive que continúa hasta que la población se reduce a una pequeña fracción de células más resistentes, o puede morir por completo. Al igual que el crecimiento exponencial, la muerte también es exponencial, pero inversa, ya que el número de células bacterianas viables disminuye exponencialmente.


Psicrófilos

Los psicrófilos son los amantes del frío, con un óptimo de 15 o C o menos y un rango de crecimiento de -20 o C a 20 o C. La mayoría de estos microbios se encuentran en los océanos, donde la temperatura suele ser de 5 o C o más fría. . También se pueden encontrar en el Ártico y la Antártida, viviendo en el hielo dondequiera que puedan encontrar bolsas de agua líquida. Los organismos recuperados de los lagos árticos como el lago Whillans se consideran psicrófilos extremos. La adaptación al frío requirió la evolución de proteínas específicas, en particular enzimas, que aún pueden funcionar a bajas temperaturas. Estas enzimas son más flexibles que sus homólogos mesófilos y termófilos y tienen sitios catalíticos más accesibles para adaptarse a velocidades de difusión más lentas. Este aumento en la flexibilidad tuvo un costo, ya que las proteínas psicrófilas se desnaturalizan rápidamente por encima de su temperatura óptima. La adaptación al crecimiento a temperaturas más bajas también requirió la modificación de la membrana plasmática para mantenerla semifluida. Los psicrófilos tienen una mayor cantidad de ácidos grasos insaturados y de cadena más corta. Por último, los psicrófilos producen crioprotectores: proteínas o azúcares especiales que evitan el desarrollo de cristales de hielo dañinos.Los psicrotofos o microbios tolerantes al frío tienen un rango de 0-35 o C, con un óptimo de 16 o C o más. Se encuentran en muchos ambientes naturales en climas templados y son responsables del deterioro de los alimentos refrigerados. El patógeno humano Listeria monocytogenes es un ejemplo. Crece en las entrañas del ganado, puede contaminar la carne, la leche y los cultivos, pero a diferencia de los patógenos humanos mesófilos típicos, crece a temperaturas refrigeradas. Las infecciones transmitidas por alimentos son el resultado del consumo de alimentos listos para comer, como lechuga, quesos no pasteurizados y embutidos. Debido a que son activos a baja temperatura, los psicrófilos y los psicótrofos son importantes descomponedores en climas fríos. y sus enzimas son de interés para la biotecnología.


Crecimiento de bacterias (con diagrama) | Microbiología

En este artículo discutiremos sobre: ​​- 1. Definición de crecimiento 2. Medición del crecimiento bacteriano 3. Multiplicación de bacterias unicelulares 4. Determinación del tiempo de generación 5. Curva de crecimiento 6. Cultura continua 7. Cultivo sincrónico 8. Medios de cultivo 9. Cultura de enriquecimiento 10. Requisitos de macro y microelementos para el crecimiento 11. Factores físicos que influyen en el crecimiento.

  1. Definición de crecimiento
  2. Medición del crecimiento bacteriano
  3. Multiplicación de bacterias unicelulares
  4. Determinación del tiempo de generación
  5. Curva de crecimiento
  6. Cultura continua
  7. Cultura sincrónica
  8. Medios culturales
  9. Cultura de enriquecimiento
  10. Requisitos de macro y microelementos para el crecimiento
  11. Factores físicos que influyen en el crecimiento

1. Definición de crecimiento:

En biología, el crecimiento se define generalmente como un aumento irreversible de la masa celular debido a la síntesis activa de todos los componentes. El crecimiento da como resultado un aumento del número de células (excepto en organismos cenocíticos). En organismos multicelulares, este aumento en el número de células conduce a un aumento de tamaño, porque las células hijas permanecen juntas.

Por el contrario, en los organismos unicelulares, la multiplicación celular conduce a un aumento en el número de individuos en una población, es decir, el tamaño de la población. Entonces, para las bacterias, la mayoría de las cuales son organismos unicelulares, el crecimiento puede definirse como el aumento en el número de células en una población. Debe recordarse, sin embargo, que en las bacterias y otros organismos unicelulares también, una célula hija joven crece en tamaño antes de alcanzar una etapa en la que puede dividirse para completar un ciclo celular.

2. Medición del crecimiento bacteriano:

Dado que el crecimiento bacteriano da como resultado un aumento en el número y, por lo tanto, en el tamaño de la población, hay varias alternativas disponibles para su medición. La densidad celular, es decir, el número de células por unidad de volumen de medio, se puede determinar contando, midiendo la densidad óptica, estimando el peso seco o la proteína, etc. Algunos de estos son métodos directos y otros indirectos.

Una de las formas obvias de medir el crecimiento de una población en crecimiento en cultivo (cultivo de organismos en el laboratorio en medios en los que puedan crecer) es su recuento directo bajo el microscopio. El número de células en un volumen dado de cultivo se puede contar utilizando portaobjetos ranurados especialmente rayados similares a los que utilizan los técnicos médicos para el recuento de células sanguíneas.

La parte ranurada del tobogán tiene una profundidad y un área conocidas que se divide en varios cuadrados iguales. Estos portaobjetos se denominan cámaras de recuento, y se encuentran disponibles diferentes tipos, como Petroff-Hausser, Neubauer, Thoma, etc. (Fig. 7.1).

Se coloca una gota de la suspensión bacteriana en la ranura del portaobjetos, se cubre con un cubreobjetos, se presiona ligeramente para eliminar el exceso de líquido y se examina el portaobjetos bajo el objetivo de alta potencia de un microscopio de contraste de fase. El número de bacterias por cuadrado pequeño se cuenta para un número bastante bueno de cuadrados, promediado, y a partir de la media se calcula el número total de bacterias por ml de suspensión.

En la cámara de conteo de Petroff-Hausser, un área de 1 mm 2 se divide en 25 cuadrados iguales y la profundidad de la ranura es de 0,02 mm. Si el número de bacterias es demasiado alto para el recuento, el cultivo original puede diluirse adecuadamente y para calcular el recuento final se tiene en cuenta el factor de dilución. Las bacterias móviles deben inmovilizarse antes de transferirlas a la cámara de recuento.

El número de bacterias obtenidas mediante el procedimiento anterior da el recuento total. Es obvio que el recuento total incluye tanto células vivas como muertas. Las bacterias vivas o viables son capaces de producir células progenitoras por división.

En un medio nutritivo solidificado, una bacteria viable se divide y se vuelve a dividir para formar una gran cantidad de células de progenie para formar una colonia. Entonces, la capacidad de formar colonias es una prueba de viabilidad. Una bacteria muerta o inviable no puede formar una colonia bajo ninguna condición de crecimiento. El número de bacterias vivas por unidad de volumen de un cultivo o una población se conoce como su recuento viable.

El método seguido para determinar el recuento viable se basa en el principio de dilución en serie, primero desarrollado por Joseph Lister y luego perfeccionado por Robert Koch. Hay dos variaciones de la técnica de dilución en placas: los métodos de placa de extensión y placa de vertido. En el primer método, una cantidad medida de una muestra diluida en serie del cultivo original se esparce uniformemente sobre la superficie del medio de crecimiento solidificado.

Tras la incubación a una temperatura óptima, cada célula bacteriana viable forma una colonia discreta en la superficie del medio. Suponiendo que cada colonia visible es la progenie de una sola bacteria, el número total de colonias se toma como el número de células viables presentes en la cantidad de muestra diluida esparcida sobre el medio. Entonces, contando el número de colonias, el conteo viable se puede calcular fácilmente. Para obtener resultados fiables, es necesario un buen número de repeticiones.

El método se muestra esquemáticamente en la Fig. 7.2:

[Un ml de cultivo bacteriano que contiene

Se transfieren 10 7 - 10 9 células / ml asépticamente con una pipeta esterilizada a 9 ml de agua esterilizada o solución salina normal, se mezclan bien para obtener una suspensión uniforme. Luego, 1 ml de la dilución 1:10 del cultivo original se transfiere con una pipeta estéril nueva a otro tubo que contiene 9 ml de agua o solución salina normal para obtener una dilución 1: 100 (102).

El proceso continúa hasta que se alcanza una dilución de 10 -7. A continuación, se extienden uniformemente alícuotas de 0,1 ml de la dilución final o de las dos últimas diluciones con una varilla de vidrio doblada estéril sobre la superficie de las petriotas que contienen medio de agar adecuado. Tras la incubación, aparecen colonias de bacterias en las placas. Se cuenta el número de colonias en placas replicadas, se determina su media y se calcula el recuento viable, teniendo en cuenta el factor de dilución. En el ejemplo que se muestra en la figura, el recuento viable llega a 30,7 x 10 8 = 3,07 x 10 9 / ml.]

Para facilitar el recuento de colonias, se puede utilizar un instrumento llamado contador de colonias. Esencialmente, es una caja con una tapa inclinada que contiene un agujero circular de 10-12 cm de diámetro cubierto con un vidrio esmerilado. Hay arreglo para iluminación dentro de la caja.

Para facilitar el recuento de colonias pequeñas, se sujeta una lupa de aproximadamente el mismo diámetro que el del orificio en un soporte. Para contar el petridish se coloca en posición invertida sobre el vidrio esmerilado, se ilumina desde abajo y se observa a través de la lupa. Se puede usar un rotulador para registrar las colonias mientras se cuentan, de modo que la misma colonia no se cuente más de una vez.

La segunda variación del método de dilución en serie, la técnica de vertido en placa, es esencialmente similar a la técnica de dilución en placa, excepto que la suspensión celular diluida se mezcla con medio de agar fundido justo antes de verterla en las placas. La temperatura no debe ser tan alta como para matar bacterias ni tan baja como para que el agar comience a solidificarse.

El agar de buena calidad se endurece a una temperatura de aproximadamente 42 ° C, por lo que 45 ° -50 ° C es ideal para verter. En la incubación, las colonias aparecen primero en la superficie. Gradualmente, las bacterias atrapadas dentro del agar también forman colonias. Estas colonias tienen al principio forma de lente antes de emerger a la superficie. El número de colonias se puede contar como en el caso de placas esparcidas.

Los dos métodos anteriores se pueden aplicar solo para contar bacterias aeróbicas, pero no para bacterias anaeróbicas que no pueden crecer bajo una concentración normal de oxígeno en el aire. Para tales organismos, las placas de dilución deben incubarse en una atmósfera libre de oxígeno.

Se pueden usar desecadores de vacío comunes en los que el aire se reemplaza por un gas inerte como el nitrógeno. Para los anaerobios altamente sensibles al oxígeno, puede ser necesario utilizar adicionalmente un absorbente de oxígeno como el pirogalol alcalino. Además, varios tipos de frascos anaeróbicos están disponibles comercialmente para este propósito.

Un método diferente para determinar el recuento viable es la técnica del filtro de membrana. Se utiliza principalmente en el caso de poblaciones microbianas naturales, donde la densidad celular no es alta (generalmente -10 6 células / ml), como para contar bacterias coliformes en muestras de agua.

Se pasa un volumen medido de la muestra a través de un filtro de membrana estéril bajo presión negativa. El filtro debe tener un tamaño de poro menor que el diámetro de las células bacterianas promedio (menos de 1 μm). Después de la filtración, el disco de filtro de membrana se transfiere asépticamente a la superficie de un medio de agar esterilizado adecuado y se incuba hasta que aparecen colonias visibles en la superficie del filtro. A continuación, se cuentan las colonias y se calcula el recuento viable por unidad de volumen de la muestra de la forma habitual.

Un procedimiento completamente diferente basado en un principio estadístico es la determinación del número más probable (NMP) de un grupo específico de microorganismos en la población natural. El procedimiento se aplica generalmente en el análisis bacteriológico de muestras de agua, pero también se puede utilizar para otros grupos de organismos naturales.

Para la determinación del MPN de bacterias coliformes en una muestra de agua, se inoculan alícuotas de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml de la muestra de agua en 5 tubos replicados de caldo de lactosa, cada uno de los cuales contiene un tubo Durham & # 8217s invertido.

Las bacterias coliformes fermentan la lactosa para producir gas que se acumula en los tubos de Durham & # 8217s.

Después de la incubación durante 48 ha 32 ° C, los tubos se examinan para detectar la presencia de gas y se cuenta el número de tubos que muestran acumulación de gas (Fig. 7.3):

A continuación, se determina el número más probable de bacterias coliformes en la muestra de agua a partir de una tabla MPN estándar (Tabla 7.1):

Si bien contar las bacterias en una población es una forma de determinar el crecimiento, otro parámetro, a saber. medición de la masa bacteriana - también se puede utilizar. La estimación gravimétrica de células bacterianas frescas o de células secas proporciona un método directo.

Se puede obtener el peso fresco de una masa bacteriana recolectando las células mediante centrifugación, lavándolas con agua destilada para eliminar los ingredientes solubles del medio de cultivo y transfiriendo el sedimento a un recipiente prepesado. Para la determinación del peso seco, la masa celular lavada se mantiene a 110 ° C durante la noche y se pesa. Un manejo muy cuidadoso es esencial para obtener resultados precisos, ya que la cantidad es muy pequeña para cultivos a escala de laboratorio.

También se encuentran disponibles otros métodos para medir la masa bacteriana, aunque son algo indirectos. Uno de ellos es la estimación del nitrógeno total de la masa celular mediante el método micro-kjeldahl. El contenido de nitrógeno total de un cultivo en crecimiento activo aumenta linealmente con la masa celular.

También existe una relación similar entre el carbono total y el peso celular. El contenido de carbono total se puede estimar mediante el método de Van Slyke-Folch. Para fines de rutina, la estimación de la proteína total de una alícuota del cultivo por cualquiera de los métodos comunes da resultados satisfactorios y confiables.

Para la proteína total, las células se lisan mediante tratamiento con álcali que da como resultado la liberación del contenido celular, seguido de centrifugación para eliminar los restos celulares y tratamiento de una alícuota con un reactivo colorante, como biuret, Folin, azul de Coomassie, etc.

El color desarrollado se mide luego en un colorímetro. A partir de la lectura del colorímetro, se lee la cantidad de proteína (mg / ml) de una curva estándar. Se prepara una curva estándar utilizando una proteína auténtica como la albúmina de suero bovino y el mismo reactivo colorante. Una curva estándar muestra cantidades conocidas de proteína en un eje y las lecturas colorimétricas correspondientes en el otro eje.

Un método indirecto pero rápido y práctico para estimar la masa celular es la turbidemetría. La masa celular que es directamente proporcional a la densidad de población puede medirse con precisión mediante este método. A medida que aumenta el número de células con el crecimiento, un medio de cultivo bacteriológico se vuelve cada vez más turbio, permitiendo que pase cada vez menos luz y al mismo tiempo dispersando más y más luz por las células suspendidas.

Para las bacterias más comunes, la turbidez visible aparece cuando la densidad celular está entre 10 6 y 10 1 células / ml. Cuando el cultivo contiene menos células, la medición turbidimétrica del crecimiento no es factible. El instrumento utilizado para este método se llama colorímetro fotoeléctrico que mide la densidad óptica de una suspensión o también la densidad de color de una solución coloreada.

La densidad óptica de una suspensión bacteriana se mide transfiriendo una porción de un cultivo líquido a un tubo de vidrio colorimétrico que normalmente tiene un diámetro (trayectoria de luz) de 1 cm frente a un blanco (control) que suele ser el medio de cultivo sin inocular. Se utiliza un filtro de luz adecuado (normalmente verde o azul). La densidad óptica se puede medir en términos de absorbancia (A) o transmisión (T%).

Generalmente, un colorímetro tiene ambos tipos de escalas. La absorbancia es el logaritmo de la relación de intensidades de la luz incidente (I0) y luz transmitida (1) es decir, A = log (I0/I). Se da en escala logarítmica. El porcentaje de transmisión es el porcentaje de luz incidente que pasa a través de la suspensión y se calibra en una escala aritmética. Las dos escalas corren obviamente antiparalelas, p. Ej. el blanco tiene una absorbancia de O y T% de 100.

A medida que aumenta la turbidez, aumenta la absorbancia y disminuye el% de transmisión. El colorímetro está provisto de una fuente de luz, algunos filtros para seleccionar la luz de un rango deseado de longitudes de onda, un tubo de colorímetro con una trayectoria de luz conocida, una fotocélula que convierte la luz incidente en corriente eléctrica, un dispositivo para amplificar la corriente. así producido y finalmente un galvanómetro para medir la corriente eléctrica (Fig. 7.4). Sólo existe una relación lineal entre la densidad de las células bacterianas y la absorbancia o transmisión cuando la suspensión es relativamente fina (fig. 7.5).

Otro instrumento conocido como nefelómetro tiene más o menos los mismos componentes que un colorímetro, pero es más sensible. Mide la luz dispersada por las células bacterianas en suspensión. Cuanto mayor sea la densidad celular, mayor será la cantidad de luz dispersada.

El aparato está diseñado de tal manera que puede capturar los rayos de luz dispersos por las bacterias suspendidas en ángulo recto con el haz de luz incidente y convertirlos en electricidad que luego se puede medir de la manera habitual.

Tanto la colorimetría como la nefelemetría pueden usarse para medir el crecimiento de organismos unicelulares que forman una suspensión estable y uniforme. Si la lectura del colorímetro o la lectura del nefelómetro se calibra contra el número de células o la masa celular, estos métodos proporcionan un medio confiable para estimar el crecimiento.

3. Multiplicación de bacterias unicelulares:

La mayoría de las bacterias son organismos unicelulares y la mayoría de ellos se multiplica por fisión binaria, lo que significa que cada bacteria se divide para producir dos células idénticas. Cada uno de ellos, después de alcanzar la madurez, se somete a una fisión binaria similar para producir dos células hijas. Por lo tanto, en condiciones ideales, el número de células y la masa se duplican después de determinados intervalos de tiempo, dependiendo de la especie y de las condiciones de crecimiento.

El intervalo de tiempo entre dos divisiones sucesivas se denomina tiempo de generación o tiempo de duplicación. Después de cada tiempo de generación de unidades, el número de bacterias se duplica. Por lo tanto, en condiciones óptimas, el crecimiento de las bacterias se produce por progresión geométrica con un factor constante de 2. A partir de una sola bacteria, el aumento en el número se puede representar como 2 0 - & gt2 1 - & gt2 2 - & gt2 3 - & gt2 4 - & gt2 5 - & gt & # 8230 .— & gt2 n después de n divisiones.

4. Determinación del tiempo de generación:

Si el número de células por unidad de volumen de un cultivo bacteriano en crecimiento activo a la vez se toma como N0, entonces el número en el tiempo t durante el cual han tenido lugar n divisiones viene dado por la ecuación:

nortet = N0.2 n, donde N, representa el número de bacterias en el tiempo t.

Expresada logarítmicamente, la ecuación anterior se convierte en:

Se ve en la última ecuación que contando el número de bacterias presentes en un cultivo en crecimiento activo en el momento t0 y t, es posible determinar el número de divisiones que se han producido durante el intervalo de tiempo entre t0 y T.

Una vez hecho esto, el tiempo de generación (g), que es el tiempo entre dos divisiones sucesivas, se puede determinar fácilmente, porque g = t / n. Nuevamente, el número de divisiones por hora que se conoce como tasa de duplicación (v), se convierte en v = n / ty también v = 1 / g. Se puede dar un ejemplo para aclarar las consideraciones matemáticas anteriores.

Si un cultivo en crecimiento activo tiene un recuento de células de 10 4 / ml en un momento determinado y que aumenta a 10 8 / ml después de un lapso de 6 horas, entonces el organismo tiene una tasa de duplicación (v):

Y el tiempo de generación (g) es

El tiempo de generación varía de una especie a otra y también depende de las condiciones de crecimiento. En condiciones óptimas, Escherichia coli tiene un tiempo de generación de 20 minutos, lo que significa que una sola célula de E. coli puede producir 1.024 células después de 200 minutos durante los cuales se han realizado 10 ciclos de división.

Crecimiento exponencial o logarítmico:

Cuando, en un cultivo bacteriano, la población se duplica en cada generación, se dice que el crecimiento es exponencial o logarítmico, porque la población aumenta como exponente (potencia) de 2 y log2 del número de células aumenta en proporción directa con el tiempo. Una gráfica semilogarítmica del número de células por unidad de volumen de una población en crecimiento exponencial contra el tiempo da una línea recta (Fig. 7.6).

La relación lineal entre el logaritmo del número de células y el tiempo es válida, solo cuando todas las células de un cultivo en crecimiento son viables. En la práctica, difícilmente se espera un comportamiento tan ideal, porque algunas células se quedan atrás o se vuelven inviables.

5. Curva de crecimiento:

El crecimiento bacteriano en un matraz, o cualquier otro recipiente que pueda ser tan grande como un fermentador industrial, que contenga un medio de soporte del crecimiento se conoce como cultivo por lotes. El cultivo discontinuo representa un sistema & # 8220 cerrado & # 8221, porque los nutrientes inicialmente presentes se consumen gradualmente durante los productos finales metabólicos productores de crecimiento que se acumulan en el recipiente de cultivo provocando cambios en el valor de pH. No existe ninguna disposición para la adición de nutrientes frescos o para la eliminación de productos finales o el ajuste del valor de pH que también cambia durante el crecimiento.

Cuando se representa gráficamente el logaritmo del número de bacterias por unidad de volumen de dicho cultivo discontinuo frente al tiempo (h), comenzando con la transferencia de algunos organismos viables al recipiente de cultivo (inoculación), se obtiene una curva de crecimiento sigmoide (Fig. 7.7).

Una curva de crecimiento típica muestra varias fases distintas. Estos se conocen como la fase de retraso, la fase exponencial o logarítmica, la fase estacionaria y la fase de muerte. A veces, la última parte de la fase de retraso se denomina fase de aceleración y la parte inicial de la fase estacionaria se denomina fase de desaceleración.

La fase de retraso representa el intervalo de tiempo entre la inoculación y el inicio del crecimiento exponencial. Durante la fase de retraso, el número de células no aumenta, pero las bacterias individuales aumentan de tamaño debido a la síntesis activa de ingredientes celulares como proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos.

Durante la última parte de esta fase, algunas de las bacterias comienzan a dividirse dando como resultado un aumento lento en el recuento total (fase de aceleración). Puede haber varias razones por las que las bacterias no comienzan a crecer inmediatamente después de la inoculación en un medio nuevo.

Si el inóculo se toma de un cultivo antiguo, o de un cultivo que estaba creciendo en un medio de diferente composición, las células inoculadas necesitan algún tiempo para adaptarse al nuevo entorno. Por lo tanto, la fase de retraso puede considerarse como una fase de adaptación durante la cual las células inoculadas no permanecen inactivas, sino que se dedican a sintetizar materiales celulares como preparación para iniciar el crecimiento activo.

Desde la fase de retraso, las bacterias pasan a la fase exponencial (fase logarítmica) a través de la fase de aceleración intermedia y ahora están completamente equipadas para iniciar el crecimiento a una velocidad máxima. La mayoría de las células de la población se dividen regularmente en un intervalo de tiempo de generación de cada unidad, lo que da como resultado un aumento exponencial del número y la masa de células.

Sin embargo, todas las células de la población total no se dividen simultáneamente, sino que se dividen de forma asincrónica. Como resultado, el número de células no aumenta de forma escalonada. La tasa de crecimiento máxima se mantiene a lo largo de la fase exponencial y continúa hasta que se alcanza un punto en el que la densidad de población se vuelve tan alta que el medio de crecimiento no puede soportar un mayor crecimiento.

La tasa de crecimiento cae y finalmente se detiene. En este punto, la cultura entra en la fase estacionaria. La duración de la fase exponencial depende no solo de la disponibilidad de nutrientes, sino también de otros factores, como el suministro de oxígeno, el pH, la temperatura, etc. y, naturalmente, también del tiempo de generación. Las células en fase logarítmica (log) exhiben su mayor actividad y, por lo tanto, son las más adecuadas para medir el tiempo de generación, diversas propiedades bioquímicas y el tamaño de las células.

A medida que el cultivo entra en la fase estacionaria, no hay un aumento neto en el número de células, aunque la mayoría de las bacterias todavía permanecen en un estado viable y continúan sus actividades vitales a costa de las sustancias de reserva almacenadas en las células.

La duración de esta fase es muy variable entre las diferentes especies y puede ser de unas pocas horas a varios días. Desde el punto de vista práctico, las células de la fase estacionaria son de especial importancia, porque en esta fase se producen muchos productos metabólicos secundarios, por ejemplo antibióticos. Además, para los organismos que se cultivan como fuente de biomasa, la recolección en esta fase proporciona el máximo rendimiento.

La fase estacionaria es seguida por la fase de muerte durante la cual el recuento de células viables cae exponencialmente, aunque el recuento total de células puede continuar sin cambios durante bastante tiempo. A partir de entonces, el recuento total también disminuye, lo que indica que las células se lisan y desaparecen. La lisis puede deberse a la actividad de sus propias enzimas (autólisis). Es posible que los materiales celulares liberados por la lisis proporcionen nutrición a las células aún vivas durante algún tiempo. Sin embargo, las causas exactas de la muerte de las bacterias no se comprenden con claridad.

Un parámetro importante de crecimiento es el rendimiento que se puede determinar a partir de la curva de crecimiento de un cultivo discontinuo midiendo el peso seco de la población total al comienzo y al final de la fase exponencial. Por tanto, si Mmax denota masa bacteriana (peso seco, g) al final de la fase exponencial, y M0 la masa inicial, entonces el rendimiento M es, M = Mmax - M0 (Figura 7.8).

Por lo general, el rendimiento se expresa en relación con el consumo de sustrato como coeficiente de rendimiento (Y) que es la relación entre el rendimiento (g en peso seco) y la cantidad (g) de sustrato utilizado. Convencionalmente, el coeficiente de rendimiento por mol de sustrato consumido se denomina coeficiente de rendimiento molar (Ymetro).

Otra forma de expresión del coeficiente de rendimiento es el coeficiente de rendimiento energético (YATP) que es el rendimiento por mol de ATP consumido. Para calcular este parámetro es esencial conocer la ruta de degradación de los carbohidratos (fuente de energía) del organismo en particular y la cantidad (moles) de ATP producida por mol de carbohidrato.

Por ejemplo, Streptococcus faecalis o Saccharomyces cerevisae descomponen la glucosa por la EMP (vía Embden-Meyerhof-Parnas) y, cuando crecen en ausencia de aire, producen 2 moles de ATP / mol de glucosa.

Mientras que el coeficiente de rendimiento molar (Ymetro) para ambos organismos es 20, es decir, ambos producen 20 g de células secas por mol de glucosa (180 g), coeficiente de rendimiento energético (YATP) para ambos es 10. En condiciones aeróbicas, el rendimiento aumenta significativamente, debido a una mayor producción de energía por oxidación completa del sustrato.

6. Cultura continua:

El destino de una población microbiana que crece en un sistema & # 8220closed & # 8221 como un cultivo discontinuo es comparable al destino de un organismo multicelular que tiene nacimiento, crecimiento, madurez y muerte. El ambiente en un cultivo por lotes está sujeto a cambios constantes debido al agotamiento continuo de nutrientes, cambio del valor del pH, presión parcial de gases disueltos, acumulación de metabolitos tóxicos, etc.

Debido a tales cambios, la duración de la fase de crecimiento activo también es limitada. Para muchos experimentos críticos, es necesario mantener un cultivo en un estado de crecimiento activo durante un tiempo prolongado. Esto se puede lograr mediante un cultivo continuo que proporcione el crecimiento de un organismo en un entorno constante. Un cultivo continuo representa un sistema & # 8220open & # 8221 en contraste con un cultivo por lotes.

Uno de los dispositivos para el crecimiento de microorganismos en un cultivo continuo es un quimiostato desarrollado por Novick y Szilard (1950). En su forma más simple, un quimiostato consta de un recipiente de cultivo provisto de una entrada para la entrada regulada de medio de cultivo fresco, una disposición para bombear aire esterilizado y una salida para mantener un volumen constante de líquido en el recipiente de cultivo (figura 7.9). ).

Las disposiciones en un quimiostato aseguran un flujo regulado constante de medio fresco en el recipiente de cultivo y la eliminación simultánea de la misma cantidad de fluido de cultivo del recipiente a través de un dispositivo de salida. Como resultado, siempre se mantiene un volumen constante en el recipiente.

El sistema también está provisto de una disposición para bombear aire esterilizado a través del cultivo para mantener una aireación adecuada. En contraste con un cultivo por lotes, un cultivo continuo es más susceptible de control. Por un lado, el flujo continuo de medio fresco evita el agotamiento de los nutrientes esenciales y, por otro lado, el flujo de salida continuo elimina el medio gastado que contiene metabolitos tóxicos y células bacterianas. Estos arreglos aseguran un crecimiento prolongado en un quimiostato.

La importancia de un cultivo de quimiostato radica en el hecho de que se puede controlar la tasa de crecimiento de un organismo. Esto se puede lograr suministrando uno de los nutrientes esenciales, como el carbono y la fuente de energía, en una concentración subóptima en el medio de entrada.

Como resultado, los organismos presentes en el cultivo se mueren de hambre y no pueden crecer a la velocidad máxima de crecimiento. Al mismo tiempo, la tasa de flujo de entrada puede ajustarse de modo que los organismos hambrientos consuman de forma inmediata y completa el nutriente particular que limita el crecimiento. El flujo de salida elimina continuamente una fracción de la población para mantener una densidad celular constante.

Por lo tanto, es posible establecer un estado de crecimiento constante. En un estado estable, la tasa de crecimiento es constante y es igual a la tasa de entrada de medio que se conoce como tasa de dilución. La tasa de dilución está tan ajustada que la concentración del nutriente crítico en el quimiostato es prácticamente nula, porque la población hambrienta consume instantáneamente el nutriente.

Como resultado, la tasa de crecimiento en el quimiostato se mantiene en un valor submáximo. Por lo tanto, al regular la tasa de dilución, es prácticamente posible mantener un cultivo en estado estacionario casi indefinidamente, lo que contrasta fuertemente con un cultivo discontinuo que pasa por diferentes fases de crecimiento, terminando finalmente en la muerte.

La relación entre la concentración de sustrato y la tasa de crecimiento es muy similar a la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción enzimática como se describe en la famosa ecuación de Michaelis-Menten. La tasa de crecimiento (μ) aumenta linealmente con la concentración [s] del sustrato (nutriente que limita el crecimiento) hasta cierto punto, y luego declina para volverse plana. Ks (Figura 7.10).

7. Cultura sincrónica:

Un cultivo sincrónico es aquel en el que todas las células de una población en particular se encuentran en la misma etapa de desarrollo y se dividen simultáneamente. En un cultivo por lotes común, la población contiene células en todas las etapas posibles de desarrollo, algunas acaban de ser producidas por fisión, otras están en etapas intermedias y otras están maduras y listas para la división.

Todas estas etapas son parte del ciclo celular. Por esta razón, la población celular de un cultivo discontinuo se divide de forma asincrónica, lo que produce una curva de crecimiento exponencial típica que indica que los logaritmos del número de células y de la masa celular aumentan linealmente con el tiempo (véase la figura 7.6).

En un cultivo sincrónico, por otro lado, uno esperaría un aumento gradual en el número de células, porque no habría ningún aumento en el número de células entre dos divisiones sucesivas. Pero la masa celular aún mostraría un aumento lineal con el tiempo, similar al que se encuentra en un cultivo por lotes. Esto se debe al hecho de que las células recién nacidas continúan aumentando de masa entre dos divisiones sucesivas, aunque su número no aumenta (fig. 7.11).

La sincronización de la división celular en una población bacteriana se puede lograr de varias formas. Uno de ellos es la alternancia repetida de la temperatura de incubación. Un cultivo que crece a la temperatura óptima se expone a una temperatura más baja, por lo que el crecimiento se ralentiza considerablemente. Después de algún tiempo, el cultivo se lleva nuevamente a su temperatura óptima.

El intervalo de tiempo se ajusta de acuerdo con la tasa de crecimiento (tiempo de generación) del organismo. Al bajar la temperatura, la división celular se retrasa y todas las células se dividen simultáneamente cuando la temperatura se eleva al nivel óptimo. El tratamiento debe continuarse durante varios ciclos para obtener resultados satisfactorios. Otro método para obtener una población de células en división sincrónica es mediante la filtración a través de un filtro de membrana.

Se filtra una población asincrónica de bacterias por lo que las células se adsorben en los poros del filtro de membrana. En el estado adsorbido, las células continúan dividiéndose produciendo células progenitoras que no se adsorben. Un flujo inverso de medio esterilizado a través del filtro de membrana arrastra las células de la progenie recién nacidas al filtrado. Por tanto, se puede obtener una población homogénea de células que se encuentran aproximadamente en la misma etapa de desarrollo. Estas células se dividen sincrónicamente durante algunas generaciones.

La utilidad de una cultura sincrónica radica en el hecho de que toda la cultura puede tomarse como un complejo multicelular formado por individuos que tienen un desarrollo idéntico. Por el contrario, un cultivo asincrónico solo puede proporcionar una imagen promedio de las células individuales.

A veces, es necesario conocer la secuencia de eventos que tienen lugar en células individuales. Para el tamaño pequeño, el estudio de tales eventos en células bacterianas individuales no es factible. Un cultivo sincrónico brinda esta oportunidad, porque todas las células se encuentran en la misma etapa de desarrollo. Por ejemplo, uno podría querer estudiar la replicación del ADN en relación con el ciclo celular.

Las muestras extraídas a intervalos adecuados durante una unidad de tiempo de generación de un cultivo sincrónico producirían células en diferentes etapas del ciclo celular y cada muestra contendría células de una etapa particular. Una medición de la incorporación de un precursor de ADN radiactivo proporcionaría información útil sobre la síntesis de ADN en diferentes fases del ciclo de crecimiento.

8. Medios de cultivo:

La mayoría de las bacterias y muchos microorganismos eucariotas como las algas y los hongos pueden cultivarse en condiciones artificiales (a diferencia de sus hábitats naturales) en medios de cultivo adecuados. Un medio de cultivo debe contener todas las materias primas que necesita el organismo en particular para construir sus constituyentes celulares: carbohidratos, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, etc.

Dado que el agua es el componente más importante de todos los sistemas vivos, los microorganismos pueden prosperar mejor en un medio acuoso. El principal constituyente del medio de cultivo es, por tanto, agua, en la que los demás ingredientes están presentes en estado disuelto.

Los microorganismos, como las células vegetales, generalmente están revestidos con una pared celular y pueden absorber nutrientes solo cuando están en estado disuelto. Sin embargo, la principal barrera para la entrada de nutrientes en la célula no es la pared celular, sino la membrana citoplasmática. Algunos de los nutrientes solubles pueden difundirse pasivamente a través de la membrana, pero para la mayoría existen sistemas de transporte específicos ubicados en la membrana que ayudan en la absorción de nutrientes del medio de cultivo.

Los elementos principales que son esenciales para el crecimiento de todos los microorganismos son el carbono, nitrógeno, hidrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, magnesio, calcio, potasio y hierro. Muchos microorganismos también requieren trazas de uno o más elementos menores, como manganeso, molibdeno, zinc, cobalto, níquel, cobre, boro, sodio y silicio.

Todos los elementos necesarios para el crecimiento deben proporcionarse en el medio de cultivo. La mayoría de las bacterias y todos los hongos tienen un modo de nutrición heterótrofo y dependen de uno u otro compuesto orgánico como fuente de carbono y energía. En general, los microorganismos pueden absorber todos los demás elementos en forma inorgánica.

Por tanto, para el cultivo de bacterias y hongos comunes presentes en el suelo o el agua, resulta adecuado un medio de sales inorgánicas que contenga un solo compuesto orgánico. Pero las bacterias patógenas a menudo se niegan a crecer en medios de cultivo tan simples y requieren suplementos de compuestos orgánicos complejos, probablemente porque se acostumbran a tales compuestos mientras crecen en el cuerpo del huésped. Por ejemplo, Haemophilus requiere hemina y dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) en su medio de crecimiento.

Aunque los microorganismos comunes (bacterias y hongos) pueden crecer en un medio de sal inorgánica con una sola fuente de carbono (generalmente glucosa), crecen mucho más rápido cuando el medio se enriquece mediante la adición de algunos compuestos orgánicos complejos.

Sobre esta base, los medios de cultivo se pueden distinguir en dos tipos:

Los medios complejos contienen una o más sustancias de composición química indefinida. Las sustancias comúnmente empleadas de este tipo son extracto de carne, peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de malta, sangre, suero, albúmina de huevo, extracto de patata, infusión de paja, etc.

El hidrolizado de caseína es otro complemento complejo, aunque su composición es más o menos conocida. Un medio bacteriológico complejo muy utilizado para obtener un crecimiento rápido y bueno es el caldo nutritivo que contiene extracto de carne, peptona y cloruro de sodio.

De manera similar, para el cultivo de hongos saprofitos, un medio complejo común es el agar con extracto de malta. El agar patata-dextrosa, que contiene extracto de patata hervida, glucosa y algunas sales, es otro medio para el cultivo de hongos. El caldo de infusión de paja es un buen medio complejo para el crecimiento de actinomicetos del suelo. Para el crecimiento de agar sangre de bacterias patógenas, a menudo se usa agar de suero-albúmina. Entre los medios complejos también se cuentan algunas sustancias naturales como la leche, la patata, la zanahoria, etc.

Los medios químicamente definidos, también llamados sintéticos, contienen sustancias de composición química conocida y cada una de ellas está presente en una concentración conocida. Se puede preparar un medio sintético simple que favorezca el crecimiento de bacterias comunes, incluida Escherichia coli, a partir de los siguientes ingredientes: K2HPO4 7.0, KH2correos4 3,0, Na3-citrato. 3H2O 0.5, MgSO4. 7H20 0,1, (NH4)2ASI QUE4 1.0, glucosa 2.0, FeSO4 . 7H20 0,01, CaCl2 .2H20 0,01 (g / 1). De manera similar, para los hongos, un medio sintético es Czapek-Dox.

Los medios de cultivo se pueden utilizar en forma líquida (caldo) o en forma de gel blando o relativamente duro (medio sólido). La gelatina que se utilizó en los primeros días de la microbiología como agente gelificante ya no se utiliza excepto para fines especiales. Ha sido reemplazado completamente por agar-agar, que es un agente muy superior.

El agar-agar es un polisacárido complejo y altamente reticulado extraído de algunas algas rojas marinas. A una concentración de 1,5-2% (p / v) produce un gel sólido y a la mitad de la concentración anterior un gel blando. Se solidifica a 42 ° -45 ° C y el gel se puede fundir a 100 ° C. El proceso de gelificación y fusión se puede repetir varias veces, a menos que el pH del medio sea ácido.

A diferencia de la gelatina, la mayoría de las bacterias no hidrolizan el agar. La superficie de los medios de agar permanece más o menos seca, de modo que las colonias que aparecen en la superficie no se extienden y las colonias discretas pueden recogerse fácilmente. Todas estas cualidades hacen del agar-agar un agente ideal para la solidificación de medios de cultivo microbiológicos.

Hay algunos organismos, aunque muy pocos, como Nitrosomonas que se niegan a crecer en medio de agar. Para organismos tan exigentes, se hace necesario el uso de un gel inorgánico, como el gel de sílice. Puede prepararse acidificando una solución de silicato de sodio con ácido clorhídrico. Después de fraguar, el gel se lava para eliminar el cloruro de sodio y el exceso de ácido. Después de secar, se deja que el gel absorba el medio de cultivo esterilizado antes de la inoculación.

Medios selectivos:

Cuando se inocula una población mixta de diferentes tipos de microorganismos en un medio de cultivo que permite el crecimiento selectivo de un solo tipo o de un grupo específico, el medio se considera selectivo. Los medios selectivos deben diseñarse de acuerdo con la necesidad de aumentar artificialmente el número de un organismo específico o, más comúnmente, para un grupo específico de organismos originalmente presentes en una población mixta (enriquecimiento) o para el aislamiento directo de un tipo particular de una mezcla mixta. población.

Se pueden citar algunos ejemplos de medios selectivos. Si uno tiene la intención de estudiar los tipos de bacterias fijadoras de nitrógeno presentes en un suelo determinado, el medio selectivo contendría otros ingredientes, excepto cualquier compuesto nitrogenado. En tal medio, crecerían organismos que son capaces de utilizar nitrógeno atmosférico solo.

Nuevamente, si se desea averiguar el número y seleccionar cepas resistentes a los antibióticos en una población grande, el medio utilizado para tal fin contendría el antibiótico particular en una concentración que sea inhibitoria para las cepas sensibles. El medio exento de nitrógeno en el primer caso y el medio que contiene antibiótico son ejemplos de medios selectivos.

Medios diferenciales:

Mientras que un medio selectivo permite el crecimiento de un organismo selectivo o un grupo selectivo de organismos, un medio diferencial permite el crecimiento de varios tipos de organismos presentes en una población mixta, pero al mismo tiempo ayuda a diferenciar un organismo en particular o un grupo de organismos. del resto.

Por tanto, en una población mixta, se puede detectar la presencia de un tipo particular. Por ejemplo, la presencia de bacterias coliformes en una muestra de agua que se sospecha está contaminada con materia fecal puede detectarse mediante la producción de gas a partir de lactosa. La capacidad para utilizar un determinado azúcar se puede probar de manera similar en un medio sólido que contenga el azúcar particular y una mezcla de colorantes indicadores: eosina y azul de metileno.

Los organismos capaces de fermentar el azúcar para producir ácido forman colonias que absorben los tintes y producen un brillo metálico. Así, en este medio diferencial (agar eosina-azul de emileno, EMB) los organismos pueden diferenciarse visualmente del resto. El medio de endo-agar preparado mediante la adición de fucsina básica decolorada en un medio de agar que contiene lactosa es otro medio diferencial para la identificación de bacterias coliformes.

9. Cultura de enriquecimiento:

La técnica de cultivo de enriquecimiento, desarrollada por Winogradsky y Beijerinck, se basa en el principio darwiniano de la supervivencia del más apto. En una cultura de enriquecimiento, el entorno está preestablecido de tal manera que se estimula selectivamente a un organismo o un grupo a crecer y multiplicarse, de modo que en una población mixta se vuelven predominantes.

Los factores ambientales que pueden utilizarse para dicho crecimiento o enriquecimiento selectivo incluyen carbono, nitrógeno y fuentes de energía, tensión de oxígeno, pH, temperatura, luz, etc. Estos factores deben seleccionarse sobre la base del conocimiento sobre las capacidades fisiológico-bioquímicas de el organismo desea enriquecerse.

La cuestión del enriquecimiento surge cuando el organismo deseado debe aislarse de una población mixta en la que forma una minoría y es superado en número por otros organismos. El método habitual de dilución en placas no puede emplearse como tal, porque durante la dilución se eliminan los organismos deseados.

Por lo tanto, antes de hacer placas de dilución, el número de organismos deseados debe incrementarse preferentemente sobre los organismos no deseados. En un cultivo de enriquecimiento, la competencia entre los organismos deseados y no deseados se elimina o minimiza, de modo que después de algunos pases a través del cultivo de enriquecimiento, los organismos deseados se convierten en la mayoría y luego pueden aislarse mediante el procedimiento de dilución habitual.

El éxito en tal procedimiento de enriquecimiento depende naturalmente de cuán efectivas sean las condiciones selectivas. Para crear tales condiciones selectivas, el conocimiento sobre el organismo deseado es un requisito previo esencial. La técnica del cultivo de enriquecimiento es una poderosa herramienta microbiológica que se puede aplicar para el aislamiento de cualquier organismo específico de su hábitat natural, siempre que se conozcan las condiciones selectivas para su enriquecimiento.

Se pueden citar algunos ejemplos de aplicación de la técnica para el aislamiento de diferentes tipos de microorganismos:

Enriquecimiento de bacterias fijadoras de di-nitrógeno y bacterias formadoras de endosporas:

Si un medio de sales inorgánicas sin ningún compuesto nitrogenado y que contiene un compuesto orgánico como fuente de carbono y energía se inocula con una muestra de suelo o agua y se incuba en condiciones aeróbicas, las condiciones selectivas así creadas estimularán el crecimiento de tales organismos que pueden utilizar la atmósfera. gas nitrógeno como única fuente de nitrógeno.

Debido a que el nitrógeno atmosférico está en forma molecular (N2), los organismos enriquecidos se denominan fijadores de di-nitrógeno o diazótrofos. La pequeña cantidad de nitrógeno combinado que está presente en el suelo o en la muestra de agua utilizada como inóculo podría permitir el crecimiento de no fijadores en la etapa inicial, pero algunos pasajes a través del medio selectivo generalmente los eliminan.

Los organismos que pueden aislarse de esta manera incluyen diferentes especies de Azotobacter, Beijerinckia, Derxia, Azomonas, etc. Si se usa un medio similar y se incuba en condiciones anaeróbicas, conduce al enriquecimiento de anaerobios fijadores de di-nitrógeno como Clostridium pastorianum y afines. especies. El enriquecimiento de Clostridia puede facilitarse aún más cuando el inóculo se pretrata durante 5 min a 80 ° C.

Este tratamiento mata todas las células vegetativas bacterianas, pero se preservan las endosporas. Por otro lado, un medio de sales minerales-azúcar con nitrógeno combinado inoculado con un inóculo tratado térmicamente e incubado aeróbicamente es adecuado para el enriquecimiento de bacterias aerobias formadoras de esporas, en su mayoría diferentes especies de Bacillus. Al seleccionar una temperatura más alta para la incubación, es posible aislar las especies termófilas de este género.

Las condiciones para el enriquecimiento de fijadores de nitrógeno y formadores de esporas se resumen en la Tabla 7.2:

Enriquecimiento de bacterias autótrofas:

Las bacterias autótrofas incluyen los organismos fototróficos y quimiolitotróficos. Los procariotas fototróficos incluyen las bacterias fotosintéticas anaeróbicas y las cianobacterias aerobias. Las bacterias quimiolitotróficas incluyen de manera similar una variedad de organismos capaces de oxidar diferentes sustratos inorgánicos para obtener energía.

Todos los organismos autótrofos, incluidas las plantas verdes, pueden sintetizar compuestos orgánicos a partir de CO2. Para el enriquecimiento de bacterias autótrofas de cualquier tipo, el medio no debe contener ningún compuesto orgánico, en su lugar debe haber una fuente de CO2, como el bicarbonato.

Para el enriquecimiento de todos los organismos fototróficos, los cultivos de enriquecimiento deben exponerse a la luz. Las cianobacterias son aeróbicas y muchas de ellas pueden fijar nitrógeno molecular atmosférico. Para su enriquecimiento, un medio de sales minerales sin nitrógeno combinado, inoculado con una muestra de agua o suelo, debe exponerse a la luz en condiciones aeróbicas.

Las cianobacterias realizan la fotosíntesis oxigenada como las plantas verdes. El otro grupo de procariotas fototróficos incluye los organismos anaeróbicos que se pueden dividir en dos tipos principales: los fotolitotrofos y los fotoorganótrofos. Para ambos, la luz es la fuente de energía del CO2-fijación, pero mientras que los fotolitotrofos pueden usar compuestos reducidos de azufre como H2Como donantes de electrones, los fotoorganótrofos utilizan compuestos orgánicos simples como acetato, malato, etc. para este propósito.

Las condiciones para el enriquecimiento de diferentes procariotas fototróficos se describen en la tabla 7.3:

Las bacterias quimiolitotróficas, como las bacterias nitrificantes, oxidantes de azufre y oxidantes de hidrógeno, no son fotosintéticas y son estrictamente aeróbicas. Deben enriquecerse preferiblemente en condiciones de oscuridad para evitar el crecimiento de cianobacterias. El medio de enriquecimiento debe estar compuesto por sales inorgánicas que incluyan una sal nitrogenada y un compuesto inorgánico oxidable que actúe como fuente de energía.

Este compuesto dependerá del tipo de organismo a enriquecer. Por ejemplo, para las bacterias nitrificantes se puede utilizar una sal de amonio tanto como fuente de nitrógeno como de energía. Otro grupo de bacterias nitrificantes usa nitrito como fuente de energía.

Para ambos tipos, el medio de enriquecimiento se ajusta a un pH alcalino (8,5) y, además, un neutralizador de ácido insoluble como CaCO3 o MgCO3 hay que añadirlo para contrarrestar el ácido nitroso y nítrico producido por las bacterias. El dióxido de carbono liberado a través de la interacción de ácido y carbonato es útil para el crecimiento. Se requieren varios pasajes a través de dichos medios para un enriquecimiento adecuado.

Otro grupo importante de bacterias autótrofas son los oxidantes de azufre. Pueden crecer en condiciones autótrofas utilizando compuestos de azufre reducido, como tiosulfato, sulfuro o azufre elemental y producir ácido sulfúrico. Para su enriquecimiento se utiliza un medio de sales minerales que incluye un compuesto nitrogenado inorgánico y el compuesto de azufre oxidable. Los organismos son aeróbicos y pueden tolerar un pH extremadamente ácido, aunque crecen de manera óptima a un pH neutro. Algunas especies son estrictamente autótrofas y otras pueden crecer también heterótrofas (facultativas).

Un tercer grupo de bacterias autótrofas comprende los organismos oxidantes de hidrógeno que utilizan la oxidación de H2 al agua como la reacción generadora de energía. Se las conoce comúnmente como bacterias de hidrógeno y todas ellas son solo facultativamente autótrofas. Para su enriquecimiento se emplea generalmente un medio de sales minerales con nitrógeno combinado y sin ninguna fuente de carbono orgánico contenido en un recipiente cerrado. La fase gaseosa del recipiente se produce artificialmente reemplazando el aire con una mezcla de H2 (70%), O2 (20%) y CO2 (10%) (v / v).

Las condiciones para el enriquecimiento de las bacterias nitrificantes, oxidantes de azufre e hidrógeno se muestran en la Tabla 7.4:

10. Requisitos de macro y microelementos para el crecimiento:

Estos elementos deben proporcionarse a los microorganismos para su crecimiento. El agua forma la mayor parte de todos los sistemas vivos en crecimiento activo y los microorganismos no son una excepción. Pero los microorganismos, en particular las endosporas producidas por algunos de ellos, pueden resistir la desecación durante mucho tiempo sin perder viabilidad. Sin embargo, en tal estado, sus actividades metabólicas y su crecimiento están prácticamente ausentes.

Además del agua, el carbono es el elemento más importante que constituye aproximadamente el 50% del peso seco de las células bacterianas. La importancia de este elemento radica en el hecho de que el carbono forma el esqueleto de todos los compuestos orgánicos que están presentes en todas las moléculas biológicamente significativas, como las de proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, etc.

La mayoría de los microorganismos tienen un modo de nutrición heterótrofo y obtienen su suministro de carbono de uno u otro compuesto orgánico, como azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, carbohidratos complejos, etc. Todos estos heterótrofos también pueden fijar pequeñas cantidades de CO2 en / varios intermediarios metabólicos (CO heterotrófico2-fijación).

Por el contrario, los microbios fototróficos y quimiolitotróficos obtienen su requerimiento de carbono por completo o en su mayor parte del CO2. Algunos autótrofos facultativos pueden crecer tanto en sustratos litotróficos (sustratos puramente inorgánicos) como en condiciones heterótrofas. Algunos tienen un tipo mixto de nutrición, los mixótrofos que pueden utilizar simultáneamente CO2 y algún compuesto orgánico como fuente de carbono.

Junto al carbono está el nitrógeno, que forma aproximadamente el 10-15% del peso seco de las células microbianas. La mayoría de las bacterias pueden crecer solo en presencia de nitrógeno combinado suministrado en el medio. Algunas, incluidas algunas cianobacterias, pueden reducir el nitrógeno molecular a amoníaco e incorporarlo a ácidos orgánicos para producir aminoácidos.

Esta propiedad, conocida como fijación de di-nitrógeno, es conferida por un complejo enzimático especial conocido como nitrogenasa. El nitrógeno está presente en proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de la pared celular, coenzimas, vitaminas, etc. Entre estos, las proteínas son cuantitativamente las más importantes y representan aproximadamente el 50% del peso seco de las células bacterianas.

El fósforo es el siguiente elemento principal que forma el 2-6% del peso seco de las células bacterianas. Los microorganismos obtienen su suministro de este elemento de los fosfatos inorgánicos proporcionados en el medio de crecimiento. Los fosfatos también ayudan a mantener el pH del medio en un rango favorable mediante una acción amortiguadora.

Entre los constituyentes celulares más importantes que contienen fósforo se encuentran los ácidos nucleicos. El ADN representa del 3 al 4% del peso seco de las células bacterianas y el ARN del 10 al 20%. Los compuestos ricos en energía, como el trifosfato de adenosina (ATP), el trifosfato de guanosina (GTP), etc. y los azúcares fosforilados también se encuentran entre los compuestos importantes que contienen fósforo. Además, los fosfo-lípidos forman el sistema de membranas.

El azufre también es un elemento esencial para todos los organismos vivos. Se encuentra en todas las proteínas como componente de los aminoácidos, cisteína y metionina. Dos moléculas de cisteína pueden unirse por oxidación para formar un dímero, llamado cistina (enlace S-5, puente disulfuro).

Esta reacción es de especial importancia al impartir un plegamiento característico de la cadena polipeptídica, y también juega un papel importante en la unión de cadenas polipeptídicas individuales para producir la estructura cuaternaria de moléculas proteicas. Los microorganismos obtienen su suministro de azufre de los sulfatos inorgánicos presentes en el medio.

El sulfato se reduce intracelularmente mediante una vía de reducción asimilatoria a HS & # 8211 (sulfhidrilo) y se incorpora a compuestos orgánicos. El elemento azufre tiene un significado especial en el caso de quimiolitotrofos oxidantes de azufre, como Thiobacillus y las bacterias de azufre fotosintéticas moradas y verdes, como Chromatium y Chlorobium.

Algunas especies de Thiobacillus pueden oxidar azufre elemental a sulfato y utilizar la energía de oxidación para el crecimiento quimiolitotrófico. Las bacterias de azufre púrpura y verde utilizan sulfuro como donante de electrones exógeno en la fotosíntesis y en el proceso producen azufre elemental que se deposita dentro o fuera de sus células.

Hasta ahora hemos considerado el papel de los elementos no metálicos en la constitución de células microbianas. Aunque cuantitativamente menos, los elementos metálicos también forman parte esencial de los microorganismos. Entre ellos, se requieren magnesio (Mg ++) y potasio (K +) en cantidades sustanciales. El Mg ++ es esencial para el mantenimiento de la integridad de los ribosomas y actúa como cofactor en muchas reacciones enzimáticas, en particular las que involucran al ATP.

Además, está presente como parte de la clorofila en todos los organismos fotosintéticos, incluidas las cianobacterias y las bacterias fotosintéticas púrpuras, verdes y sin azufre que contienen bacterioclorofilas. El potasio (K +) es uno de los elementos intracelulares importantes para el mantenimiento del equilibrio iónico. También sirve como cofactor en muchas reacciones enzimáticas y juega un papel importante en la función ribosómica.

El hierro (Fe ++) forma parte integral de todas las hemoproteínas, como los citocromos. También está presente en ferredoxina y nitrogenasa. Las bacterias de hierro, como Thiobacillus ferrooxidans, pueden crecer quimiolitotróficamente a expensas de la energía de oxidación de Fe ++ - & gtFe +++. Entre otros elementos metálicos requeridos por los microorganismos se encuentran el zinc (Zn ++), el molibdeno (Mo ++), el manganeso (Mn ++), el calcio (Ca ++), el cobalto (Co ++) y el níquel (Ni ++).

El zinc y el manganeso actúan como cofactores de varias enzimas. El molibdeno, junto con el hierro, son partes integrales de la enzima nitrogenasa. Otra enzima de molibdeno es la dimetilsulfóxido reductasa que convierte el sulfóxido en dimetilsulfuro. La enzima tiene un papel importante en el ciclo del azufre de la naturaleza. La nitrato reductasa es otra molibdoenzima.

Algunas bacterias fijadoras de nitrógeno poseen nitrogenasa en la que el vanadio (Va ++) reemplaza al molibdeno. El níquel (Ni ++) es requerido por bacterias oxidantes de hidrógeno para la actividad hidrogenasa. Algunas bacterias pueden sintetizar cianobalamina (vitamina B12) y requieren cobalto (Co ++) que está presente en la vitamina. El calcio (Ca ++) es esencial para la producción de endosporas en bacterias Gram-positivas. Las endosporas contienen dipicolinato de calcio, un compuesto que es en gran parte responsable de la resistencia térmica.

Los iones de zinc y manganeso sirven como cofactores en varias reacciones enzimáticas. La mayoría de las bacterias generalmente no requieren ión de sodio (Na +), aunque a veces se agrega en los medios de cultivo principalmente para mantener una presión osmótica favorable del medio.

La mayoría de las bacterias comunes pueden tolerar una concentración moderada de NaCl (3-4%), pero los microorganismos marinos requieren una concentración más alta para su crecimiento. Hay algunas bacterias extremadamente tolerantes a la sal (las halófilas) como Halobium que necesitan una concentración mucho más alta de NaCl (hasta un 20%) para mantener su integridad celular.

La composición elemental promedio de las células bacterianas secas se muestra en forma de diagrama en la figura 7.12:

11. Factores físicos que influyen en el crecimiento:

(i) Oxígeno:

Sobre la base de la relación del oxígeno, los microorganismos se clasifican en tres tipos principales: aeróbicos, anaeróbicos y microaerófilos. Mientras que los organismos aeróbicos necesitan oxígeno del aire para crecer, los organismos anaeróbicos, que incluyen principalmente bacterias, no pueden utilizar el oxígeno. Para algunos anaerobios obligados, el oxígeno es incluso tóxico. Algunos organismos que pueden crecer tanto en presencia de aire como en su ausencia se denominan anaerobios facultativos. Los organismos microaerófilos también son aeróbicos, pero crecen solo a una tensión de oxígeno reducida.

Los organismos aeróbicos son capaces de oxidar sustratos completamente a CO2 y H2O usando oxígeno como aceptor terminal de hidrógeno. En este proceso de respiración, producen ATP en el sistema de transporte de electrones por fosforilación oxidativa a partir de ADP y fosfato inorgánico.

Los anaerobios obligados, por otro lado, pueden oxidar sustratos solo parcialmente por fermentación, debido a la falta de una vía de transporte de electrones enlazada con el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA) y producen ATP solo por fosforilación a nivel del sustrato.

Los anaerobios facultativos son esencialmente de dos tipos. Algunos son capaces de cambiar su metabolismo a fermentación o respiración aeróbica dependiendo de las condiciones ambientales, es decir, si el oxígeno está presente o ausente.

El otro grupo de anaerobios facultativos son los organismos que respiran capaces de utilizar el oxígeno del aire (cuando hay aire) o de compuestos inorgánicos oxidados, como el nitrato o el sulfato (cuando no hay aire, es decir, en condiciones anaeróbicas).

En condiciones anaeróbicas realizan la llamada respiración de nitrato o sulfato, en la que estos compuestos sirven como aceptor de electrones terminales en lugar de oxígeno. Producen ATP por fosforilación oxidativa como los organismos aeróbicos.

Los microaerófilos también son organismos que respiran y requieren oxígeno, pero solo pueden crecer cuando la concentración de oxígeno es considerablemente más baja de lo normal. Probablemente esto se deba a la sensibilidad al oxígeno de algunas de sus enzimas vitales. En un cultivo líquido sin agitar, estas bacterias forman una capa debajo de la superficie donde la concentración de oxígeno es adecuada para su crecimiento. Por el contrario, los organismos aeróbicos crecen en la superficie y los anaerobios facultativos tienden a acumularse en el fondo, si es que crecen.

Las bacterias pueden utilizar el oxígeno disuelto en el medio de crecimiento.La solubilidad del oxígeno en agua es baja y la mayoría de las bacterias están bien adaptadas a dicha concentración para un crecimiento normal cuando crecen en la superficie del agar o en la interfaz aire-líquido.

El uso de capas delgadas de medio de cultivo en recipientes con una superficie amplia generalmente es suficiente para el crecimiento normal de la mayoría de los organismos aeróbicos. Sin embargo, cuando el uso de mayores volúmenes de medio se vuelve esencial, surge la necesidad de un arreglo adicional para la aireación.

Para cultivos en matraces de laboratorio, se usa comúnmente un agitador mecánico que tiene un movimiento de vaivén (recíproco) o elíptico para agitar cultivos líquidos. Cuando es necesario utilizar volúmenes aún mayores, se hacen necesarios los arreglos para la aireación forzada.

Generalmente, para este propósito, el aire esterilizado se fuerza a través de un rociador que produce burbujas de aire en la capa inferior del fluido de cultivo. Los fermentadores más grandes cuentan con disposiciones más sofisticadas para la aireación. Para organismos anaerobios en crecimiento, el oxígeno debe excluirse del medio de cultivo y de la atmósfera existente en el recipiente de cultivo. Algunos anaerobios son algo aero tolerantes y pueden crecer en medios sólidos que contienen sustancias reductoras como tioglicolato, ácido ascórbico o cisteína que presumiblemente minimizan el efecto tóxico del oxígeno al interactuar con él.

Para el crecimiento de organismos anaerobios en cultivo líquido, generalmente se emplean recipientes cerrados llenos completamente con el medio recién preparado. Si es necesaria una atmósfera artificial (fase gaseosa), debe estar libre de oxígeno. Se encuentran disponibles contenedores especialmente diseñados (frascos anaeróbicos) para el cultivo de anaerobios.

(ii) Concentración de iones de hidrógeno:

La concentración de iones de hidrógeno [H +] determina la acidez y alcalinidad del medio de cultivo y se expresa comúnmente como su valor de pH, que es el logaritmo del recíproco de la concentración de iones de hidrógeno (moléculas de gramos por litro). La concentración de iones de hidrógeno del agua pura es de 1/10 7 moles por litro, lo que corresponde a un valor de pH de 7,0 (neutro). A medida que aumenta [H +], el valor del pH disminuye y aumenta la acidez. La disminución de [H +] desde el punto neutro da como resultado un aumento de la alcalinidad.

Las relaciones se muestran en la Fig. 7.13:

La mayoría de las bacterias prefieren un medio neutro a ligeramente alcalino, mientras que los hongos y las algas crecen mejor en condiciones ligeramente ácidas. Para cada organismo existe un pH mínimo, óptimo y máximo que permite el crecimiento. El intervalo total puede ser bastante amplio, extendiéndose por encima de 2-3 unidades de pH, lo que corresponde a una diferencia de 100-1.000 veces en la concentración de iones de hidrógeno. A pesar de esta amplia variación, los organismos pueden crecer porque la membrana celular es apenas permeable a H + o (OH) & # 8211. Como resultado, el interior de la celda permanece más o menos neutral.

Los microorganismos durante el crecimiento pueden producir sustancias ácidas o alcalinas en cantidades considerables para cambiar el pH del medio hasta tal punto que resulta inhibidor. Por ejemplo, las bacterias nitrificantes producen ácidos nitroso y nítrico como productos de oxidación y hacen que el medio sea muy ácido e inadecuado para el crecimiento. Prevalece una situación opuesta en el caso de bacterias ureolíticas o proteolíticas. Producen amoníaco como producto final que vuelve el medio fuertemente alcalino.

Para controlar estos cambios extremos y desfavorables en el pH de los medios de cultivo, estos deben estar adecuadamente tamponados. Generalmente, los fosfatos ácidos y alcalinos, como KH2P04 y K2HP04, se utilizan en medios bacteriológicos. Una solución equimolar de estas dos sales produce un pH de 6,8 que es adecuado para el crecimiento de muchas bacterias.

Si un organismo produce un ácido en el medio, reacciona con el fosfato alcalino convirtiéndolo en una forma ácida. Lo contrario es el caso cuando un organismo tiende a cambiar el medio alcalino produciendo una sustancia básica. Por tanto, los fosfatos que son bien tolerados por la mayoría de las bacterias se utilizan ampliamente como tampón. Al mismo tiempo, sirven como fuente de fósforo.

Aunque el tamponamiento del medio generalmente resulta adecuado para controlar los cambios de pH, a veces, como en el caso de las bacterias nitrificantes que producen cantidades abundantes de ácidos, se hace necesaria la adición de neutralizadores insolubles como carbonatos de calcio o magnesio.

Las bacterias, en general, prefieren un medio de crecimiento neutro a ligeramente alcalino. Pero también hay excepciones. Las bacterias que crecen de manera óptima a un pH ácido se denominan acidófilos y las que crecen preferentemente en un pH alcalino se conocen como alcalófilos.

No solo las bacterias (tanto eubacterias como arqueobacterias), sino también varias algas, hongos o incluso flagelados están dotados de tales propiedades. Muchos de los organismos acidófilos son simultáneamente termófilos. Algunos ejemplos de bacterias acidófilas son Acetobacter acidophilum (pH óptimo 3), Thiobacillus thiooxidans (rango de pH para crecimiento 0,9-4,5), Bacillus acidocaldarius (rango de pH para crecimiento 2-6, opc. 3), Thennoplasma acidophilum (pH 1-2) , Sulfolobus acidocaldarius (rango de pH 1.5-3.5), Los organismos no bacterianos que pueden crecer en un pH ácido incluyen Cyanidium caldarium (alga eucariota, pH 2-3), Chlorella ellipsoidea (pH 2), Chlamydomonas acidophila (pH 2), Polytomella ciegos (pH 1,4 - un flagelado). Algunos hongos, como especies de Cephalosporium, Trichosporon, Aspergillus, Penicillium y Fusarium, también pueden crecer en medios considerablemente ácidos.

Los verdaderos organismos alcalófilos tienen un rango de pH para el crecimiento que varía entre 8-11 o incluso más. Incluyen algunas algas verdeazuladas, p. Ej. Spirullina y Synechococcus, bacterias verdaderas, como Bacillus alkalophilus y varios otros bacilos y algunas arqueobacterias, como Natronobacterium sp., Methanobacterium thermoalcalophilum, etc.

(iii) Temperatura:

La temperatura es una de las variables más importantes para el crecimiento. Para cada organismo existe un rango de temperatura que es adecuado para su crecimiento. En un extremo de este rango está la temperatura mínima donde puede comenzar el crecimiento y en el otro extremo está la temperatura máxima donde el crecimiento se detiene abruptamente. Entre los dos extremos, hay una temperatura óptima donde la tasa de crecimiento es máxima.

Sobre la base de las relaciones de temperatura, los microorganismos se dividen clásicamente en tres grupos principales: psicrófilos, mesófilos y termófilos. Los psicrófilos son organismos amantes del frío que crecen en hábitats marinos o alpinos. Muchos de ellos pueden multiplicarse a 0 ° C o incluso a temperaturas bajo cero y tienen una tasa de crecimiento máxima entre 16 ° C y 20 ° C.

Ejemplos bien conocidos de bacterias psicrófilas son la fotobacteria marina sp. y Gallionella ferruginosa oxidante de hierro (temp. opt. 6 ° C). Además, pertenecen a este grupo varias especies marinas de Pseudomonas y algunas especies de Bacillus aisladas de los glaciares.


Crecimiento y temperatura bacterianos

La temperatura es otro factor importante para el crecimiento bacteriano. Las bacterias que crecen mejor en ambientes más fríos se denominan psicófilos. Estos microbios prefieren temperaturas que oscilan entre 4 ° C y 25 ° C (39 ° F y 77 ° F). Los psicófilos extremos prosperan en temperaturas por debajo de 0 ° C / 32 ° F y se pueden encontrar en lugares como lagos árticos y aguas profundas del océano.

Las bacterias que prosperan en temperaturas moderadas (20-45 ° C / 68-113 ° F) se denominan mesófilos. Estas incluyen bacterias que forman parte del microbioma humano que experimentan un crecimiento óptimo a la temperatura corporal o cerca de ella (37 ° C / 98,6 ° F).

Termófilos crecen mejor en temperaturas cálidas (50-80 ° C / 122-176 ° F) y se pueden encontrar en aguas termales y suelos geotérmicos. Las bacterias que favorecen temperaturas extremadamente altas (80 ° C-110 ° C / 122-230 ° F) se denominan hipertermófilos.


Métodos

Disponibilidad de software

Microbial Dynamical Systems INference Engine (MDSINE) está disponible como un paquete de código abierto que incluye código fuente MATLAB y ejecutables independientes para Mac OS X, Linux y Windows. El software lee los datos de entrada formateados (tabla de recuentos de cepas, mediciones de biomasa bacteriana total y metadatos relevantes; consulte las instrucciones del repositorio y el manual para obtener más detalles; enlaces provistos en la sección "Disponibilidad de datos y materiales"), luego infiere modelos de sistemas dinámicos. MDSINE admite análisis adicionales que utilizan los modelos inferidos, incluidas las predicciones de redes de interacción cualitativa, trayectorias, estados estables y distorsión trapezoidal. Los scripts de la utilidad R se proporcionan en el paquete para visualizar estos análisis.

Descripción general del modelo matemático

Usamos las ecuaciones de Lotka-Volterra generalizadas extendidas (gLV) como se describió anteriormente [8] para el modelo subyacente de la dinámica microbiana. Para el modelo gLV para L OTU medidas en S sujetos, la tasa de cambio de la concentración de OTU l en tema s se expresa como:

los α Los parámetros representan tasas de crecimiento ilimitadas, la β Los parámetros representan interacciones microbio-microbio por pares, y el γ Los parámetros representan los efectos de PAG perturbaciones. Las funciones tu pag (t) tienen valores binarios, lo que indica si la perturbación dada está presente en el momento t. A diferencia de nuestro enfoque anterior [8], que no asumía restricciones sobre los parámetros, aquí asumimos tasas de crecimiento positivas y tasas de auto-interacción negativas, es decir, α & gt 0 y β ll & lt 0. Estas limitaciones imponen el supuesto biológicamente realista del crecimiento logístico en ausencia de interacciones, es decir, el crecimiento hasta una capacidad de carga finita del sistema ecológico.

Usamos un enfoque de "coincidencia de gradiente" para estimar los parámetros de ODE. El concepto subyacente a este enfoque es que si se dispone de estimaciones de los valores de gradiente y trayectoria, los parámetros pueden estimarse mediante la solución de sistemas de ecuaciones en lugar de sistemas de ecuaciones diferenciales. En el caso del modelo gLV, el sistema de ecuaciones de "coincidencia de gradiente" es lineal y se puede escribir como:

Aquí, (< widehat>_ ) representa una estimación de la concentración de OTU l en tema s en el momento t y (< widehat>_^ < prime> ) representa la estimación de gradiente correspondiente. Estas estimaciones se derivan de los datos que se describen en las secciones siguientes y se detallan en el archivo adicional 2. Suponemos que tenemos mediciones de recuentos. Y lst (es decir, obtenido mediante secuenciación de ARNr 16S) para cada OTU l en tema s en el momento t, dónde están L OTU, S sujetos y norte s puntos de tiempo por tema. También asumimos que tenemos mediciones de la biomasa bacteriana total. W S t (por ejemplo, obtenido a través de qPCR) para cada punto de tiempo t en cada tema s.

La reducción de las ecuaciones diferenciales de gLV a un sistema lineal de ecuaciones mediante el enfoque de "correspondencia de gradiente" permite la aplicación de modelos estadísticos para la regresión lineal. Sin embargo, todavía nos enfrentamos a la estimación L 2 + L + LP parámetros, lo que dará como resultado un sistema subdeterminado para conjuntos de datos típicos. Por lo tanto, desarrollamos varios algoritmos que utilizan técnicas de regularización o selección de variables durante el proceso de inferencia de parámetros. Estos algoritmos se describen a continuación y se detallan en el archivo adicional 2.

Algoritmo de regresión de cresta restringida de máxima verosimilitud (MLCRR)

El objetivo general del algoritmo MLCRR es inferir estimaciones puntuales de los parámetros de crecimiento, interacción y efecto de perturbación para el modelo gLV a partir de datos de secuenciación de genes de ARNr 16S de alto rendimiento y mediciones de biomasa microbiana. Como se describió anteriormente, los conjuntos de datos típicos de series de tiempo de microbiomas no tendrán suficientes observaciones en relación con las posibles interacciones microbio-microbio y los efectos de perturbación, lo que da como resultado un sistema subdeterminado. Resolvemos este problema empleando un L 2-enfoque de regularización (también conocido como regularización de Tikhonov o regresión de cresta [31]) con validación cruzada para establecer los parámetros de regularización. El algoritmo MLCRR extiende nuestro anterior algoritmo MLRR basado en la máxima verosimilitud [8] para limitar las tasas de crecimiento a valores positivos y los parámetros de auto-interacción a valores negativos. Desarrollamos un enfoque basado en programación cuadrática eficiente para inferir parámetros en el problema restringido, que se detalla en el archivo adicional 2.

Algoritmos bayesianos

El objetivo general de los algoritmos bayesianos MDSINE es inferir distribuciones de crecimiento, interacción y parámetros de efecto de perturbación para el modelo gLV a partir de datos de secuenciación de genes de ARNr 16S de alto rendimiento y mediciones de biomasa microbiana. A continuación, se utilizan distribuciones inferidas de parámetros para calcular medidas de resumen, incluidas las trayectorias medias predichas para las OTU, así como las medidas de variabilidad y la fuerza de la evidencia de la selección del modelo. Al igual que con el método basado en la máxima verosimilitud de MLCRR, utilizamos un enfoque de "coincidencia de gradiente" para inferir parámetros para el modelo gLV.

Para los algoritmos bayesianos de MDSINE, utilizamos un procedimiento de estimación de dos pasos. En primer lugar, estimamos las trayectorias y los gradientes de las concentraciones de OTU directamente a partir de los recuentos de secuenciación y los datos de biomasa utilizando nuestro método Bayesian Adaptive Penalized Counts Splines (BAPCS) que se describe a continuación. Luego, usamos las trayectorias y gradientes estimados para inferir los parámetros de gLV usando técnicas de modelado lineal bayesiano, Lazo Adaptativo Bayesiano (BAL) o Selección Variable Bayesiana (BVS), cada una de las cuales se describe a continuación. Para ambos pasos, utilizamos algoritmos personalizados de Markov Chain Monte Carlo (MCMC) detallados en el archivo adicional 2.

El algoritmo Bayesian Adaptive Penalized Counts Splines (BAPCS) en MDSINE estima las trayectorias de concentración de OTU y los gradientes a partir de datos que consisten en series de tiempo de conteos ruidosos. Nuestra formulación del problema modela explícitamente diferentes números de secuenciación de lecturas entre muestras, sobredispersión de recuentos y muestreo temporal irregular. Suponemos que los datos de recuentos siguen la Distribución Binomial Negativa (NBD), que nosotros y otros hemos empleado previamente para modelar datos de recuentos de secuenciación microbiana [16, 23]. Para modelar el parámetro de dispersión NBD, empleamos un método similar al usado por DESeq2 [14] pero extendido para datos de series de tiempo. Modelamos la función de trayectoria de tiempo continuo para la media de NBD para cada OTU en cada sujeto utilizando B-splines cúbicos [32], que proporcionan un marco eficiente y flexible para modelar datos de series de tiempo que nosotros y otros hemos demostrado producir predicciones precisas para Conjuntos de datos biológicos longitudinales a gran escala [33]. Un desafío con los métodos B-spline es especificar la posición y el número de funciones base (puntos de interrupción). Estas opciones influyen en la cantidad de suavizado aplicado a los datos. Para superar este desafío, utilizamos un marco spline penalizado [32] con un enfoque de regularización bayesiano adaptativo. Nuestro enfoque coloca los puntos de ruptura de manera uniforme a una frecuencia alta (predeterminado de cada 2 días) y luego regulariza de manera adaptativa los coeficientes de spline en las regiones temporales cercanas para alentar cambios mínimos en la trayectoria a lo largo del tiempo, a menos que los datos justifiquen desviaciones más grandes. Para lograr esto, utilizamos un modelo de estilo lazo bayesiano adaptativo jerárquico [17, 34]. Consulte el archivo adicional 2 para obtener una descripción completa del modelo BAPCS y el algoritmo de inferencia.

El algoritmo Bayesian Adaptive Laso (BAL) en MDSINE utiliza un L 1 o técnica de regularización de tipo "lazo" para inferir la distribución sobre el crecimiento microbiano, la interacción y los parámetros del efecto de perturbación en el modelo gLV. El algoritmo BAL es adaptativo en el sentido de que permite diferentes grados de regularización en cada coeficiente, es decir, cada OTU tiene una cantidad previa diferente de reducción de parámetros de interacción que se aprende de los datos. Consulte el archivo adicional 2 para obtener detalles completos sobre el modelo BAL y el algoritmo de inferencia.

El algoritmo de selección de variable bayesiana (BVS) en MDSINE también infiere la distribución sobre el crecimiento microbiano, la interacción y los parámetros del efecto de perturbación en el modelo gLV. Sin embargo, en este enfoque utilizamos una técnica de selección de variables que modela directamente la presencia o ausencia de interacciones microbio-microbio o efectos de perturbación. Nuestro modelo aprende eficazmente una red de interacción cualitativa en las OTU y los efectos de perturbación, así como una interacción cuantitativa y una matriz de efectos de perturbación. Dicho de otra manera, los enfoques basados ​​en regularización MLCRR y BAL en MDSINE asumen que todos los bordes están presentes en la red, mientras que el enfoque BVS además aprende la presencia / ausencia de los bordes. El algoritmo BVS también nos permite calcular fácilmente los factores de Bayes [35], que proporcionan un método formal para comparar dos modelos alternativos con evidencia (datos). Para MDSINE, utilizamos factores de Bayes para evaluar modelos alternativos que indiquen la presencia o ausencia de un efecto de interacción o perturbación dados los datos. Consulte el archivo adicional 2 para obtener detalles completos sobre el modelo BVS, el algoritmo de inferencia y los cálculos de los factores de Bayes del modelo.

Benchmarking con datos simulados

Usamos el C. difficile conjunto de datos de infección para obtener estimaciones aproximadas de la escala y la variabilidad de las tasas de crecimiento, los coeficientes de interacción y las concentraciones iniciales de microbios. Las estimaciones se obtuvieron resolviendo el sistema de regresión lineal de "coincidencia de gradiente" utilizando la solución pseudoinversa y obligando a que los parámetros de crecimiento y auto-interacción se valoraran positiva y negativamente, respectivamente. Estas estimaciones se utilizaron luego para muestrear aleatoriamente los parámetros de crecimiento e interacción para un sistema hipotético de 10-OTU asumiendo un 20% de probabilidad de interacción entre pares de OTU (aproximadamente lo que observamos en el C. difficile datos de infección).

Para obtener modelos de sistemas dinámicos para probar simulaciones, requerimos que todas las OTU estén presentes en estado estable y tengan coeficientes de variación para sus trayectorias & gt0.25 para el 75% de las concentraciones iniciales probadas (evaluadas generando aleatoriamente las condiciones iniciales numerosas veces e integrando numéricamente las ecuaciones de gLV para cada condición inicial). Los parámetros del modelo de sistemas dinámicos resultantes se utilizaron luego para generar datos simulados para la evaluación comparativa. Estas simulaciones incluyeron un muestreo aleatorio de las concentraciones iniciales de OTU para diez "sujetos" y la integración numérica de las ecuaciones de gLV utilizando las concentraciones iniciales para generar trayectorias libres de ruido. Investigamos diferentes resoluciones de muestreo de puntos de tiempo, con diseños de 27, 18, 12 u 8 puntos de tiempo elegidos para imitar diseños experimentales reales para conjuntos de datos de series de tiempo de microbiomas in vivo. Consulte el archivo adicional 2 para obtener detalles completos sobre las simulaciones de datos.

A continuación, se simularon los datos de recuento ruidoso y los datos de biomasa a partir de trayectorias sin ruido utilizando modelos de distribución multinomial de Dirichlet (DMD) [19, 20] y distribución normal, respectivamente. El parámetro de dispersión para la distribución de Dirichlet Multinomial se estimó a partir de la C. difficile datos experimentales de infección (recuentos de secuenciación de amplicones de ARNr 16S) utilizando un procedimiento de máxima verosimilitud implementado en el conjunto de herramientas MGLM [36].Tenga en cuenta que el modelo DMD asume la composicionalidad de los datos (los recuentos se suman a una constante fija para cada muestra), con una dispersión excesiva de los recuentos. MDSINE utiliza un modelo de ruido alternativo basado en la Distribución Binomial Negativa (NBD), que también asume una dispersión excesiva de los recuentos, pero no asume la composición de los datos (los recuentos se generan de forma independiente para cada muestra condicionada a un parámetro de intensidad compartido). Tenga en cuenta que probamos intencionalmente el rendimiento de MDSINE en datos generados con DMD, un modelo de ruido diferente al implementado en MDSINE, para evaluar la solidez de nuestro método a la composicionalidad de los datos.

Evaluamos los resultados simulados para cada uno de los algoritmos implementados en el paquete MDSINE utilizando las siguientes métricas: (a) el error cuadrático medio (RMSE) de las tasas de crecimiento estimadas en comparación con las tasas de crecimiento de verdad del suelo (b) la RMSE de la estimación parámetros de interacción comparados con los parámetros de interacción de la verdad del terreno (c) el área bajo la curva del operador del receptor (AUC ROC) para la presencia / ausencia de interacciones, para las redes de interacción inferida en comparación con la red de la verdad del terreno (d) el RMSE de la OTU predicha trayectorias comparadas con las trayectorias de la verdad del terreno en condiciones iniciales invisibles (es decir, entrenamiento en norte - 1 asignaturas y predicción de la asignatura retenida dadas las condiciones iniciales de dicha asignatura). Las métricas anteriores se calcularon en 400 muestras para cada uno de los regímenes descritos anteriormente. Consulte el archivo adicional 2 para obtener detalles completos sobre el procedimiento de evaluación.

C. difficile predicciones de resistencia a infecciones

Para predecir qué composiciones bacterianas confieren óptimamente resistencia contra C. difficile infección, comenzamos calculando cuáles de las 2 13 - 1 posibles combinaciones bacterianas se predijo que tenían niveles de estado estacionario biológicamente significativos (es decir, concentraciones de especies ≥0) y eran estables (es decir, todos los valores propios de la matriz jacobiana evaluados en el estado estacionario tiene una parte real negativa [8] (consulte el archivo adicional 2 para obtener más detalles). Las concentraciones en estado estacionario y las determinaciones de estabilidad se realizaron a partir de una submuestra de muestras de MCMC obtenidas al ejecutar el algoritmo de inferencia BVS (1125 muestras de MCMC, utilizando una tasa de adelgazamiento de 20 de las 22.500 muestras de MCMC completas). Se mantuvieron los estados con una confianza de estabilidad muy alta (probabilidad estimada de estabilidad & gt0,9). A partir del perfil de concentración previsto de cada muestra estable de MCMC, simulamos un C. difficile desafío de infección de 105 UFC / g, correspondiente a una alta dosis infecciosa experimentalmente. Integramos numéricamente el sistema gLV correspondiente durante 28 días y determinamos para cada estado de microbiota el nivel de C. difficile infección al final del experimento numérico como la concentración media en las muestras de MCMC correspondientes. Luego determinamos qué estados (para 1 a través de todas las especies en la microbiota definida) condujeron a la mediana mínima C. difficile concentraciones a los 28 días.

Predicción de perfiles estables de estado estacionario para cócteles probióticos

Con el fin de determinar si el cambio a un régimen dietético con bajo contenido de fibra conduciría a un número reducido de estados estacionarios admisibles, así como a una biodiversidad reducida, estimamos cuál de las 2 13 - 1 posibles combinaciones bacterianas tenía un comportamiento estable y biológicamente significativo. perfil de densidad en condiciones de dieta alta y baja en fibra. Para determinar los perfiles de estabilidad en presencia de perturbaciones bajas en fibra, calculamos el parámetro de crecimiento neto para cada cepa. I como la suma de su tasa de crecimiento inferida α I y su susceptibilidad a dietas bajas en fibra γ I (parámetro de efecto de perturbación). Repetimos este análisis utilizando 1125 muestras de MCMC (con una tasa de adelgazamiento de 20 de las 22.500 muestras de MCMC completas) obtenidas al ejecutar el algoritmo de inferencia BVS. Luego, determinamos el número de estados estables estables previstos en cada condición y probamos la hipótesis nula de números iguales de cepas que coexisten de manera estable dentro de estados estables bajo ambos regímenes dietéticos aplicando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

Predicción de la piedra angular de las especies

Para investigar la importancia de cepas específicas en la comunidad de Clostridia de nuestro conjunto de datos probióticos, desarrollamos una medida cuantitativa de "keystoneness" en el paquete MDSINE. La medida comienza con la composición de la comunidad que permite que el mayor número de cepas coexista de manera estable, y luego elimina cada cepa de la comunidad a su vez. Las concentraciones en estado estacionario se calculan como se describe en la subsección anterior. A continuación, se calcula la distancia euclidiana entre las concentraciones del perfil inicial y la de cada uno de los perfiles con una deformación eliminada, excluyendo el cálculo la contribución de la deformación eliminada. Luego, las deformaciones se clasifican en función de la magnitud de las distancias obtenidas como consecuencia de su eliminación.

C. difficile infección en ratones gnotobióticos

Cultivos de bacterias comensales

Desarrollamos un conjunto de bacterias comensales humanas definidas, que denominamos flora GnotoComplex, en base a una extensa revisión de la literatura [37-52]. Las cepas se eligieron para aproximar la diversidad filogenética y las funciones clave de la microbiota en el huésped, incluida la capacidad de transformar los ácidos biliares y degradar una variedad de compuestos dietéticos (Archivo adicional 1: Tabla S2). Las bacterias GnotoComplex también se seleccionaron para que todas sean distinguibles en la región V4 del gen de ARNr 16S (tres o más diferencias de nucleótidos en la región) para garantizar que todas las cepas puedan diferenciarse con nuestro método de secuenciación de alto rendimiento. Las cepas bacterianas GnotoComplex se compraron en la American Type Culture Collection (ATCC) o en el Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) y se propagaron de acuerdo con el procedimiento de propagación en la hoja de producto para cada cepa (archivo adicional 1 : Tabla S2). Se prepararon alícuotas y se almacenaron a -80 ° C hasta que se necesitaron para la preparación del inóculo bacteriano. Se extrajo una alícuota de cada cepa bacteriana del congelador a -80 ° C y se sembró en placas para aislamiento en una base de soja tríptica con agar sangre de oveja al 5% (TSA) para las cepas aeróbicas o prereducidas Brucella agar sangre base que contiene un 5% de sangre de carnero, hemina y vitamina K (BMB) para las cepas anaeróbicas. Las placas de TSA se incubaron a 37 ° C en aire ambiente mientras que las placas de BMB se incubaron a 37 ° C en una cámara anaeróbica que contenía una atmósfera de 10% de hidrógeno, 10% de dióxido de carbono y 80% de nitrógeno. Se inspeccionó la pureza de las placas y se realizaron tinciones de Gram. Se inoculó caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI 5 mL Anaerobe Systems) con una única colonia de cada cepa bacteriana y se incubó durante la noche en condiciones apropiadas. Se determinó la DO600 y las suspensiones se diluyeron con BHI si era necesario. El inóculo bacteriano para ratones se preparó combinando las cepas bacterianas individuales en función de su DO para garantizar que cada cepa estuviera representada por igual.

Clostridium difficile cultura

C. difficile la cepa 43255 se adquirió de la ATCC y se propagó de acuerdo con la hoja de producto. Para la preparación de esporas, C. difficile se sembró en BMB para producir un césped de crecimiento y se incubó en una cámara anaeróbica durante 10 días. Las bacterias se recuperaron de la placa usando un hisopo de algodón estéril que se había humedecido previamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril. Las bacterias se suspendieron en 15 mL de PBS. La suspensión se calentó en un baño de agua a 80 ° C durante 10 min para matar las células vegetativas. Se prepararon alícuotas (1 ml), se congelaron instantáneamente usando nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C. Se extrajo una alícuota del congelador a -80ºC y se diluyó en serie con PBS y se sembró en placas de agar BHI que contenían hemina, vitamina K y taurocolato al 0,1% (p / v). Las placas se incubaron en una cámara anaeróbica durante 96 hy se determinó la concentración de esporas.

Experimentos con ratones gnotobióticos

Se criaron ratones libres de gérmenes y se mantuvieron en aisladores en el Centro de Microbioma Anfitrión de Massachusetts en el Hospital Brigham and Women. Cinco ratones C57BL / 6 machos de 8-10 semanas de edad, enjaulados individualmente, libres de gérmenes, fueron alimentados por sonda oral el día 0 con 200 μl de la mezcla bacteriana GnotoComplex para un inóculo total de ≈ 108 UFC por ratón. Los sedimentos fecales se recolectaron a 0,75, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 17, 21, 24 y 28 días después de la inoculación con las cepas GnotoComplex y se almacenaron a -80 ° C en PBS al 10%. buffer. Después de la recolección de la muestra fecal el día 28, los ratones fueron alimentados por sonda oral con 5 × 10 3 C. difficile esporas. Los sedimentos fecales se recolectaron a los 0,75, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 17, 21, 24 y 28 días después de la infección con C. difficile y se almacenó a -80 ° C en tampón PBS al 10%.

Secuenciación de ARNr 16S

El ADN genómico bacteriano se extrajo utilizando el kit de aislamiento de ADN fecal Mo Bio Power (Mo Bio Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para obtener altos rendimientos de ADN. Para aumentar los rendimientos de ADN, se utilizaron las siguientes modificaciones. Se usó un paso adicional de batidor de perlas con Faster Prep FP120 (Thermo) a 6 m / s durante 1 min en lugar de agitación con vórtice. La incubación con tampones C2 y C3 se incrementó a 10 min a 4 ° C. Las concentraciones iniciales de ácido nucleico se determinaron mediante un Qubit Fluromoter (Life Technologies). Se preparó una biblioteca de amplicones multiplexados que cubre la región V4 del gen de ADNr 16S utilizando el protocolo de [53] con códigos de barras de doble índice. El tamaño de la agrupación de bibliotecas agregadas se seleccionó entre 300 y 500 pb en un casete de agarosa al 1,5% pippin prep (Sage Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de la agrupación se midió mediante qPCR (Kapa Biosystems) y se cargó en el instrumento MiSeq Illumina (kit de 300 pb) a 6-9 pM con un aumento de phiX del 40% para compensar la baja diversidad de bases de acuerdo con el protocolo de carga estándar de Illumina. Las secuencias se depositaron en el archivo de lectura de secuencias de los NIH (acceso a la SRA SRP065075).

Procesamiento bioinformático de secuencias

Las lecturas de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando scripts Python personalizados, que realizan eliminación de ruido, filtrado de calidad y alineación con las secuencias del gen 16S rRNA de la especie en la comunidad definida. Para reducir el error de alineación, las bases de baja calidad (Q & lt 35) se recortaron usando una ventana deslizante (tamaño de la ventana = 50 nucleótidos). Se eliminaron las lecturas con caracteres ambiguos o de menos de 250 nucleótidos después del recorte. Finalmente, las lecturas recortadas se alinearon con una base de datos personalizada de secuencias de ARNr 16S utilizando blastn (ncbi-blast-2.2.29 +) con parámetros predeterminados. La base de datos blastn se construyó utilizando secuencias de ARNr 16S de longitud completa de las cepas GnotoComplex, que se extrajeron de secuencias de referencia del genoma en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o nucleótidos descargados secuencias de NCBI para los casos en los que las secuencias de referencia no estaban disponibles. Después de la alineación, las lecturas de secuenciación se asignaron a las especies utilizando los criterios: mejor acierto con identidad ≥99%, longitud de alineación ≥250 nucleótidos, sin espacios, desajustes ≤2 nucleótidos y todas las bases alineadas dentro de la hipervariable V4 de las secuencias de la base de datos. Para identificar la región hipervariable V4 de la especie en la comunidad definida, las secuencias de ARNr 16S de longitud completa se alinearon con la base de datos Silva [54] de la región V4 utilizando nhmmer [55].

Cuantificación de biomasa bacteriana mediante qPCR

Se utilizó el cebador universal de rRNA qPCR 16S (16S-F1048, GTG STG CAY GGY TGT CGT CA 16S-R1175, ACG TCR TCC MCA CCT TCC TC). La mezcla de reacción para el ensayo SYBR Green contenía 2U SYBR Green PCR Master Mix (PE Applied Biosystems), 20 pmol de cebador directo e inverso y 8 μl de ADN extraído diluido 1: 100. Las qPCR se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real Bio Rad CFX96 en condiciones estándar de ciclos térmicos, que constan de 10 min iniciales de desnaturalización a 95 ° C, seguidos de 39 ciclos de 15 s de desnaturalización a 95 ° C y 60 ° C durante 60 s de recocido / extensión. Para cuantificar la biomasa bacteriana, se prepararon curvas estándar usando ADN genómico purificado de heces de ratón libres de gérmenes enriquecidas con diluciones seriadas diez veces mayores de Escherichia coli.

Experimentos de estabilidad probiótica en ratones gnotobióticos

Cultivos bacterianos y experimentos gnotobióticos

Se compraron ratones IQI libres de gérmenes de Sankyo Laboratories, Japón y se mantuvieron en aisladores de vinilo libres de gérmenes en las instalaciones para animales de RIKEN. Se cultivaron individualmente trece cepas de Clostridia inductores de Treg (las cepas 1, 3, 8, 18 del cóctel VE202 previamente informado que constaba de 17 cepas inductoras de Treg [24]) en caldo Eggerth Gagnon (EG) modificado en condiciones estrictamente anaeróbicas ( 80% N2, 10% H2, 10% CO2) a 37 ° C en una cámara anaeróbica (Coy Laboratory Products) hasta la confluencia. Las cepas bacterianas cultivadas se mezclaron luego en cantidades iguales de volumen de medio y la mezcla de 13 cepas se inoculó por vía oral en siete ratones adultos libres de gérmenes IQI. Cinco de los ratones fueron alimentados con una dieta rica en fibra esterilizada con rayos gamma (comida CMF, Oriental Yeast Japan) durante 5 semanas, luego cambiaron a una dieta baja en fibra (dieta AIN93G-fomula, Oriental Yeast Japan) durante 2 semanas. y regresó y mantuvo la dieta CMF rica en fibra durante 2 semanas. Dos de los ratones se mantuvieron con la dieta alta en fibra durante 5 semanas y no se cambiaron a la dieta baja en fibra. Las muestras fecales se recolectaron diariamente o en días alternos. Los sedimentos fecales se recolectaron en los días 1 a 21 (diariamente), 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35-60 (diariamente), 62, 63 y 65 para los cinco ratones que recibieron la perturbación dietética y en los días 1 –21 (diariamente), 23, 25, 27 y 29 para los dos ratones que no recibieron la perturbación.

Cuantificación de concentraciones bacterianas mediante qPCR

El ADN genómico bacteriano se extrajo de 1 a 2 sedimentos fecales utilizando QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen). La cantidad de ADN se cuantificó usando un kit de ensayo Qubit dsDNA HS y un fluorómetro Qubit (Invitrogen). Luego, el ADN se sometió a qPCR utilizando Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO) y un LightCycler 480 (Roche) con cebadores específicos para genes de ARNr 16S de las 13 cepas de Clostridia (consulte el archivo adicional 1: Tabla S4). La cuantificación de cada cepa en cada muestra se logró usando curvas estándar de concentraciones conocidas de ADN purificados de cada cepa cultivada individualmente in vitro. Las densidades de cepa en cada muestra se calcularon dividiendo los números absolutos de cuantificación anteriores por el peso del ADN fecal extraído.


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6: Crecimiento microbiano / bacteriano - Biología

El yogur, los encurtidos, el chucrut y los platos condimentados con lima deben su sabor picante a un alto contenido de ácido (Figura 1). Recuerde que la acidez es función de la concentración de iones de hidrógeno [H +] y se mide como pH. Los entornos con valores de pH inferiores a 7,0 se consideran ácidos, mientras que aquellos con valores de pH superiores a 7,0 se consideran básicos. El pH extremo afecta la estructura de todas las macromoléculas. Los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las hebras de ADN se rompen a un pH alto. Los lípidos se hidrolizan mediante un pH extremadamente básico. La fuerza motriz del protón responsable de la producción de ATP en la respiración celular depende del gradiente de concentración de H + a través de la membrana plasmática (ver Respiración celular). Si los iones de H + son neutralizados por iones de hidróxido, el gradiente de concentración colapsa y perjudica la producción de energía. Pero el componente más sensible al pH de la célula es su caballo de batalla, la proteína. Los cambios moderados en el pH modifican la ionización de los grupos funcionales de los aminoácidos y rompen los enlaces de hidrógeno, lo que, a su vez, promueve cambios en el plegamiento de la molécula, promoviendo la desnaturalización y destruyendo la actividad.

Figura 1. Las bacterias del ácido láctico que fermentan la leche en yogur o transforman las verduras en encurtidos prosperan a un pH cercano a 4.0. El chucrut y platos como el pico de gallo deben su sabor picante a su acidez. Los alimentos ácidos han sido un pilar de la dieta humana durante siglos, en parte porque la mayoría de los microbios que causan el deterioro de los alimentos crecen mejor a un pH casi neutro y no toleran bien la acidez. (crédito & # 8220yogurt & # 8221: modificación del trabajo por & # 8220nina.jsc & # 8221 / Flickr credit & # 8220pickles & # 8221: modificación del trabajo por Noah Sussman credit & # 8220sauerkraut & # 8221: modificación del trabajo por Jesse LaBuff credit & # 8220pico de gallo & # 8221: modificación del trabajo por & # 8220regan76 & # 8243 / Flickr)

los pH óptimo de crecimiento es el pH más favorable para el crecimiento de un organismo. El valor de pH más bajo que un organismo puede tolerar se llama pH mínimo de crecimiento y el pH más alto es el pH máximo de crecimiento. Estos valores pueden cubrir una amplia gama, lo que es importante para la conservación de los alimentos y para la supervivencia de los microorganismos en el estómago. Por ejemplo, el pH de crecimiento óptimo de Salmonela spp. es de 7,0 a 7,5, pero el pH mínimo de crecimiento está más cerca de 4,2.

Figura 2. Las curvas muestran los rangos de pH aproximados para el crecimiento de las diferentes clases de procariotas específicos de pH. Cada curva tiene un pH óptimo y valores extremos de pH en los que el crecimiento se reduce mucho. La mayoría de las bacterias son neutrófilos y crecen mejor a un pH casi neutro (curva central). Los acidófilos tienen un crecimiento óptimo a valores de pH cercanos a 3 y los alcalófilos tienen un crecimiento óptimo a valores de pH superiores a 9.

La mayoría de las bacterias son neutrófilos, lo que significa que crecen de manera óptima a un pH dentro de una o dos unidades de pH del pH neutro de 7 (ver Figura 2). La mayoría de las bacterias familiares, como Escherichia coli, estafilococos y Salmonela spp. son neutrófilos y no les va bien en el pH ácido del estómago. Sin embargo, existen cepas patógenas de E. coli, S. typhi, y otras especies de patógenos intestinales que son mucho más resistentes al ácido del estómago. En comparación, los hongos prosperan a valores de pH ligeramente ácidos de 5,0 a 6,0.

Los microorganismos que crecen de manera óptima a un pH inferior a 5,55 se denominan acidófilos. Por ejemplo, el oxidante de azufre Sulpholobus spp. aislados de los campos de lodo sulfuroso y las aguas termales en el Parque Nacional de Yellowstone son acidófilos extremos. Estas arqueas sobreviven a valores de pH de 2,5 a 3,5. Especies del género archaean Ferroplasma viven en drenaje ácido de minas a valores de pH de 0 a 2,9. Lactobacillus Las bacterias, que son una parte importante de la microbiota normal de la vagina, pueden tolerar ambientes ácidos a valores de pH de 3,5 a 6,8 y también contribuyen a la acidez de la vagina (pH de 4, excepto al inicio de la menstruación) a través de su producción metabólica. de ácido láctico. La acidez de la vagina juega un papel importante en la inhibición de otros microbios que son menos tolerantes a la acidez.Los microorganismos acidófilos muestran una serie de adaptaciones para sobrevivir en ambientes ácidos fuertes. Por ejemplo, las proteínas muestran una carga superficial negativa aumentada que las estabiliza a un pH bajo. Las bombas expulsan activamente los iones H + de las células. Los cambios en la composición de los fosfolípidos de la membrana probablemente reflejan la necesidad de mantener la fluidez de la membrana a un pH bajo.

En el otro extremo del espectro están alcalófilos, microorganismos que crecen mejor a pH entre 8,0 y 10,5. Vibrio cholerae, el agente patógeno de cólera, crece mejor a un pH ligeramente básico de 8,0; puede sobrevivir a valores de pH de 11,0 pero es inactivada por el ácido del estómago. Cuando se trata de sobrevivir a un pH alto, el arcaico rosa brillante Natronobacterium, que se encuentra en los lagos de soda del Valle del Rift africano, puede mantener el récord a un pH de 10,5 (Figura 3). Los alcalófilos extremos se han adaptado a su entorno hostil mediante la modificación evolutiva de la estructura de lípidos y proteínas y los mecanismos compensatorios para mantener la fuerza motriz del protón en un entorno alcalino. Por ejemplo, el alcalófilo Bacillus firmus deriva la energía para las reacciones de transporte y la motilidad de un gradiente de iones Na + en lugar de una fuerza motriz de protones. Muchas enzimas de los alcalófilos tienen un punto isoeléctrico más alto, debido a un aumento en el número de aminoácidos básicos, que las enzimas homólogas de los neutrófilos.

Figura 3. Vista desde el espacio del lago Natron en Tanzania. El color rosado se debe a la pigmentación de los microbios alcalifílicos y halófilos extremos que colonizan el lago. (crédito: NASA)

Supervivencia al pH bajo del estómago

Úlceras pépticas (o Úlceras estomacales) son llagas dolorosas en el revestimiento del estómago. Hasta la década de 1980, se creía que eran causados ​​por alimentos picantes, estrés o una combinación de ambos. Por lo general, se recomendaba a los pacientes que comieran alimentos blandos, tomaran medicamentos antiácidos y evitaran el estrés. Estos remedios no fueron particularmente efectivos y la condición a menudo se repitió. Todo esto cambió drásticamente cuando la causa real de la mayoría úlceras pépticas se descubrió que era una bacteria delgada con forma de sacacorchos, Helicobacter pylori. Este organismo fue identificado y aislado por Barry Marshall y Robin Warren, cuyo descubrimiento les valió el Premio Nobel de Medicina en 2005.

La habilidad de H. pylori sobrevivir al bajo pH del estómago parecería sugerir que es un acidófilo extremo. Resulta que este no es el caso. De hecho, H. pylori es un neutrófilo. Entonces, ¿cómo sobrevive en el estómago? Notablemente, H. pylori crea un microambiente en el que el pH es casi neutro. Lo logra produciendo grandes cantidades de la enzima ureasa, que descompone la urea para formar NH4 + y CO2. El ion amonio eleva el pH del entorno inmediato.

Esta capacidad metabólica de H. pylori es la base de una prueba de infección precisa y no invasiva. Se administra al paciente una solución de urea que contiene átomos de carbono marcados radiactivamente. Si H. pylori está presente en el estómago, descompondrá rápidamente la urea, produciendo CO radiactivo2 que se puede detectar en la respiración del paciente. Debido a que las úlceras pépticas pueden provocar cáncer gástrico, los pacientes que se determine que tienen H. pylori las infecciones se tratan con antibióticos.

Piénsalo

  • ¿Qué efecto tienen los extremos de pH en las proteínas?
  • ¿Qué tipo de bacterias adaptadas al pH serían la mayoría de los patógenos humanos?

Conceptos clave y resumen

  • Las bacterias son generalmente neutrófilos. Crecen mejor a un pH neutro cercano a 7.0.
  • Acidófilos crecer de manera óptima a un pH cercano a 3,0. Alcalófilos son organismos que crecen de manera óptima entre un pH de 8 y 10,5. Los acidófilos y alcalófilos extremos crecen lentamente o no tienen un pH cercano al neutro.
  • Los microorganismos crecen mejor en su pH óptimo de crecimiento. El crecimiento se produce lentamente o no se produce por debajo del pH mínimo de crecimiento y por encima del pH máximo de crecimiento.

Opción multiple

¿Cuáles de las siguientes son probablemente las bacterias que crecen en el drenaje de la mina a pH 1-2?

Bacterias aisladas del lago Natron, donde el pH del agua es cercano a 10, ¿cuál de las siguientes es?

¿En qué entorno es más probable que se encuentre con un acidófilo?

  1. sangre humana a pH 7,2
  2. un respiradero caliente a pH 1,5
  3. intestino humano a pH 8,5
  4. leche a pH 6,5

Complete el espacio en blanco

Una bacteria que prospera en un lago de soda donde el pH promedio es 10.5 puede clasificarse como un (a) ________.

Lactobacillus acidophilus crece mejor a pH 4.5. Se considera un ________.


Métodos

Ingeniería de deformación

La cepa parental para ambas cepas de prueba utilizadas en este documento fue Escherichia coli BW25113 (Δ (araD-araB) 567 ΔlacZ4787 (: rrnB-3) λ rph-1 Δ (rhaD-rhaB) 568 hsdR514) obtenido del Yale Coli Genetic Stock Center (New Haven, CT). Para la producción de licopeno, la cepa parental se transformó con el plásmido pAC-LYC 17, un regalo de Francis X. Cunningham Jr (plásmido Addgene nº 53270). Para la producción de RFP (mRFP1), la cepa parental se transformó con el plásmido pFAB3992 22, un regalo de Drew Endy (plásmido Addgene nº 47823). Las secuencias de plásmidos (datos suplementarios 3) y los mapas (figura suplementaria 17) están disponibles en línea. Todos los reactivos utilizados en este documento con el fabricante, el producto y los números de lote están disponibles en línea (Tabla complementaria 2).

pAC-LYC se recibió transformado en E. coli Top10 en una puñalada de agar (plásmido Addgene # 53270). Se preparó una placa de agar caldo de lisogenia (LB) (10 g L -1 de triptona, 5 g L -1 de extracto de levadura, 10 g L -1 de cloruro sódico y 15 g L -1 de agar bacto) con 25 μg mL -1 de cloranfenicol. rayado con una punta de pipeta estéril sumergida en el agar puñalada, y se incubó durante la noche a 37 ° C. Se recogió una sola colonia y se cultivó durante la noche en 5 ml de LB (10 g L -1 de triptona, 5 g L -1 de extracto de levadura y 10 g L -1 de cloruro de sodio) con 25 μg ml -1 de cloranfenicol. El plásmido se preparó utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante. La identidad del plásmido se confirmó mediante digestión con Pst1-HF (Fig. 18 complementaria).

La cepa parental se recibió en un disco de papel deshidratado. El disco se colocó en una placa de agar LB utilizando pinzas esterilizadas y se rehidrató con una gota de LB. Se utilizó una punta de pipeta estéril para eliminar la humedad del disco y la placa se incubó durante la noche a 37 ° C. Se recogió cuidadosamente una sola colonia con una punta de pipeta estéril y se inoculó en 5 ml de LB, que se incubó durante la noche durante 16 ha 37 ° C, agitando a 250 rpm con un diámetro de agitación de 25 mm (agitador orbital Thermo Fisher Forma modelo 440) . En total, se utilizaron 20 μL del cultivo nocturno para inocular 2 mL de LB fresco, que luego se incubó en la misma incubadora durante 2 h. Las células se resuspendieron en 100 μl de solución de cloruro de calcio filtrada esterilizada y enfriada con hielo 100 mM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. En total, se añadió 1 μL de plásmido preparado con pAC-LYC (concentración aproximada de 90 ng μL -1) a la suspensión celular y las células se incubaron en hielo durante 30 min. Las células se sometieron a choque térmico en un baño de agua a 42 ° C durante 30 sy luego se incubaron en hielo durante 2 min. En total, se agregaron 400 μL de medio SOC a las células y se incubaron a 37 ° C con mezcla suave durante 1 h. En total, se pipetearon 25 μL de la solución celular en una placa de agar LB con cloranfenicol y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Se recogió una sola colonia de la placa de agar, se incubó en 5 mL de LB con cloranfenicol y se cultivó durante 4 h. En total, se mezclaron 750 μL del cultivo con 750 μL de glicerol filtrado estéril al 50% en un criovial para almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. Todas las células productoras de licopeno utilizadas en este artículo se derivaron de esta reserva de glicerol.

pFAB3992 se recibió transformado en mi. coli BW25113 en una reserva de glicerol congelada. Una placa de agar LB con 50 μg mL-1 de kanamicina se rayó con una punta de pipeta estéril rayada a través del stock de glicerol y se incubó durante la noche a 37 ° C. Se recogió una sola colonia de la placa de agar, se incubó en 5 mL de LB con kanamicina y se cultivó durante 4 h. En total, se mezclaron 750 μL del cultivo con 750 μL de glicerol filtrado estéril al 50% en un criovial para almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. Todas las células productoras de RFP utilizadas en este documento se derivaron de esta reserva de glicerol.

Cultivo de células

Se sembraron placas de agar LB con el antibiótico apropiado (25 μg mL -1 de cloranfenicol o 50 μg mL -1 de kanamicina) con una punta de pipeta estéril de reservas de glicerol y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las placas se almacenaron, envueltas en Parafilm M (Bemis NA, Neenah WI), a 4 ° C durante hasta 2 semanas, después de lo cual se desecharon. Todos los cultivos se cultivaron en variantes de Terrific Broth (TB), que tiene una composición inicial de 24 g L -1 de extracto de levadura, 12 g L -1 de triptona, 5 g L -1 de glicerol, 0,17 mol L -1 KH2correos4y 0,72 mol L −1 K2HPO4 29. Estos valores se utilizaron como valores centrales para la composición de los medios. Modificamos esta receta agregando sulfato de magnesio para complementar el contenido deficiente de magnesio en el extracto de levadura 18 y agregando cloruro de sodio para ajustar la osmolalidad 30.

Cada experimento comenzó con un cultivo iniciador líquido. Se recogió una sola colonia de la placa de agar, se inoculó en 4 ml de TB con el antibiótico apropiado en un tubo de cultivo de vidrio de 16 × 100 mm con tapa de plástico (VWR 47729-576) y se cultivó durante 16 ha 37 ° C, agitando a 250 rpm con un diámetro de agitación de 25 mm. Este cultivo se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una DO600 = 0,5 (medido en una cubeta de semimicropoliestireno BRAND en un medidor de densidad celular WPA Biowave CO8000), y luego se usó como cultivo iniciador para inocular los experimentos. Se preparó un nuevo cultivo iniciador cada día en el que se inició un ciclo experimental. Todas las corridas experimentales que comenzaron el mismo día se inocularon a partir del mismo cultivo iniciador, excepto los cultivos con diferente edad del inóculo. Para la edad del inóculo de 3 h, se tomó una alícuota de 50 μL del cultivo iniciador de 16 h y se utilizó para inocular 4 mL de medio fresco en un tubo de cultivo de vidrio, y se devolvió a la incubadora durante 3 h, luego se retiró y se diluyó a sobredosis600 = 0,5. Este cultivo se encontraba en fase exponencial en el momento en que se sacó de la incubadora. Para la edad del inóculo de 16 + 96 h, después de la incubación habitual de 16 h, el cultivo iniciador se almacenó a 4 ° C durante 96 h, y luego se retiró y se diluyó a OD.600 = 0,5 para su uso.

Para cultivos con pH variable o capacidad tampón variable, la composición del medio se determinó resolviendo simultáneamente la ecuación de Henderson-Hasselbach:

y la ecuación para la capacidad tampón:

por [A ] y [DECIR AH], dónde A es la base conjugada, DECIR AH es el ácido conjugado y pKa para los tampones de fosfato es 6,86 31. Al resolver estas dos ecuaciones para la composición de TB de línea base, se obtiene un pH = 7.5 y una capacidad tampón = 90 mM. La adición de los componentes restantes del medio redujo el pH entre 0,3 y 0,5 unidades de pH. Al diseñar los experimentos, apuntamos a un pH de 7.0, 7.5 u 8.0. Medimos el pH del medio con un medidor de pH y descubrimos que el pH real era

Para cultivos con osmolalidad variable, la osmolalidad de todos los componentes del medio se calculó asumiendo la disociación completa de las especies iónicas y la osmolalidad determinada empíricamente del extracto de levadura y triptona de 6 mmol L kg -1 g -1. Se añadió cloruro de sodio para aumentar la osmolalidad al nivel deseado 30. La osmolalidad de 12 soluciones de medios diferentes, medida por el osmómetro de presión de vapor Wescor Vapro 5520, estaba dentro del 7% del valor objetivo (Tabla complementaria 3).

El crecimiento de nuestras cepas de prueba para los experimentos factoriales (Fig. 1a y Fig. 9a complementaria) se realizó en las condiciones enumeradas en la Tabla 1 y los Datos complementarios 1-2, y el crecimiento de nuestras cepas de prueba para las réplicas del punto central se realizó bajo las condiciones enumeradas en la Tabla 2. La tabla de diseño experimental completa, con todos los ajustes para cada ejecución, está disponible en línea (Datos suplementarios 1-2). Se prepararon reservas de cada componente de medio individual a una concentración 10X del valor del punto central con agua desionizada, excepto el sulfato de magnesio y el fosfato dipotásico, que se compraron. Las existencias se esterilizaron en un autoclave, excepto el glicerol, que se esterilizó con un filtro de jeringa de 0,22 µm (Whatman Puradisc FP30). La posición de cada corrida en un plato, y el orden en que se prepararon y muestrearon las corridas, fue aleatoria.

Se utilizaron cuatro tipos diferentes de cubiertas de contenedores (Tabla complementaria 2 y Datos 1, 2). Las placas de micropocillos se cubrieron con la membrana AeraSeal adhesiva permeable a los gases (E & ampK Scientific) o la membrana AeraSeal y una cinta de papel de aluminio impermeable a los gases (Bio-Rad). La membrana AeraSeal se aplicó primero para evitar el contacto directo entre el medio líquido y la cinta de papel de aluminio. Los matraces de agitación se cubrieron con las cubiertas de espuma de silicona permeable al gas (Bellco Glass) o con dos capas de papel de aluminio impermeable al gas asegurado con ParaFilm envuelto alrededor de la base del cuello del matraz.

Ensayo de calibración

Nuestro ensayo de absorbancia para el licopeno se calibró usando un estándar de licopeno de 1 mg (Sigma, L9879-1MG, Lote # SLBS4759 y SLBV5371). El estándar liofilizado fue estable durante solo 48 h después de disolverse en disolvente. Una mezcla 1: 1: 1 (v / v / v) de metanol, acetona y diclorometano fue el disolvente para la calibración. La mezcla se preparó mezclando 30 ml de cada uno de los tres disolventes. El estándar de licopeno se disolvió en 40 ml de disolvente en un tubo Falcon de polipropileno de 50 ml agitando y agitando durante 10 min hasta que se disolvió el estándar. El tubo se cubrió con papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. En total, se diluyeron 240 μL de la solución estándar con 2,76 mL de disolvente para crear una solución con una concentración nominal de 2 μg mL -1. Esta solución se transfirió a una cubeta Hellma Analytics 6030-10-10 (longitud de paso de 10 mm), junto con 3 ml de disolvente transferidos a una segunda cubeta para que sirviera como blanco. Se midió la absorbancia sustraída del fondo de la solución estándar para determinar su concentración usando los valores reportados de los picos de absorbancia y los coeficientes de extinción molar del licopeno en los tres disolventes 1 (Tabla complementaria 4).

Usamos el estándar de licopeno para calibrar nuestro lector de placas Molecular Devices SpectraMax i3. Un espectro de absorbancia mostró que los tres picos de absorbancia para el licopeno estaban a 449 nm, 475 nm y 507 nm (Fig. 19a complementaria). Preparamos soluciones que varían en concentración de 0 a 8 μg mL -1 a partir de la solución estándar principal. Dispensamos cinco alícuotas de 200 μL de cada solución y un blanco de disolvente en pocillos aleatorizados en una placa de 96 pocillos de fondo transparente de polipropileno. Medimos la absorbancia de la placa a 475 nm y 507 nm, y usamos estos valores para generar una curva de calibración (Fig. 19b complementaria). Esta calibración se realizó dos veces, con 4 meses de diferencia, y se obtuvieron curvas similares en ambas calibraciones. Hicimos un promedio de la pendiente de las dos curvas para calibrar las mediciones de absorbancia de licopeno.

Para calibrar las mediciones de densidad óptica a 700 nm (porque RFP absorbe a 600 nm 2) en el lector de placas para secar la masa celular, inoculamos 50 ml de TB en un matraz de agitación de 250 ml con una sola colonia de células y lo incubamos durante 24 h. A partir de este cultivo, creamos seis cultivos diferentes de células de 20 ml en tubos Falcon de 50 ml con OD700 que van de 1 a 6, utilizando PBS para las diluciones. Retiramos 250 μL de cada uno y volvimos a diluir con 1 mL de PBS. Agregamos cinco alícuotas de 200 μL de cada dilución y un blanco de PBS a un pocillo asignado al azar en una placa de poliestireno de fondo transparente de 96 pocillos, y medimos la DO700 para cada pozo.

Los tubos Falcon con los cultivos de 20 mL se centrifugaron a 6000 × gramo durante 10 min. Se eliminó el sobrenadante, se resuspendieron las células en PBS y se lavaron. Las células se centrifugaron nuevamente a 6000 × gramo durante 10 min, se vertió el sobrenadante y se aspiró todo el líquido restante. Los tubos se colocaron sin tapar en una estufa de secado a 105 ° C durante 24 h. A continuación, se retiraron los tubos, se taparon y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Los sedimentos de células secas se retiraron cuidadosamente y se pesaron en una balanza con 0,1 mg de precisión. Las medidas de absorbancia y las masas de los sedimentos celulares se utilizaron para generar una curva de calibración (Fig. 20 complementaria). La calibración se realizó dos veces y promediamos las pendientes de las dos curvas para calibrar la DO.700 para secar la masa celular.

Rendimiento del ensayo

Al final del tiempo de crecimiento experimental, se analizó una alícuota de 250 μl de cada cultivo para determinar la masa de células secas y el título. La alícuota de 250 μl (en una placa de 96 pocillos de pozos profundos) se diluyó con 1 ml de PBS. Se transfirió una alícuota de 40 µl de las células diluidas a 160 µl de PBS en una placa de 96 pocillos de poliestireno de fondo transparente y se mezcló. La absorbancia a 700 nm se midió en un lector de placas Molecular Devices SpectraMax i3. Para las células que expresan RFP, también se midió la fluorescencia en el lector de placas con excitación a 585 nm y emisión a 625 nm.

Para las células que expresan licopeno, que se acumula en la membrana citoplasmática 32, los 1210 μL restantes de las células diluidas se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron en una microcentrífuga Eppendorf MiniSpin con rotor F-45-12-11 a 1100 ×gramo (4000 rpm) durante 4 min. Se aspiró el sobrenadante y luego se extrajo el licopeno utilizando una versión modificada de un protocolo previamente publicado 33. En total, se agregaron 250 μl de metanol y los tubos se agitaron vigorosamente durante 5 s para romper el sedimento celular. Luego se usó una punta de pipeta para romper aún más el sedimento. En total, se agregaron 250 μl de acetona y los tubos se agitaron vigorosamente durante 5 s nuevamente. Luego, se agregaron 250 μL de diclorometano, los tubos se agitaron vigorosamente durante 5 sy luego se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 10 min para completar la extracción de licopeno de los sedimentos celulares. Los tubos se centrifugaron a 12.000 ×gramo (13.400 rpm) durante 5 min para sedimentar los restos celulares, y luego se transfirieron alícuotas de 200 μL a pocillos asignados al azar en una placa de 96 pocillos de polipropileno de fondo transparente, junto con cuatro alícuotas de blancos de disolvente. Durante el proceso de alícuota, la placa se cubrió con una cubierta de placa de polipropileno para minimizar la evaporación, que es una preocupación cuando se trabaja con pequeños volúmenes de disolventes volátiles. Se midió la absorbancia a 475 nm, 507 nm y 600 nm en el lector de placas. El licopeno no absorbe a 600 nm. Se utilizó la absorbancia a 600 nm para detectar la presencia de contaminación en las muestras. Las curvas de calibración se aplicaron a las mediciones de absorbancia a 475 nm y 507 nm para estimar la concentración de licopeno en estos dos picos de absorbancia, y luego se promediaron para determinar la concentración de licopeno en la muestra.

Análisis de los datos

Todos los datos sin procesar y procesados ​​están disponibles en línea (Datos complementarios 4), en doi: 10.6084 / m9.figshare.6848957 y https://github.com/arielhecht/cell-metrics. Las mediciones de absorbancia y fluorescencia se recogieron a través del software Molecular Devices SoftMax Pro 6.4. Todo el análisis de datos se realizó en R con el paquete FrF2 34 para el diseño y análisis factorial fraccional, los paquetes tidyverse 35 para la transformación de datos y el paquete ggplot2 36 para la generación de figuras.

La repetibilidad es la proximidad de la concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo mensurando realizadas en las mismas condiciones de medición 37. La reproducibilidad es la proximidad de la concordancia entre los resultados de las mediciones del mismo mensurando realizadas en condiciones cambiadas de mediciones (que pueden incluir el principio de medición, el método de medición, el observador, el instrumento de medición, el estándar de referencia, la ubicación, las condiciones de uso o tiempo) 37. Evaluamos la reproducibilidad bajo condiciones cambiantes de uso y tiempo.

En este artículo, definimos el título como la cantidad de producto producido (mg de licopeno o unidades arbitrarias de fluorescencia de RFP) por volumen de cultivo. Definimos la masa de células secas como la masa de células secas por volumen de cultivo. Definimos rendimiento como la relación entre la cantidad de producto producido por masa de células secas, que es el cociente del título sobre el rendimiento.

La magnitud del efecto relativo es el valor absoluto de la diferencia entre la respuesta media en cada nivel dividida por la respuesta media global. Por un factor, XI, en dos niveles, - y +, con una respuesta Y, la magnitud relativa del efecto es

Por dos factores, XI y Xj, la magnitud relativa del efecto es