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¿Cómo encontrar sitios de unión de miARN en un gen específico?


Estoy tratando de encontrar miARN que se unan al 3'UTR de un gen específico. ¿Cuál es la mejor manera de hacerlo (es decir, con un buen análisis de puntuación que es el más utilizado por los investigadores en esta área)? También me gustaría conocer los otros métodos posibles si hay varias formas de hacer esto.


Hay algunas herramientas para predecir el enlace:

  1. TargetScan (basado en la coincidencia de semillas [principal], emparejamiento adicional, contexto de secuencia 1 - composición de nucleótidos alrededor del sitio, etc. [secundaria])
  2. miRanda (basado en la estabilidad de la hibridación y la coincidencia de semillas [primaria] y el contexto de secuencia [secundaria])
  3. PicTar (agrega una capa de criterios de conservación evolutivos)

1 Contexto significa la posición del sitio objetivo en el 3'UTR y la composición de nucleótidos circundante (que también se considera una métrica indirecta de estructura secundaria)

miRanda y TargetScan también tienen clases llamadas objetivos conservados y no conservados. miRanda informa las puntuaciones de miRSVR y TargetScan informa las puntuaciones de contexto, pero estas medidas se basan en pocos resultados experimentales y mayo no siempre ser significativo. miRSVR se basa en el cambio en la expresión de la diana tras la sobreexpresión / eliminación de miARN. También utiliza métricas para el contexto del sitio de destino. El puntaje de contexto + de TargetScan incluye muchas métricas que incluyen la abundancia y conservación del objetivo junto con el puntaje de contexto regular. Algunas de estas métricas pueden ser más útiles que otras. Pero las puntuaciones basadas solo en experimentos de miARN OE / KD pueden ser engañosas, especialmente si la expresión objetivo se cuantifica solo a nivel de ARN. La abundancia objetivo también varía entre diferentes tipos de células. Para obtener más detalles sobre estas métricas, consulte los artículos correspondientes a estas herramientas.

Existen algunos procedimientos experimentales para la determinación de la diana que implican principalmente la reticulación de proteína-ARN seguida de inmunoprecipitación de Ago y posterior cuantificación mediante secuenciación de ARN. Consulte HITS-CLIP y PAR-CLIP. Estas tecnicas no realmente encontrar los objetivos. Todo lo que hacen es correlacionar los niveles de miARN y sus objetivos predichos adjuntos a Ago (no sabrá exactamente si el ternario ARNm-miARN-Hace complejo realmente formado o no).

CLASH es una técnica más reciente que intenta abordar este problema ligando ARNm con miARN. De esta forma puede capturar la interacción miRNA-mRNA. Sin embargo, soy un poco escéptico con CLASH; Yo mismo estuve trabajando en este principio hace algún tiempo y enfrenté este desafío. CLASH comprende aproximadamente los siguientes pasos:

  • Reticular proteína-ARN
  • Inmunoprecipitado
  • Use ARNasa para digerir regiones libres de ARNm (y hágalo lo suficientemente pequeño para un experimento de secuenciación de lectura corta)
  • Ligar miRNA y mRNA unidos a Ago usando RNA ligasa
  • Degrade Ago usando proteasa
  • Secuenciar el par miRNA-mRNA ligado

Mi duda era cómo se ligarían miRNA y mRNA cuando la huella de Ago es más grande que un miRNA (reportado ~ 50-60 nt en HITS-CLIP y PAR-CLIP). Cuando el ARN está protegido por nucleasa, ¿cómo puede ser accesible para la ligasa? Cuando estaba pensando en ello, pensé que era necesaria una degradación parcial de la proteína (después del paso de la ARNasa y antes del paso de la ligasa) para dar algo de espacio para que actúe la ligasa. Eventualmente no trabajé más en eso. Tres años después se publicó el artículo CLASH y me alegré de que alguien lo hiciera funcionar. Pero el problema de la ligasa no se abordó (¡parece haber funcionado, pero no sé cómo!).

Para probar las predicciones, puede utilizar un ensayo informador (como GFP o luciferasa) con el 3'UTR clonado aguas abajo del informador. Estos también pueden tener artefactos. Se debe evitar la sobreexpresión del miARN y se deben realizar mutaciones de la semilla para determinar la capacidad de direccionamiento.

Otra técnica para determinar un ARNm diana es enmascarar su sitio de unión de miARN predicho y ver el efecto sobre la expresión. Esto se ha hecho en el pez cebra utilizando morfolinos complementarios a los sitios objetivo, pero no en otros modelos AFAIK. Esto me parece un ensayo elegante, sin sobreexpresión y puede determinar con precisión el sitio objetivo.


Verificaría minuciosamente la literatura sobre el UTR que le interesa, mucho de esto ya se ha hecho para muchas regiones genómicas desde que comenzó nextgen seq.

Primero, querrá usar algoritmos de predicción computacional para ayudarlo a obtener una buena lista de candidatos de miARN.

La interacción entre un miARN y sus ARNm diana se estudia habitualmente mediante cotransfección de un vector de expresión informador que contiene la región 3'-UTR del ARNm y una molécula inhibidora o precursora del miARN.

Pero esto no mide la interacción directa y física entre un miRNA y un mRNA específico. Para medir más específicamente la unión, deberá realizar un ensayo de cambio de electromovilidad.

Aquí hay una herramienta comercial que funcionará bien si solo está tratando de identificarla.

http://www.activemotif.com/catalog/905/lightswitch-synthetic-mirna-target-reporter-collection

No creo que existan otros métodos muy efectivos / fáciles.

Supongo que podrías hacer algo como hibridarlo, ejecutar el hyb en un gel, sacar la banda y seq.


Cómo probar si un microARN determinado regula un gen de interés - microrna target (30 / Sep / 2009)

Hola,
Soy un novato en este campo, así que perdone esta simple pregunta.
Tengo un gen de interés, X, que se prevé que tenga muchos
sitios objetivo conservados para microARN.
¿Cómo hago para averiguarlo?
1) ¿Cuáles de los muchos microARN que se dirigen a este gen son realmente reales y funcionales?
Una forma en la que puedo pensar es mirar los datos de expresión génica y ver
si el microARN y la diana muestran anticorrelación en muchos tipos de células.
Resulta que hay muchos microARN que están anticorrelacionados con este gen.
(podría ser porque no tengo tantos datos de expresión para descartar
anticorrelación espuria o casual de los auténticos).
Otra forma es clonar el 3 & # 39UTR del gen y también el
mutante 3 & # 39UTR con el par de 6 pb eliminado en un vector de luciferasa y
ver si en un sistema de transfección están regulados a la baja al agregarse
el microARN.
Pero si muchos microARN apuntan a este gen, tendría que hacer esto
uno a uno. ¿Existe alguna alternativa?

¿Cuál es la forma estándar de validar la acción de un microARN dado en
un objetivo o encontrar una lista de microARN que actúan sobre este gen y su
efecto relativo?
Estaría agradecido si alguien también pudiera indicarme literatura relevante sobre
cómo hacer esto experimentalmente.

lesande el 30 de septiembre de 2009, 02 & # 5854 PM dijo:

Hola,
Soy un novato en este campo, así que perdone esta simple pregunta.
Tengo un gen de interés, X, que se prevé que tenga muchos
sitios objetivo conservados para microARN.
¿Cómo hago para averiguarlo?
1) ¿Cuáles de los muchos microARN que se dirigen a este gen son realmente reales y funcionales?
Una forma en la que puedo pensar es mirar los datos de expresión génica y ver
si el microARN y la diana muestran anticorrelación en muchos tipos de células.
Resulta que hay muchos microARN que están anticorrelacionados con este gen.
(podría ser porque no tengo tantos datos de expresión para descartar
anticorrelación espuria o casual de los auténticos).
Otra forma es clonar el 3 & # 39UTR del gen y también el
mutante 3 & # 39UTR con el par de 6 pb eliminado en un vector de luciferasa y
ver si en un sistema de transfección están regulados a la baja al agregarse
el microARN.
Pero si muchos microARN apuntan a este gen, tendría que hacer esto
uno a uno. ¿Existe alguna alternativa?

¿Cuál es la forma estándar de validar la acción de un microARN dado en
un objetivo o encontrar una lista de microARN que actúan sobre este gen y su
efecto relativo?
Estaría agradecido si alguien también pudiera indicarme literatura relevante sobre
cómo hacer esto experimentalmente.

Choi WY, Giraldez AJ, Schier AF. Los protectores objetivo revelan la amortiguación y el equilibrio del agonista y antagonista nodal por miR-430. Ciencias. 2007 Oct 12318 (5848): 271-4. Publicación electrónica del 30 de agosto de 2007.

Mi opinión es que el ensayo de luciferasa es la mejor manera de proceder inicialmente, aunque más tarde los experimentos de morfolino in vivo serían buenos después de que usted haya validado la represión por luciferasa. Creo que será difícil demostrar que el morfolino es realmente específico para su ARNm. ¿Cómo podría demostrar que cualquier cambio en la proteína "A" que ve no se debe a un efecto indirecto de la represión del objetivo "B" genuino reprimido, lo que da como resultado la represión indirecta de su gen de interés "A" (si eso tiene algún sentido - es decir, "B" regula directa (o indirectamente) a "A" y no hay una regulación directa de miARN de "A"). El morfolino podría ser específico del sitio de unión del miARN, pero ¿cuántos sitios de unión hay en el genoma? Jon, corrígeme si me equivoco

Tiene razón, se necesitan controles cuidadosos para mostrar la especificidad de una interacción Morfolino-ARN. Los oligos Morfolino son más específicos que la mayoría de los otros tipos antisentido (debido a la baja afinidad por base y el consiguiente requisito de complementariedad prolongada), pero la unión fuera del objetivo a veces ocurre lo suficiente como para causar resultados engañosos. Hasta donde yo sé, el problema de demostrar la especificidad para un oligo que protege un sitio objetivo de miARN no se ha resuelto a fondo. El último párrafo de esta discusión aborda específicamente una nueva técnica para controlar la especificidad de los protectores diana. Muchas de estas técnicas requieren un control cuidadoso de la dosis de oligo, por lo que las concentraciones de solución de los morfolinos deben confirmarse mediante espectrometría UV antes de la dosificación.

Para el bloqueo de la traducción o los morfolinos modificadores de empalme, un método común para controlar la especificidad es usar dos morfolinos distintos con sitios diana que no se solapen. Si los oligos se utilizan en experimentos separados y producen el mismo cambio, esto apoya la hipótesis de que el cambio observado se debe a interacciones con el ARN diana y no a interacciones no intencionales entre Morfolino-ARN (ya que una unión aleatoria de ARN a un oligo sería es poco probable que tenga suficiente complementariedad con el segundo oligo para provocar el mismo cambio con cada uno). Tenga en cuenta que los dos oligos normalmente tendrán una eficacia algo diferente, y la dosis mínima que provoca el cambio deberá determinarse de forma independiente. Una segunda prueba de especificidad que utiliza el mismo par de oligos implica coinyectar el par de oligos y buscar sinergia de dosis: si un fenotipo provocado por un solo Morfolino puede reproducirse mediante una coinyección donde la suma de las concentraciones de los dos oligos coinyectados es considerablemente menor que la concentración del oligo único original, esto apoya la hipótesis de que el fenotipo era específico.

Volviendo al bloqueo de la actividad de miARN con Morfolinos. Primero, cuando se dirige al miRNA en sí, se usa un Morpholino que se dirige a la hebra guía (y generalmente se superpone al sitio guía-Dicer) y se usa otro oligo que se dirige a la hebra estrella (generalmente dirigido a Star-Dicer). Mientras que el oligonucleótido dirigido a estrellas no puede unirse al miARN en RISC (asumiendo que la hebra estrella no se carga en RISC), el oligo estrella-Dicer puede inhibir la maduración del miARN (protegiendo el sitio Dicer de la escisión). Esto significa que los dos oligos pueden usarse como un par de control de especificidad, mientras que el oligo estrella podría producir un fenotipo ligeramente más débil, la capacidad de fenocopiar principalmente el oligo guía apoya la hipótesis de la especificidad. Sin embargo, esto se complica por la estrecha similitud de secuencia dentro de las familias de miARN. Los morfolinos generalmente todavía pueden unirse lo suficientemente bien como para tener algún efecto biológico incluso si hay un par incorrecto o dos entre el oligo y su objetivo. Para apuntar a un miembro de una familia, trato de diseñar oligos que se superpongan a más secuencias de bucle, ya que dentro de una familia de miARN, la región de bucle generalmente está mucho menos conservada que las secuencias guía o estrella. El control de cadena en estrella fue propuesto por primera vez por Wigard Kloosterman: Kloosterman WP, Lagendijk AK, Ketting RF, Moulton JD, Plasterk RH. La inhibición dirigida de la maduración de miARN con morfolinos revela un papel del miR-375 en el desarrollo de los islotes pancreáticos. PLoS Biol. 2007 245 (8) de julio: e203

A continuación, apuntar a los sitios objetivo de miARN. No hay muchos informes de protección de diana con morfolinos en la literatura, por lo que no se ha llegado a un consenso sobre las técnicas para el control de la especificidad. Una posibilidad es utilizar dos oligonucleótidos que protegen la diana, cada uno de los cuales cubre la mitad del sitio diana del miARN y se extiende en diferentes direcciones a través de la secuencia flanqueante. Primero se utiliza uno u otro de estos y se determinan las concentraciones que producen un fenotipo débil. Cuando ambos se usan juntos, el fenotipo debería fortalecerse considerablemente, mostrando un efecto de sinergia de dosis SI los fenotipos de oligo único son causados ​​por el bloqueo del sitio objetivo del miARN deseado. Una buena confirmación es reducir la concentración de los oligos coinyectados y determinar si todavía están produciendo el fenotipo de interés a una concentración sumada por debajo de la requerida para un solo oligo. Esta no es una técnica bien examinada y todavía no la he visto publicada, pero es un enfoque que se asemeja a las técnicas estándar utilizadas para otras clases de objetivos Morpholino.

Al releer nuestra publicación original, veo que no abordé directamente la situación que planteaste. Si bien la estrategia de dos oligonucleótidos que describí ayuda a mostrar que un efecto particular se debe a la modulación de la expresión de un ARNm particular, no prueba la vía de esa modulación. Aún es posible que el par de oligo esté modulando la expresión de un ARNm diferente que codifica una proteína (por ejemplo, un factor de transcripción) que modula por sí mismo la expresión del ARNm de interés. Sin embargo, la probabilidad de que el ARNm diferente tenga suficiente homología con el elemento de respuesta del miARN y su entorno (50 bases para dos oligos) es muy baja para que los dos oligos pasen una prueba de especificidad modulando este ARN diferente.

Presenta un problema interesante. El ensayo de luciferasa es útil porque muestra que los oligos están interactuando con el elemento de respuesta de miARN putativo (MRE), pero es una prueba suficiente de que la expresión del gen de interés se modula principalmente mediante la unión de su MRE y no la vía más tortuosa. como propusiste? ¿Qué experimento demostraría rigurosamente que no hay otra vía involucrada in vivo?

Su estrategia de doble morfolino es muy buena y estoy de acuerdo en que sería poco probable que otra UTR de 3 & # 39 tuviera una secuencia similar de 50 pb. Lo que deduje del documento que citó fue que usaron un solo morfolino para bloquear el MRE en el 3 & # 39 UTR. En este caso fue convincente porque abordaron el problema desde varias otras direcciones (por ejemplo, los reporteros de GFP in vivo y el knockout de Dicer) y llegaron a la misma conclusión. Sin los otros datos que lo corroboran, su conclusión no sería tan sólida. Por supuesto, el mismo principio se aplica al enfoque de la luciferasa, ya que generalmente tiene inconvenientes, como ser un sistema de sobreexpresión en muchos casos.

El experimento más riguroso que se me ocurre sería utilizar HITS-CLIP u otras tecnologías similares de precipitación / secuenciación que se están desarrollando. Es de esperar que estas técnicas se conviertan en la norma en un futuro próximo, con tiempo y costos reducidos.

Estoy de acuerdo, HITS-CLIP parece una gran estrategia para mostrar interacciones directamente. Creo que será difícil encontrar una técnica más convincente.


Introducción

Los microARN (miARN) son pequeñas moléculas de ARN no codificantes con una longitud de base de 21 a 25 nucleótidos. Están involucrados en la regulación de la expresión génica por alineación con el gen diana, lo que resulta en la escisión o represión de los genes diana a nivel postranscripcional [1]. Desempeñan importantes funciones reguladoras en muchos procesos biológicos, incluida la diferenciación, el metabolismo, el desarrollo y la señalización celular. Por lo tanto, la identificación de objetivos genéticos es importante para la caracterización funcional de los miARN y brinda nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos que podrían conducir a biomarcadores y predictores de la respuesta farmacológica a la enfermedad. Los procesos para la identificación y validación de objetivos de microARN en laboratorio en su mayoría requieren mucho tiempo y son costosos. Estas limitaciones han llevado al desarrollo de enfoques computacionales sofisticados de predicciones de objetivos de microARN que permiten reducir los objetivos potenciales para la validación experimental.

Ya se han desarrollado varios métodos computacionales para identificar genes diana. Algunos métodos se basan en la conservación de los sitios de unión (por ejemplo, TargetScan) [2], otros se basan en la accesibilidad del sitio y las propiedades termodinámicas para filtrar los sitios de unión de las semillas (por ejemplo, miRanda) [2]. Los algoritmos de predicción utilizan una combinación de diferentes características para aumentar su precisión y compensar las limitaciones de las características individuales. Sin embargo, todavía existe la necesidad de un enfoque computacional preciso con alta sensibilidad para superar el problema generado por el algoritmo tradicional. Los algoritmos basados ​​en aprendizaje automático se basan en la parametrización de datos biológicos y otras características predichas y están creciendo en una nueva era en genómica. Esta técnica es utilizada por muchos algoritmos de predicción que generan una interacción miARN-objetivo validada con mayor precisión (por ejemplo, TarpmiR, miRGen ++, MBSTAR) [3-5].

Basándonos en el algoritmo de precisión de la predicción y en el hecho de que la mayoría de las bases de datos de predicción no se actualizaron durante algunos años, hemos decidido lanzar una técnica basada en el aprendizaje de última generación con nuevas funciones y transferirla al repositorio miRWalk a otro servidor en un nuevo marco para aumentar la precisión y la sensibilidad, lo que permite un uso exhaustivo de otras aplicaciones en este estudio.


Metodos experimentales

Aislamiento y cuantificación de miARN

Para perfilar la expresión de miARN, se prepararon cuatro grupos de ARN total de hígado, cada uno de los cuales constaba de 10 tejidos diferentes de donantes de hígado. El origen de las muestras de hígado humano se describió anteriormente (Klein et al., 2010). En resumen, se recolectaron previamente tejidos hepáticos de pacientes sometidos a cirugía hepática en el Departamento de Cirugía General, Visceral y de Trasplante (A. K. Nuestrossler, P. Neuhaus, Campus Virchow, Centro Médico Universitario Charit & # x000e9, Universidad Humboldt de Berlín, Alemania).El estudio fue aprobado por los comités de ética de las facultades de medicina de la Charit & # x000e9, de la Universidad Humboldt y de la Universidad de Tubinga y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente. Todas las muestras de tejido habían sido examinadas por un patólogo y sólo se recogió y almacenó tejido hepático histológicamente normal a & # x0221280 & # x000b0C. El ARN total se extrajo usando el kit mirVANA de Ambion (Austin, TX, EE. UU.). La transcripción inversa del ARN total (1 & # x02009 & # x003bcg) se realizó utilizando el grupo de cebadores de RT de tallo-bucle A v 2.0 de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.) Siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La qPCR para la expresión de miARN se realizó con tarjetas micro fluídicas TaqMan & # x000ae Low Density Array A v 2.0 para humanos (Applied Biosystems) y se detectó con el sistema de RT-PCR en tiempo real ABI 7900HT Fast. La cuantificación relativa (RQ) se calculó por normalización al control endógeno MammU6 RQ & # x02009 = & # x020092exp (& # x02212 & # x00394Ct).


Discusión

En este estudio, examinamos el direccionamiento único y múltiple de miARN y sus efectos sobre la represión. Debido a los efectos de gran alcance de la represión de miARN, es probable que los miARN también estén involucrados en muchas enfermedades. En el caso de la orientación múltiple, mostramos que los genes del cáncer tienden a ser atacados por más miARN, lo que respalda la idea de que los miARN desempeñan un papel en el cáncer. En el caso de la orientación única, describimos a continuación una posible relación entre los miARN y DM1, utilizando observaciones sobre la represión de genes que contienen múltiples pares de sitios de unión superpuestos. Estos vínculos con enfermedades subrayan la importancia de estudiar los mecanismos detrás de la focalización de miARN, que discutimos a continuación.

Comprender la segmentación múltiple

La motivación fundamental para tener múltiples miARN dirigidos a un gen es que estos genes presuntamente importantes puedan regularse en una variedad de condiciones, como diferentes tipos de tejidos o programas transcripcionales. Si bien se sabe que algunos genes tienen sitios de reconocimiento para múltiples miARN diferentes, es incierto si múltiples miARN simplemente se complementan entre sí en diferentes condiciones o si actúan en conjunto para proporcionar una mayor represión génica. En un modelo simple, cada miARN sería independientemente responsable de regular los genes que necesitan ser reprimidos para una condición determinada (por ejemplo, un tipo de tejido específico). Para los genes que necesitan estar activos en una serie de condiciones específicas, se podría expresar un miARN diferente en cada condición en la que ese gen necesita ser regulado. Por lo tanto, los miARN actuarían independientemente unos de otros, de modo que en el caso de que se expresaran simultáneamente múltiples miARN, no habría necesariamente una mayor represión.

Un modelo más intrigante involucra a múltiples miARN que trabajan en conjunto para reprimir un gen. En este caso, dos miARN diferentes expresados ​​de forma independiente podrían reprimir cada uno un gen determinado. Sin embargo, si ambos miARN se expresan simultáneamente, ese gen se reprime mucho más fuertemente que la represión ejercida por cada miARN por sí solo. Esta regulación coordinada se logra en la regulación transcripcional cuando dos factores transcripcionales interactúan en un complejo transcripcional mientras se unen al promotor de un gen. Dado que los miARN son mucho más pequeños que los factores de transcripción y, por lo tanto, tienen poca interfaz de unión, es poco probable que los miARN puedan interactuar directamente. Es posible que los complejos de miARN (como parte de un complejo RISC) puedan interactuar en su lugar, pero las interfaces de unión a estos complejos tendrían que exhibir alguna característica única de ese miARN para diferenciar un complejo de otro. Otra posibilidad es que dos sitios de unión que responden a diferentes miARN pueden tener un potencial represivo diferente dependiendo de las distancias entre los dos sitios, similar a los resultados mostrados anteriormente para un solo miARN en múltiples sitios. Independientemente del mecanismo, el fino grado de regulación que permite la represión coordinada de miARN hace de este un modelo atractivo que merece mayor atención. Nuestra observación de que los genes dirigidos por más miARN tienden a reprimirse más que los genes dirigidos por menos miARN es consistente con el modelo combinatorio donde tanto el grado como la especificidad de la regulación de miARN pueden ser modulados por varias combinaciones de miARN relevantes.

MiARN de unión a repetición de CTG y vínculo con la distrofia miotónica

Nuestra observación de que la longitud de repetición de CTG se correlaciona con la represión de miARN nos llevó a suponer un posible papel de este fenómeno en la enfermedad, en particular en la DM1. Si un 3 'UTR ganara repeticiones de CTG, sería posible reprimir anormalmente esa transcripción, afectar la estequiometría de los miARN de unión de repetición de CTG libres a unidos o interrumpir de otro modo la función de miARN de unión de repetición de CTG. Nos centramos en DM1 porque CTG repite la expansión en DMPK se ha demostrado que es la causa de la enfermedad y porque el mecanismo detallado de la patogénesis de la DM1 sigue sin resolverse.

Por lo tanto, proponemos que la represión de miARN de repeticiones de CTG juega un papel en el mecanismo de DM1. En este modelo, los miARN de unión repetida de CTG, como mir-107 y mir-103, se unen preferentemente al mutado DMPK transcripción. Esto podría tener dos efectos de lixiviación de miARN: primero, la cantidad de miARN libre que normalmente estaría regulando otros genes se reduce y ya no podría reprimir otros genes diana o segundo, la fuerza de la represión debido a las repeticiones largas de CTG podría resultar en la secuestro de grandes cantidades de maquinaria de miARN y previene la represión normal de miARN en general. La participación de miARN podría tener consecuencias significativas sobre proteínas conocidas en la progresión de la enfermedad DM1. En la vista actual, la expansión de repetición CTG desencadena el secuestro de la DMPK transcripción en focos nucleares [48] junto con MBNL [49], implicando MBNL como actor clave en la patogenia de la DM. En lugar de la opinión predominante de que MBNL se une directamente al ARNm de DMPK, MBNL en cambio, podría responder al complejo con miARN que se unen al DMPK 3 'UTR.

Esta propuesta de relación entre MBNL y los miARN podrían explicar por qué la colocalización de MBNL con focos de ARN no necesariamente desencadena eventos descendentes de DM1 [50] y por qué MBNL1 aparentemente se une a otros tipos de repeticiones incluso mejor que las repeticiones de CTG [51] en ambos casos, la unión de miARN a repeticiones de CTG podría mediar esta interacción. Una posible complicación de esta teoría es que, si bien, tradicionalmente, la biogénesis de miARN asume que el miARN maduro está activo solo dentro del citoplasma, el miARN se une a DMPK las transcripciones requerirían que los miARN y su maquinaria existan dentro del núcleo. De hecho, pruebas recientes han demostrado que los miARN también son activos dentro del núcleo [52], facilitados por un mecanismo de importación nuclear [53].

Varias líneas de evidencia apoyan nuestra teoría de que los miARN podrían estar involucrados en DM1. Primero, como mostramos anteriormente, la represión de miARN aumentó a medida que aumentaba la longitud de las repeticiones de CTG, lo que sugiere una relación entre la longitud de la repetición de CTG y la represión de miARN. En segundo lugar, también mostramos que el tipo salvaje DMPK responde a la represión por los miARN de unión a repetición de CTG. Además, se ha demostrado que la alteración de la biogénesis de miARN mediante la eliminación de Dicer aumenta DMPK expresión [54], lo que sugiere que los miARN regulan DMPK. Finalmente, el modelo implica que los miARN de unión repetida de CTG deben expresarse en los tejidos que presentan síntomas de DM1. Utilizando datos de expresión de miARN de ratón publicados [55], encontramos que nuestros candidatos más fuertes, mir-107 y mir-103, se expresan con fuerza en el cerebro, el corazón y los músculos. Juntos, estos resultados apoyan el papel de los miARN en la patogénesis de DM1 y, en particular, destacan mir-107 y mir-103 como candidatos atractivos para unirse a DMPK.

Observaciones sobre la métrica de expresión relativa

La métrica de RE tal como se utiliza en este artículo es única en comparación con los esfuerzos anteriores para comprender el direccionamiento de miARN, ya que tanto los datos de expresión de miARN como de ARNm se han utilizado juntos para medir la represión de miARN. Esfuerzos anteriores que utilizan solo microarrays de expresión o en el lugar Los datos de hibridación midieron indirectamente la expresión diferencial de los objetivos de ARNm aprovechando el conocimiento sobre la expresión específica de tejido o etapa de los miARN. Por ejemplo, dado que mir-1 tiende a expresarse en el músculo esquelético, se espera que los objetivos de mir-1 se regulen a la baja en las muestras de músculo. Sin embargo, las características de expresión de miARN se pueden inferir solo para un número limitado de miARN para un tipo de muestra dado. En este enfoque, la expresión derivada experimentalmente de muchos miARN diferentes se conoce para múltiples muestras, lo que hace posible calcular la expresión diferencial de genes diana utilizando mediciones de los niveles reales de expresión de miARN. Utilizando este enfoque, realizamos una en silico Evaluación de todo el genoma de las características específicas del sitio de unión de la represión de miARN, incluido el número de sitios de unión, las distancias entre los sitios de unión, los pares de sitios que se superponen ampliamente y la longitud de la UTR 3 '. Si bien algunas de estas características morfológicas se han discutido previamente como factores vinculados o que contribuyen a la represión de miARN, generalmente se han estudiado en condiciones experimentales específicas y limitadas o en el contexto de predicciones de miARN diana sin tener en cuenta los datos de expresión.

Porque el Lu et al. El conjunto de datos [21] utilizado aquí comprende un conjunto heterogéneo de muestras extraídas de diferentes tipos de tejidos y el estado del cáncer, la expresión génica específica del tejido y del cáncer complica el análisis de la represión de miARN. Por esta razón, los genes de mantenimiento, que se expresan universalmente, sirvieron para reducir la variación en la expresión génica en diferentes tejidos debido a efectos no específicos de miARN. También es por esta razón que elegimos emplear la métrica RE y no una métrica de correlación. Debido a la complejidad de los datos, las anticorrelaciones esperadas que corresponden a la represión tienden a ser muy leves y, por lo tanto, difíciles de interpretar. Además, la métrica de RE se corresponde más estrechamente con el concepto de grado de represión, donde los valores de RE más pequeños corresponden a una regulación a la baja y, por lo tanto, a una mayor represión.

Si bien se han observado cambios más grandes en la inhibición de la traducción por los miARN en comparación con la represión de la transcripción, los cambios relativamente pequeños en los valores de RE que observamos, sin embargo, enfatizan la importancia de la represión de la transcripción mediada por miARN. Como mostramos, los valores de RE 5-10% más bajos para un conjunto de interacciones de genes están en línea con la represión promedio de genes diana en células transfectadas con miARN en Lim et al. [15]. Es importante destacar que ambos cálculos se basan en una gran cantidad de objetivos genéticos y, por lo tanto, están sujetos a diversas fuentes de ruido e incertidumbre. Estos incluyen la posibilidad de que algunos genes puedan ser reprimidos con más fuerza por un miARN que otros, que PicTar haya predicho erróneamente algunos objetivos genéticos o que algunos objetivos genéticos solo se expresen o respondan a un miARN en ciertos tejidos. A pesar de estas posibles fuentes de ruido, nuestra capacidad para detectar las tendencias observadas muestra que los resultados son aplicables en todo el genoma y enfatizan el papel de la represión de miARN a nivel transcripcional. Dado que parece que las mismas características de la secuencia (es decir, la distancia entre los sitios de unión) pueden influir en la represión tanto a nivel de traducción [29] como a nivel transcripcional (que se muestra aquí), esto sugiere que los mecanismos que impulsan la represión transcripcional y traduccional mediada por miARN puede estar vinculado.

Una observación inesperada fue la presencia de valores de RE superiores a 1,0 en varios análisis. Este efecto es posible si se considera dentro del contexto de la regulación génica total, donde múltiples factores compiten para regular hacia arriba y hacia abajo un gen. En este escenario, los factores de transcripción y los miARN que se expresan simultáneamente ejercen efectos opuestos sobre la regulación de los genes. Si, en general, un gen experimenta una mayor activación transcripcional que la represión de miARN, entonces este gen podría exhibir valores de RE superiores a 1.0 a pesar de la represión de miARN. Esta aparente regulación positiva en presencia de represión de miARN no debe considerarse sorprendente dada la creencia de que los miARN sirven para ajustar la regulación génica en bucles de retroalimentación, aumentando la precisión y robustez de la expresión génica [31, 56, 57].

Anticipamos que la métrica RE podrá revelar características adicionales de la represión de miARN cuando se aplique a conjuntos de datos más grandes que contengan datos más uniformes, como los que contienen los mismos tejidos o el mismo estado de cáncer. Algunos experimentos potenciales incluyen pruebas de efectos cooperativos de múltiples miARN que trabajan juntos para reprimir un gen, interacciones entre miARN y factores de transcripción cuando se dirigen a un gen y efectos específicos del sitio de unión, como la importancia de la región de la semilla o la tolerabilidad de G / U desajustes.


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Discusión

Para la mayoría de los loci asociados a rasgos identificados por GWAS, identificar la variante causal ha sido un gran desafío. A menudo, los SNP asociados se encuentran fuera de las regiones codificantes, lo que indica que participan en la modulación de la expresión génica espacio-temporal, en lugar de la estructura de la proteína. Trabajos anteriores han demostrado una sobrerrepresentación significativa de SNP asociados a rasgos en 3 'UTR, lo que destaca la importancia potencial de la regulación postranscripcional [14]. Aquí, proporcionamos un estudio sistemático de las variantes de UTR 3 'y examinamos su influencia potencial en los niveles de expresión de ARNm a través de la unión de miARN. Usamos el más grande y robusto cis-Conjunto de datos eQTL disponible, identificado a partir de la sangre periférica de 5.311 individuos de siete cohortes independientes [21]. A nuestro leal saber y entender, el presente estudio es el primero en investigar sistemáticamente el impacto de los polimorfismos de MRE en una escala de todo el genoma teniendo en cuenta la dirección de los cambios de expresión e incorporando el eQTL público, el perfil de expresión de miARN y AGO- CLIP datos en el análisis.

Aunque se estima que & gt10% de la longitud total de los 3 'UTRs está cubierto por en silico sitios objetivo predichos de miARN [18], no se ha determinado en qué medida la variación de la expresión génica está mediada por alteraciones en la unión de miARN. Los SNP ubicados en los MRE pueden influir en la expresión del ARNm postranscripcionalmente al interrumpir o crear sitios de unión de miARN funcionales, al cambiar la eficacia de los MRE o al reemplazar el sitio de unión de un miARN por el de otro.

Estudios anteriores han identificado una serie de SNP con el potencial de influir en la unión de miARN. Algunos de los resultados de estos estudios se resumen en bases de datos en línea [18,31,33,53,54], sin embargo, la sensibilidad y especificidad de en silico Los algoritmos de predicción de objetivos no son perfectos [55], y se necesita apoyo adicional para validar un sitio objetivo de miARN de modo que sea útil para identificar MRE-SNP funcionalmente relevantes.

Limitar los MRE-SNP putativos al subconjunto que se superpone con los sitios de unión de Argonaute [14] puede agregar confianza a en silico predicciones. Sin embargo, cabe señalar que existen diferencias significativas entre los conjuntos de datos AGO-CLIP individuales, posiblemente debido a la heterogeneidad entre los tipos de células estudiadas. Varios estudios también han utilizado los MRE-SNP de sitios objetivo con apoyo experimental [56,57] o la coexpresión del objetivo y el miARN correspondiente [56,58,59].

Hasta ahora, solo unos pocos estudios han investigado sistemáticamente el vínculo entre los eQTL y los MRE-SNP. Estudio histórico de Richardson et al. utilizaron el algoritmo miRanda para la identificación de MRE-SNP, aplicando la coexpresión de miARN-objetivo y la presencia de SNP en el catálogo GWAS como filtros adicionales [60]. De 39 asociaciones filtradas, identificaron 4 que mostraban una tendencia eQTL marginalmente significativa, lo que apoya la lógica de la regulación de miARN.

Gamazon et al. utilizaron líneas celulares linfoblastoides (LCL) de 60 individuos europeos (CEU) y 60 Yoruban (YRI) para analizar variantes genéticas, mRNA y datos de expresión de miRNA [61]. Identificaron una serie de MRE-SNP putativos mediante el uso de en silico algoritmos de predicción de diana, asumiendo una correlación negativa de miARN-diana y un efecto eQTL sobre la expresión de la diana. Informaron que entre el 18% y el 25% de los SNP transLos efectos de -eQTL sobre la expresión de miARN también tienen asociaciones con los niveles de ARNm, lo que indica la importancia de las variantes genéticas en las redes reguladoras de miARN.

En otro estudio, los autores integraron la información genómica y de expresión génica disponible de 149 muestras de LCL de HapMap 3 para identificar 2262 MRE-SNP putativos, de los cuales el 5,74% también tenían cis-efectos sobre sus genes diana [62].

En un estudio más centrado, Wei et al. [63] intersectado cis-eQTL previamente identificados de LCL, hígado y cerebro con en silico predijo MRE de un conjunto limitado de 409 genes asociados a xenobióticos e identificó 27 MRE-SNP putativos.

En el presente estudio, identificamos 5.992 MRE-SNP putativos, que redujimos a un conjunto priorizado de 217 MRE-SNP utilizando criterios más estrictos. En cualquier caso, no detectamos ninguna sobrerrepresentación significativa de MRE-SNP para los que el cisLa dirección de -eQTL y el efecto sobre la unión de miARN serían concordantes. Los tamaños del efecto no difirieron entre exclusivamente concordantes y exclusivamente no concordantes. cis-eQTLs y, de la misma forma, no observamos ninguna asociación significativa entre el efecto promedio de un MRE-SNP dado y el cis-Tamaño del efecto de eQTL.

La ambigüedad en nuestros resultados puede explicarse por varios factores. En primer lugar, la mayoría de las UTR 3 'contienen sitios de unión para varios miARN diferentes y, con bastante frecuencia, hay más de un sitio para un miARN específico. Esto significa que el efecto de interrumpir o crear un único sitio de unión puede reducirse por la acción de otros sitios. En segundo lugar, el efecto de un SNP 3 'UTR puede manifestarse a través de diferentes mecanismos, ya que tanto la unión de miRNA como la estabilidad del mRNA en general se ven afectados por varios factores diferentes. Estos mecanismos pueden incluir poliadenilación o empalme alternativo, alteraciones estructurales del ARNm o la accesibilidad al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Algunos de esos mecanismos se abordaron en un estudio reciente [14], lo que sugiere que la mayoría de los SNP de 3 'UTR influyen en los MRE en lugar de los sitios de empalme o el plegamiento de 3' UTR. En tercer lugar, los miARN y sus objetivos forman módulos reguladores complejos que contienen bucles de retroalimentación para minimizar los efectos de la variación genética y el ruido estocástico [64,65]. En cuarto lugar, los efectos mediados por miARN sobre la expresión de la diana son rápidos en el tiempo pero de magnitud moderada y, por lo tanto, pueden escapar a la detección. Además, el principal papel biológico de los miARN parece ser el de amortiguar la estocasticidad de la expresión génica [66]. Por lo tanto, la pérdida de un sitio de miARN puede no resultar en un cambio en el nivel de expresión, sino en un aumento en la variabilidad de expresión.

Aunque no pudimos detectar un enriquecimiento estadísticamente significativo de MRE-SNP con regulación de tipo concordante en nuestros análisis, descubrimos varios candidatos interesantes en los que puede tener lugar la regulación mediada por miARN. El SNP con uno de los efectos más llamativos en su sitio de unión de miARN predicho es rs10187, que interrumpe el MRE de miR-210-3p en el ISCU gene. Como el sitio está cubierto por lecturas de AGO-CLIP y la focalización está bien validada experimentalmente [44-46,67], tenemos razones para creer que esta actividad de miARN puede ser la causa subyacente de la observada cis-Efecto eQTL. Curiosamente, un significativo cis-El efecto eQTL está presente solo para una de cada dos sondas de Illumina que detectan ISCU, lo que demuestra una posible variabilidad técnica en conjuntos de datos de expresión. ISCU codifica una proteína con un papel funcional en el ensamblaje de grupos de hierro-azufre mitocondriales. Su nivel disminuido de ARNm se ha asociado con miopatía con intolerancia al ejercicio [68] y disminución de la supervivencia al cáncer [69]. Sin embargo, como el alelo menor de rs10187 se correlaciona con una mayor expresión de ISCU, no está claro un vínculo directo entre el MRE-SNP y estas condiciones. miR-210-3p es un miARN inducible por hipoxia (hypoxamir) controlado por factores inducibles por hipoxia (HIF, para una revisión ver [70]) y, entre otras funciones, regula a la baja el metabolismo mitocondrial en condiciones hipóxicas al dirigirse directamente ISCU [69].

Dos MRE-SNP potenciales: rs4245739 en MDM4 (creando un MRE para miR-191-5p) y rs2239680 en BIRC5 (que interrumpe el MRE para miR-335-5p) - se ha demostrado experimentalmente que afecta la unión de miARN en líneas celulares [47,50]. Curiosamente, solo rs4245739 tiene un tipo C cis-Efecto eQTL en sangre periférica. La falta de concordancia entre la tendencia alélica de rs2239680 y el efecto esperado sobre la regulación mediada por miARN puede explicarse por varios factores: el miR-191-5p es uno de los miARN más expresados ​​en sangre (detectable en nueve de 11 muestras de sangre ) y representa

1% del miRNome detectado, mientras que miR-335-5p es detectable en solo seis de las 11 muestras de sangre y representa aproximadamente el 0,01% del miRNome detectado (Fig. S2). Al mismo tiempo, miR-335-5p tiene un tamaño significativamente mayor en silico predijo el targetoma que miR-191-5p (3.046 genes diana frente a 568 genes diana, respectivamente TargetScan v6.2), lo que sugiere que el efecto de miR-335-5p en cualquier MRE individual puede diluirse en este tejido.

Nuestro estudio también tiene varias limitaciones. El análisis principal se limitó a un solo tipo de tejido: sangre periférica. Dado que se sabe que los miARN desempeñan un papel en el desarrollo y, a menudo, desempeñan un papel muy específico en un tejido en particular, es probable que estudios similares centrados en otros tipos de tejidos revelen información adicional sobre el papel de la variación genética en las ERM. Investigamos la heterogeneidad de cis-eQTLs utilizando los datos independientes del proyecto GTEx. Aunque los tamaños de muestra y el poder de replicación resultante son actualmente mucho más pequeños que en el metanálisis de sangre, demostramos que varios MRE-SNP exclusivamente de tipo C también tienen valores nominalmente significativos cis-Efecto eQTL en otros tejidos distintos de la sangre. Desafortunadamente, rs10187 no estaba disponible en conjuntos de datos GTEx pero concordante cis-Efecto eQTL entre rs4245739 y MDM4 también estaba presente en varios otros tejidos además de la sangre, lo que sugiere la acción generalizada de este mecanismo mediado por miARN en múltiples tipos de tejidos (Fig. S9).

Los niveles de expresión de miARN también varían entre individuos, y es probable que sean útiles más análisis que comparen SNP, expresión génica y datos de expresión de miARN recolectados de los mismos individuos. Además, nuestro análisis se basa en gran medida en motivos objetivo de miARN predichos computacionalmente.

Para superar algunas de las limitaciones, aplicamos varios filtros a nuestro conjunto de datos. Para minimizar el efecto de la especificidad tisular de la expresión de miRNA, definimos un miRNome expresado en sangre utilizando datos disponibles públicamente. Debido a las limitaciones de en silico algoritmos de predicción de objetivos, también utilizamos la intersección de las predicciones de objetivos de miARN de tres bases de datos y el conjunto de miARN maduros de “alta confianza” de miRBase. Aunque integramos la información de objetivos validados experimentalmente en nuestros análisis, debe tenerse en cuenta que un MRE confirmado experimentalmente no proporciona necesariamente una prueba sólida de la consecuencia funcional de un MRE-SNP en la unión de miARN y su efecto posterior en los niveles de ARNm y proteínas. Independientemente de estas limitaciones, nuestro análisis identificó cuatro MRE-SNP de tipo concordante asociados a rasgos como prueba de concepto, para los cuales tres variantes estaban relacionadas con el cáncer.

Uno de los SNP más interesantes de los resultados de nuestro análisis filtrado es el mencionado rs4245739 (A / C), que crea un MRE funcionalmente verificado para miR-191-5p en MDM4 (Figura 3D y 3F, Figura 4A). los MDM4La proteína codificada inhibe p53 postraduccionalmente y se regula al alza en tumores [71,72], mientras que el alelo menor de rs4245739, transportado por aproximadamente el 20% de la población general, se asocia con un efecto protector para varios cánceres [47,73– 75] y puede servir como un biomarcador potencial. Más importante aún, el efecto de rs4245739 sobre la unión de miR-191-5p y la subsecuente regulación a la baja de MDM4 La expresión de ARNm y proteínas se ha verificado experimentalmente en líneas celulares de cáncer de ovario [47], lo que sirve como ejemplo de un MRE-SNP funcional identificado independientemente de nuestro enfoque sistemático de todo el genoma.

El segundo gen que contiene tanto un GWAS hit como un MRE-SNP en este estudio es N4BP1. rs6500395, que se encuentra en el primer intrón de N4BP1, se ha asociado con la respuesta de los pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con tocilizumab [76], pero este gen también contiene un proxy MRE-SNP de tipo C (rs1224) apoyado por AGO-CLIP para miR-330-3p en su 3 'UTR (Figura 4C).

En dos casos, los sustitutos absolutos de cis-eQTLs se localizaron en el 3 'UTR MRE del gen cercano. rs3771570, que se asocia con cáncer de próstata agresivo [74], se encuentra en la región intrónica de FARP2 gene. Sin embargo, tiene un proxy perfecto (rs1056801) dentro del 3 'UTR de un gen al lado, SEPT2. El alelo menor de rs1056801 interrumpe la unión de los miembros de la familia de miR-17-92 asociados al cáncer (Tabla 2, [46]), y la expresión aberrante de SEPT2 se ha informado en diferentes tipos de tumores [77]. Como SEPT2 es también el único gen influenciado por una significativa cis-eQTL en un bloque de LD correspondiente (FDR = 0.04, Z = 3.9 [21]), proponemos que las alteraciones mediadas por MRE-SNP en la unión de los miRNA de la familia miR-17-92 pueden estar relacionadas con la expresión anormal de SEPT2 y podría ser un SNP causal en el locus GWAS identificado por rs3771570.

En la región de susceptibilidad al carcinoma de células escamosas de esófago marcada por rs2239815 [78], identificamos un MRE-SNP dentro del 3 'UTR de CCDC117. Este bloque LD contiene dos genes candidatos aparentes para la susceptibilidad al cáncer (XBP1 y CHEK2) (Figura 4D). Aunque estos tres genes se ven afectados por cis-eQTLs, el mayor efecto de este bloque LD está asociado con el XBP1 gen (FDR & lt 0.01, Z = 23 [21]), arrojando dudas sobre la mediación de miARN cis-Mecanismo eQTL.

En resumen, llevamos a cabo una encuesta sistemática y completa para identificar cis-Efectos de eQTLs. Al integrar datos de diferentes fuentes, identificamos una serie de MRE-SNP potencialmente funcionales, que sirven como variantes causales putativas para la expresión génica específica de alelos y para el desarrollo de rasgos complejos.


Resultados

Eliminación de miARN por CRISPR / cas9

Nuestro objetivo es determinar si CRISPR / cas9 dirigidos a loci de ADN genómico de miARN pueden reprimir de manera robusta la expresión de miARN. Como resultado, construimos vectores CRISPR / cas9 que contienen los sgRNA individuales con secuencias complementarias a los genes miR-17, miR-200c y miR-141, respectivamente (Fig. 1a). Se diseñaron dos sgRNA para cada miRNA utilizando CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu/), un programa en línea que fue desarrollado y mantenido por el laboratorio del Dr. Feng Zhang en el MIT. Esta herramienta puede recomendar secuencias de sgRNA para cada fragmento de ADN de entrada y analizar los posibles sitios fuera del objetivo de sgRNA individuales mediante explosión bioinformática con las secuencias de ADN del genoma completo 9. En nuestro estudio, dos sgRNA dirigidos al mismo miRNA se diseñaron en consecuencia (Fig. 1b-d). Dada la importancia de los sitios de procesamiento de Drosha y Dicer en el proceso de biogénesis de miARN 14, activamos los PAM (NGG) dentro / adyacentes a estos sitios. Las construcciones individuales de CRISPR / cas9 se transfectaron transitoriamente a células HCT116 y las células con CRISPR / cas9 se seleccionaron mediante tratamiento con puromicina y se expandieron en consecuencia. Como se muestra en la Fig.1e, los niveles de expresión de miR-17, miR-200c y miR-141 maduros disminuyeron hasta un 96% en las células transfectadas con las construcciones CRISPR / cas9 designadas en comparación con los vectores de control, lo que respalda la alta eficiencia del sistema CRISPR / cas9 en la regulación a la baja de la expresión de miARN maduro.

(a) Diagrama esquemático del sistema CRISPR / cas9. (b – d) Diseño de sgRNA para miR-17, miR-200c y miR-141. Se diseñan dos sgRNA para cada miRNA utilizando CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu/). (mi) CRISPR / cas9 con sgRNA designados pueden inhibir significativamente la expresión de miR-17, miR-200c y miR-141, respectivamente (n = 3). * P & lt 0,05. RQ: cuantificación relativa. (F) sgRNA -miR-17 puede regular al alza la expresión de la diana validada de miR-17, E2F1. (g, h) sgRNA -miR-200c y sgRNA -miR-141 pueden regular al alza la expresión de la diana validada de miR-200c y miR-141, ZEB1, que a su vez reprime la expresión de E-cadherina. Ctrl son los vectores CRISPR / cas9 con secuencias de sgRNA dirigidas a GFP. Todas las transferencias se realizaron en las mismas condiciones experimentales y se presentaron mediante imágenes recortadas. Consulte el complementario para ver las manchas completas.

La firma clave de miARN es el papel principal en la represión de la expresión de múltiples genes en los niveles de postranscripción y / o traducción. De ese modo, ampliamos nuestra observación a la expresión de objetivos seleccionados de estos miARN. Como se muestra en la Fig.1f, E2F1, uno de los objetivos validados de miR-17 3, parece ser inducido en células HCT116 transfectadas con CRISPR / cas9 contra miR-17 que derriba miR-200c y miR-141 por CRISPR / cas9 puede regulan positivamente la expresión de su co-objetivo, ZEB1, que a su vez mejora la represión de E-cadherina (Fig. 1gh). La interacción entre ZEB1 y E-cadherina se ha estudiado exclusivamente en EMT de células cancerosas humanas 15. Como se esperaba, la eliminación de miR-200c o miR-141 por CRISPR / cas9 en células HCT116 también puede facilitar la invasión celular (Figura 2 complementaria S2). Por lo tanto, estos resultados apoyan que el sistema CRISPR / cas9 puede usarse para estudios de pérdida de función de miARN.

Los indeles generados por CRISPR / cas9 en los sitios de procesamiento de miARN impiden su biogénesis

Como se mencionó anteriormente, el sistema CRISPR / cas9 puede editar secuencias de ADN del genoma que dan como resultado indeles, que pueden ser reconocidos por el ensayo T7EN1 de una manera eficiente 16. Después de transfectar vectores CRISPR / cas9 con secuencias de sgRNA individuales dirigidas a miR-17, miR-200c y miR-141 a células HCT116, detectamos las escisiones en los loci diana de estos miRNA mediante el ensayo T7EN1. Como se muestra en la Fig. 2a, se detectaron las múltiples bandas específicas del sitio, lo que demostró la existencia de indeles. Estos resultados se confirmaron adicionalmente mediante secuenciación de ADN en la que se identificaron los tamaños aleatorios de indeles adyacentes a la secuencia de PAM (Fig. 2b).

(a) La escisión del ADN por CRISPR / cas9 se detecta mediante el ensayo T7EN1. (B) La secuenciación del ADN confirma las deleciones (rojo) y las inserciones (azul) generadas por CRISPR / cas9 en genes de miARN seleccionados. Las secuencias PAM están resaltadas en verde. Todos los geles se ejecutaron en las mismas condiciones experimentales y se presentaron mediante imágenes recortadas. Consulte el complemento para ver las imágenes de gel completas.

Pri-miRNA es la transcripción directa del gen miRNA y luego procesada por Drosha y Dicer para formar miRNA maduro corto. Los estudios demostraron que tanto la estructura flanqueante como la interna del pri-miRNA pueden decidir la eficiencia del procesamiento de Drosha y, a su vez, la biogénesis del miRNA 17. Como se muestra arriba, nuestros resultados han demostrado que CRISPR / cas9 escinde los sitios de procesamiento de miARN Drosha y Dicer que conducen a tamaños aleatorios de indeles en secuencias de ADN genómico. Luego, examinamos la expresión primaria de miARN. MiR-17 es uno de los seis miembros del grupo miR-17-92, y su miARN primario es la transcripción del gen que contiene las 6 secuencias de miARN. Asimismo, miR-200c y miR-141 también comparten un mismo miARN primario transcrito del grupo miR-200c / 141. Como se muestra en la Fig.3a, los grupos pri-miR-17-92 y pri-miR-200c / 141 fueron regulados positivamente, lo que implica que la escisión de los sitios de procesamiento de miARN Drosha y / o Dicer por CRISPR / cas9 podría interrumpir la biogénesis del miARN maduro resultante en la acumulación de pri-miRNAs. Para determinar aún más los efectos de estos indeles en la biogénesis de miARN maduro, clonamos las secuencias de miR-17 de tipo salvaje, así como las secuencias de miR-17 mutadas con indeles seleccionados en vectores pWPXL, y luego los transfectamos en células HCT116 para expresión exógena. de miR-17 en diferentes clones individuales. Como se muestra en la Fig. 3bc, el miR-17 maduro estaba significativamente elevado en las células transfectadas con secuencias de miR-17 de tipo salvaje, pero no en las células transfectadas con los clones individuales que contienen secuencias de miR-17 mutadas. Además, no solo los clones individuales con grandes fragmentos de deleción (6-18 pb) pueden provocar el fracaso de la biogénesis de miR-17 maduro, sino que también el clon con solo 2 deleciones y 1 inserción puede impedir la expresión exógena de miR-17 como bien. Estos datos apoyan firmemente que las mutaciones generadas por CRISPR / cas9 en la estructura de tallo-bucle del miARN primario pueden resultar en la regulación a la baja del miARN maduro al interrumpir el proceso de biogénesis.

(a) CRISPR / cas9 induce la acumulación de grupos primarios de miR-17-92 y miR-200c / 141 (n = 3). (B) Expresión exógena de miR-17 en células HCT116 después de transfectadas con secuencias de miR-17 de tipo salvaje y secuencias mutadas, respectivamente (n = 3). (C) La secuenciación del ADN confirma las deleciones (rojo) y las inserciones (azul) en los clones individuales con secuencias de miR-17 mutadas. * P & lt 0,05. RQ: cuantificación relativa.

Efecto fuera del objetivo de CRISPR / cas9 en la edición de miARN

El efecto fuera del objetivo es el sello distintivo de todas las metodologías de silencio genético, incluido el sistema CRISPR / cas9. Mediante el uso de CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu/), predecimos los objetivos fuera de objetivo de sgRNA-miR-17-1 y sgRNA-miR-200c-1 (Tabla 1), y examinamos su objetivo efectos en consecuencia. Como se muestra en la Fig.4a, si el sgRNA objetivo tiene más de 3 desajustes con las secuencias de ADN inespecíficas, no hay divisiones que puedan detectarse mediante el ensayo T7EN1; sin embargo, si los desajustes son iguales o menores que dos, CRISPR / El sistema cas9 puede escindir de manera imparcial las secuencias fuera del objetivo. Los resultados de T7EN1 también se confirmaron mediante secuenciación de ADN (Fig. 4b). Estos resultados no solo respaldan la alta especificidad del sistema CRISPR / cas9, sino que también proporcionan una referencia para guiar el diseño de secuencias de sgRNA para reducir los efectos fuera del objetivo.

(a) CRISPR / cas9 no puede escindir las secuencias fuera del objetivo con & gt = 3 desajustes con sgRNA-miR-17-1 y sgRNA-miR-200c-1 mediante el ensayo T7EN1. "Activado" significa secuencias dentro del objetivo, mientras que "desactivado" significa secuencias fuera del objetivo. (B) La secuenciación del ADN confirma las deleciones (rojo) y las inserciones (azul) generadas por CRISPR / cas9 en las secuencias fuera del objetivo que contienen & lt = 2 desajustes con sgRNA-miR-17-1 y sgRNA-miR-200c-1. (C) Efectos de cruce fuera del objetivo entre sgRNA-200c y sgRNA-141 según lo determinado por qRT-PCR (n = 3). (d) El ensayo T7EN1 confirma la integridad del ADN de miR-200c sometido a sgRNA-miR-141 y la del miR-141 sometido a sgRNA-miR-200c. (mi) La cotransfección de sgRNA-ZEB1 con sgRNA-miR-200c o sgRNA-miR-141 puede reducir significativamente los efectos de cruce fuera del objetivo en miR-141 o miR-200c, respectivamente (n = 3). * P & lt 0,05. RQ: cuantificación relativa. Todos los geles se ejecutaron en las mismas condiciones experimentales y se presentaron mediante imágenes recortadas. Consulte el complemento para ver las imágenes de gel completas.

Se sabía que las estrategias tradicionales de silencio de miARN, como los inhibidores antisentido y la esponja, son menos robustas cuando se utilizan para inhibir la expresión de miARN de la misma familia, dadas sus secuencias altamente conservadas con algunos desajustes. Por ejemplo, miR-200c y miR-141 se transcriben a partir del mismo locus genómico y solo tienen 4 desajustes en sus secuencias maduras. Según los resultados mostrados anteriormente, el CRISPR / cas9 dirigido a miR-200c no debería influir en la expresión de miR-141 porque los desajustes son más de 3. Sin embargo, como se muestra en la Fig. 4c, ambos ARNsg-miR-200c generaron expresión cruzada inhibición de miR-141, viceversa. Para abordar este resultado inesperado, primero examinamos la integridad del ADN de los genes miR-200c y miR-141 en células transfectadas con sgRNA-miR-141 y sgRNA-miR-200c utilizando el ensayo T7EN1, pero solo se identificaron bandas únicas (Fig. 4d). ), lo que sugiere que CRISPR / cas9 no indujo escisión y que la regulación a la baja de miR-200c y miR-141 podría no ser causada por efectos fuera del objetivo. Dado el bucle regulador entre miR-200c / 141 y ZEB1, planteamos la hipótesis de que la regulación transcripcional de ZEB1 puede estar implicada en estos fenotipos inesperados "fuera del objetivo". Significa que cuando miR-200c es regulado negativamente por CRISPR / cas9, ZEB1 será regulado positivamente inversamente, lo que a su vez puede reprimir la expresión de miR-141 a nivel transcripcional. Asimismo, sgRNA-miR-141 también puede regular negativamente miR-200c mediante la alternancia de ZEB1. Para probar nuestra hipótesis, cotransfectamos construcciones CRISPR / cas9 dirigidas a ZEB1 y miR-200c o miR-141 en células HCT116, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 4e, cuando ZEB1 fue silenciado por CRSPR / cas9, los fenotipos inhibidores cruzados entre miR-200c y miR-141 fueron casi descartados.

También ampliamos nuestra observación al miR-200b maduro que solo tiene 2 nucleótidos diferentes del miR-200c maduro. Primero, volamos las secuencias de sgRNA-miR-200c a la secuencia madura de miR-200b, y encontramos que sgRNA-miR-200c-1 tenía 2 desajustes con miR-200b pero sgRNA-miR-200c-2 no se alineaba con miR-200b en absoluto. Luego, realizamos el ensayo T7EN1 y encontramos que sgRNA-miR-200c-1 puede editar el locus de ADN genómico de miR-200b pero no sgRNA-miR-200c-2 (Fig. 5a). Estos resultados sugieren que los efectos de cruce fuera del objetivo para los miRNA de la misma familia o con secuencias altamente conservadas pueden minimizarse mediante el diseño adecuado de sgRNA, que es muy flexible y factible porque el diseño de sgRNA se puede anclar a PAM dispersivos que se pueden anclar fácilmente. identificado en secuencias de ADN.

(a) MiR-200b y miR-200c tienen solo 2 nucleótidos diferentes en sus secuencias maduras, y el ensayo T7EN1 muestra que sgRNA-miR-200c-1 (con 2 desajustes) puede escindir secuencias de ADN de miR-200b, pero no sgRNA-miR-200c- 2 (sin desajustes). Hicimos mutaciones puntuales al azar (1-4 pb) dentro de la secuencia de sgRNA-miR-200c-1 y examinamos sus efectos de focalización en miR-200c (B) y posibles efectos fuera del objetivo en miR-200b (C) utilizando el ensayo T7EN1. No hay escisiones si las mutaciones (MU) son más de 3 pb. Los dígitos de la figura se pueden interpretar con un ejemplo: 3 [1, 9, 20] significa que hay 3 mutaciones que se localizan en el primer, noveno y vigésimo locus de sgRNA-miR-200c-1. Todos los geles se ejecutaron en las mismas condiciones experimentales y se presentaron mediante imágenes recortadas. Consulte el complemento para ver las imágenes de gel completas.

Para respaldar aún más nuestra suposición, hicimos mutaciones puntuales al azar (1-4 pb) dentro de la secuencia de sgRNA-miR-200c-1 (Tabla 2), y examinamos sus efectos de focalización en miR-200c y el posible efecto fuera del objetivo en miR-200b mediante el ensayo T7EN1 (Fig. 5bc). Los resultados sugieren que, si el número de desajustes es más de dos, las formas mutadas de sgRNA-miR-200c-1 no muestran efectos de focalización en miR-200c, ni efectos fuera de objetivo en miR-200b, lo que sugiere que la alta especificidad y bajo efecto fuera del objetivo de CRISPR / cas9 en la eliminación de miARN. Los resultados de T7EN1 también se confirmaron mediante secuenciación de ADN (datos no mostrados).

Estabilidad de fenotipos de caída de miARN por CRISPR / cas9

Se informó que CRISPR / cas9 podría resultar en una escisión permanente en la secuencia de ADN. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay datos publicados que muestren si CRISPR / cas9 puede establecer fenotipos estables de eliminación de genes a largo plazo en ambos in vitro y en vivo modelos después de la transfección de CRISPR / cas9. Por lo tanto, transfectamos transitoriamente CRISPR / cas9 contra miR-17 y los vectores de control a células HT-29 y HCT116, respectivamente, y recolectamos células los días 10, 20 y 30 después de la transfección. Como se muestra en la Fig. 6a, miR-17 está continuamente regulado a la baja en las células con CRISPR / cas9 dirigido a miR-17, aunque la cantidad de vectores vehículo se descarta gradualmente durante el transcurso de hasta 30 días. Para confirmar los hallazgos de nuestro in vitro En los estudios, inyectamos células HT-29 con el fenotipo de caída de miR-17 mediante CRISPR / cas9 a ratones desnudos por vía subcutánea. Recolectamos tumores de xenoinjerto el día 14 y el día 28 para su análisis, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 6b, se validó la regulación negativa estable de miR-17 en estos tejidos de xenoinjerto con pérdida gradual de los vectores vehículo. Además, comprobamos la escisión del ADN de miR-17 en los tejidos del xenoinjerto y encontramos fenotipos estables en las muestras recogidas en el día 14 y el día 28 (Fig. 6c). Estos resultados apoyan que CRISPR / cas9 puede generar fenotipos de caída de miARN estables en ambos in vitro y en vivo modelos.

(a) El fenotipo de desactivación de MiR-17 se puede mantener hasta 30 días en células HT-29 y HCT116 con transfección de tránsito de construcciones CRISPR / cas9, aunque los vectores vehículo se están perdiendo gradualmente (n = 3). (B) Los tejidos de xenoinjerto generados mediante la inyección subcutánea de células HT-29 con construcciones CRISPR / cas9 dirigidas a miR-17 en ratones muestran un fenotipo de caída estable frente a vectores vehículo perdidos gradualmente hasta 28 días (n = 3). (C) El ensayo T7EN1 confirma la escisión permeable de CRISPR / cas9 en secuencias de ADN de miR-17 en tejidos de xenoinjerto recogidos en el día 14 y el día 28. RQ: cuantificación relativa. Todos los geles se ejecutaron en las mismas condiciones experimentales y se presentaron mediante imágenes recortadas. Consulte el complemento para ver las imágenes de gel completas.


PubMed miRWalk2.0 es una versión mejorada de la base de datos anterior (es decir, miRWalk). miRWalk2.0 es hasta ahora el único archivo completo y de libre acceso, que proporciona la mayor colección disponible de interacciones objetivo de miARN predichas y verificadas experimentalmente con varias características novedosas y únicas (faltantes en una versión anterior, es decir, miRWalk) para ayudar en gran medida a la comunidad de investigación de miARN .

miRWalk2.0 no solo documenta los sitios de unión de miARN dentro de la secuencia completa de un gen, sino que también combina esta información con una comparación de los sitios de unión resultantes de 12 programas de predicción de miARN-objetivo existentes (DIANA-microTv4.0, DIANA-microT-CDS, miRanda-rel2010, mirBridge, miRDB4.0, miRmap, miRNAMap, doRiNA ie, PicTar2, PITA, RNA22v2, RNAhybrid2.1 y Targetscan6.2) para construir nuevas plataformas comparativas de sitios de unión para el promotor (4 conjuntos de datos de predicción), cds ( 5 conjuntos de datos de predicción), regiones 5'- (5 conjuntos de datos de predicción) y 3'-UTR (13 conjuntos de datos de predicción). También documenta la información de interacción miARN-objetivo verificada experimentalmente recopilada a través de una búsqueda automatizada de minería de texto y los datos de los recursos existentes (miRTarBase, PhenomiR, miR2Disease y HMDD) ofrecen dicha información.

Las novedades de miRWalk2.0 son las siguientes:

La interfaz web de miRWalk2.0 se clasifica ampliamente en los módulos Predicted Target (PTM) y Validated Target (VTM). Estos dos módulos se clasifican además en diferentes páginas de búsqueda, lo que permite a los usuarios obtener información asociada a miARN utilizando diferentes identificadores.

El módulo de destino predicho aloja información de interacciones miARN-objetivo dentro de la secuencia completa de todos los genes conocidos de humanos, ratones y ratas, incluidas todas las transcripciones y genomas mitocondriales. También proporciona nuevas plataformas comparativas de sitios de unión de miARN que resultan de 13 conjuntos de datos para promotores, cds, 5'- y 3'-UTR, genes mitocondriales e interacciones miARN-miARN. miRBase release 20 se utiliza para generar información de interacción miARN-objetivo para este módulo.

El módulo de destino validado aloja información de interacción de miARN verificada experimentalmente asociada con genes, vías, órganos, enfermedades, líneas celulares, trastornos OMIM y literatura sobre miARN. Este módulo se actualizó por última vez el 29 de septiembre de 2014. Además, proporciona información sobre proteínas que se sabe que participan en el procesamiento de miARN.


Los tRF y los argonautas: silenciamiento génico desde la antigüedad

En la mitología griega, los argonautas son una banda de héroes que acompañan a Jason en su búsqueda para encontrar el Vellocino de Oro, una prenda cuyos orígenes probablemente se encuentran en el uso de vellones de oveja como tamices para recolectar copos de oro del agua corriente.

En un nuevo artículo publicado en Biología BMC, Anindya Dutta y colegas míos Argonaute (sic) conjuntos de datos para el oro oculto propio de la biología: fragmentos de moléculas de ARNt previamente desatendidos, conocidos como tRF.

Aquí están siete cosas asombrosas necesita saber acerca de los tRF:

1) Las moléculas de ARNt son degradadas rutinariamente por la célula en mitades de ARNt y fragmentos más pequeños (tRF), que se puede crear a partir de los extremos 5 & # 039 y 3 & # 039 de cada ARNt. Algunos estudios han argumentado que estos productos de degradación no son simplemente desechos, sino que tienen sus propias funciones biológicas.

2) Las proteínas argonauta se unen a moléculas de microARN (miARN) como parte de un proceso de silenciamiento de genes. Estas interacciones se estudian utilizando técnicas como CLIP y CLASH.

Anindya Dutta y colegas tienen notó que oculto en los conjuntos de datos CLIP y CLASH hay mucha evidencia de que los tRF también se unen a Argonautes & # 8211 un hecho que a menudo se ha pasado por alto debido a un enfoque en los miARN.

3) Los miARN y los tRF comparten muchas similitudes. Ambos son ARN pequeños. Al igual que con los miARN, los tRF (cuando se unen a Argonautes) parecen regularse a la baja, o & # 039silencio', ARNm que contiene secuencias complementarias.

Forman complejos similares con Argonautes y ARNm diana, incluso usando las mismas reglas de & # 039seed & # 039 para seleccionar sitios de unión diana. Y están presentes en la célula en una abundancia similar entre sí.

Dado que las similitudes entre los miARN y los tRF son tan sorprendentes, quizás no sea sorprendente que en al menos un caso un miARN informado en la literatura haya resultado ser un tRF.

4) Pero Los tRF no son lo mismo que los miARN. Como diferencia obvia, los tRF se crean a partir de tRNA transcritos con pol III, mientras que los miRNA son productos de moléculas pre-miRNA transcritas con pol II. La producción de miARN requiere las enzimas DROSHA y DICER1, pero La generación tRF es independiente de DROSHA y DICER1.

5) Otra diferencia entre los tRF y los miARN es la identidad de las proteínas Argonaute a las que se unen. En su mayor parte, los miARN forman complejos con Argonaute 2 pero no con Argonaute 1, 3 o 4. Para los tRF, la preferencia Argonaute se invierte, siendo los Argonautes 1, 3 y 4 los preferidos, y Argonaute 2 rechazado.

6) Quizás la diferencia más curiosa de todas es que, a diferencia de los miARN específicos de plantas y metazoos, Los tRF son omnipresentes.

Puedes encontrarlos en todas partes desde bacterias, para gente, para plancton (a BMC Genomics papel recientemente manchado tRFs en la diatomea Phaeodactylum tricornutum), para plantas (como se muestra en este Biología Directa papel).

Los tRF ofrecen una explicación de por qué las bacterias tienen proteínas Argonaute a pesar de no poseer una vía de miARN. Jason and the Argonauts es una leyenda de gran antigüedad, y podemos inferir de su ubicuidad que los tRFs también son muy antiguos & # 8211 muy probablemente un mecanismo ancestral de silenciamiento de genes presente en el último ancestro común universal.

7) Dutta y sus colegas han construido un base de datos (¿tal vez usaron JSON?) de tRF que interactúan con argonauta, que esperan lanzará a otros biólogos curiosos en sus propias odiseas de descubrimiento.

Pero, espera, ¡hay más!

La tendencia de los ARNt a descomponerse no se detiene con los ARNt. Como se indicó anteriormente, pueden degradarse en piezas más grandes, conocidas como mitades de tRNA, que también se ha demostrado que desempeñan un papel regulador en la expresión génica.

Mientras que los tRF pequeños se dirigen a los ARNm para silenciarlos a través de interacciones con Argonautes, las mitades de tRNA utilizan un mecanismo completamente diferente. Aprovechando su capacidad para imitar ARNt de longitud completa, las mitades buscan sitios de unión de ARNt en los ribosomas. La ocupación de estos sitios puede detener la traducción del ARNm y, por lo tanto, regular a la baja la expresión de proteínas.

Incluso antes de que se transcriban en ARN, los ARNt pueden desintegrarse. Es decir, Los genes de ARNt a veces se dividen. Varios organismos, en su mayoría, pero no exclusivamente, especies de arqueas, han dividido algunos de los genes de ARNt en sus genomas en dos. En otros casos, no se dividen, sino que se permutan.

Entre los tRF, las mitades de tRNA y los genes de tRNA fragmentados, parece que a los tRNA simplemente no les gusta estar completos.

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[& # 8230] En la mitología griega, los argonautas son una banda de héroes que acompañan a Jason en su búsqueda para encontrar el Vellocino de Oro, una prenda cuyos orígenes probablemente se encuentran en el uso de vellones de oveja como tamices para recolectar copos de oro del agua corriente. [& # 8230]

[& # 8230] En los años transcurridos desde que se publicó el primer borrador del genoma humano, nuestra comprensión de la increíble complejidad que se encuentra más allá de las regiones codificantes de proteínas ha aumentado considerablemente. De particular interés es la creciente familia de ARN no codificantes. En un estudio reciente en BMC Biology, Anindya Dutta de la Facultad de Medicina de la Universidad de Virginia, EE. UU., Y sus colegas investigan uno de los miembros más nuevos de esta familia, los fragmentos de ARN derivados de tRNA (tRF). Todavía hay mucho debate sobre su biogénesis y función, lo que llevó a Dutta y sus colegas a realizar un metanálisis de datos disponibles públicamente sobre tRF. A través de su análisis, se reveló que estos fragmentos están más conservados evolutivamente que sus contemporáneos más conocidos, los microARN, y además se descubrió que, al igual que los microARN, son capaces de unirse a proteínas Argonaute para formar complejos que están involucrados en el silenciamiento de genes. Aquí Dutta explica algunos de sus resultados más sorprendentes, especula sobre la función de los tRF y analiza lo que sigue en la historia de tRF. Puede encontrar más información sobre lo que hace que los tRF sean una clase tan intrigante de ARN no codificantes en este blog de BioMed Central. [& # 8230]

[& # 8230] tRFs y Argonautes: silenciamiento de genes desde la antigüedad & # 8211 BioMed Central blog. [& # 8230]


Ver el vídeo: Micro ARN (Enero 2022).