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16: Tinción simple - Biología


Objetivos

  • Prepare un frotis de una muestra bacteriana.
  • Prepara una simple mancha del frotis.
  • Utilice el microscopio para identificar características (forma, disposición, tamaño) de la bacteria.

Para teñir la muestra bacteriana para microscopía, primero se debe preparar el frotis en el portaobjetos. Básicamente, esto implica tres pasos: transferir una suspensión líquida de la bacteria en el portaobjetos, secar el frotis y luego calentar ligeramente para unir firmemente el frotis al portaobjetos. Una vez hecho esto, comienza el procedimiento de tinción.

Nota

NO espese demasiado las suspensiones de frotis. El tinte no penetrará bien y habrá demasiadas células bacterianas para ver formas y arreglos individuales. Hay que tener cuidado con los frotis gruesos al tomar la muestra de un medio de agar.

RECOMENDACIÓN: Puede resultarle útil dibujar un círculo (el lápiz de cera es mejor) en el lado opuesto del portaobjetos donde extenderá el frotis. Esto le ayudará más adelante a localizar el frotis, lo que a veces es un problema al mover el portaobjetos de un lado a otro en busca de las bacterias. El lápiz de cera es mejor que un marcador porque no se quita fácilmente del vidrio.

MATERIALES NECESITADOS

  • NB cultura de Staphylococcus epidermidis
  • Placa NA de E. coli
  • tina de tinte
  • reactivos colorantes
  • portaobjetos de microscopio limpios
  • lápiz de cera
  • papel secante absorbente
  • aceite de inmersión

LOS PROCEDIMIENTOS

  1. Primero, asegúrese de tener algunas diapositivas limpias. Reciclamos nuestros portaobjetos de microscopio y los frotis deben eliminarse del vidrio. Utilizará un líquido en polvo limpiador que funciona bien para eliminar la mancha y el tinte del vidrio.
    • En el fregadero, tome la botella del líquido limpiador de portaobjetos y vierta un poco de la suspensión espesa sobre el portaobjetos.
    • Use su dedo para esparcir la suspensión sobre cada lado del portaobjetos y luego lávese BIEN con agua del grifo.
    • Seca el portaobjetos.
  2. Harás frotis utilizando 2 tipos diferentes de cultivos, un caldo y un cultivo de agar.
    • Etiquete los 2 portaobjetos con los nombres de sus bacterias.
    • Agitando primero el cultivo, transfiera asépticamente una gota del caldo de cultivo usando un asa de inoculación a un portaobjetos limpio.
    • Del cultivo en placa de agar, retire un pequeño inóculo (use solo una pequeña cantidad de colonias grandes) con un asa y suspenda en una pequeña gota de agua destilada. Mezcle bien el cultivo en la gota de agua.
  3. Etiqueta 2 diapositivas ---Staph y E. coli.
  4. Extienda las suspensiones de frotis sobre el portaobjetos de vidrio para que forme una capa delgada y tenga el tamaño de níquel o más. NO SE UTILIZA DESLIZAMIENTO DE CUBIERTA!
  5. Deja la diapositiva secar al aire-totalmente. Este paso facilita la fijación del frotis al portaobjetos.
  6. Arreglo de calor el frotis seco pasando el portaobjetos rápidamente a través de la llama unas cuantas veces. Si sus dedos se calientan, se ha fijado DEMASIADO por calor. La fijación por calor coagulará parte del material proteico y hará que la suspensión se adhiera al portaobjetos de vidrio.
  7. Se utilizará un tinte diferente para cada bacteria.
    • E. coli y violeta cristal
    • Estafilococo y safrinin
  8. Teñir el frotis
    • Coloque el portaobjetos sobre la malla de alambre sobre la tina de tinte.
    • Inunde el frotis con el tinte: déjelo reposar durante 1 minuto.
  9. Lave bien el portaobjetos con agua destilada. Seque el portaobjetos de frotis con su almohadilla de papel absorbente.
  10. Consulte el ejercicio de laboratorio sobre MICROSCOPIA para obtener ayuda con el microscopio.
  11. Enfoque la muestra con la lente 10X (Asegúrese de estar en microscopía de campo claro).
  12. Concéntrese en el frotis con la lente de inmersión en aceite 100X. Asegúrese de leer las instrucciones en el ejercicio de MICROSCOPÍA para que sepa cómo moverse a la lente del objetivo 100X usando aceite.
  13. Identifique las diversas formas y arreglos de las bacterias usando los campos a continuación.

  1. LIMPIE SUS DIAPOSITIVAS usando el limpiador de diapositivas en los lavabos.

PREGUNTAS

  1. ¿Cuál es la desventaja de tener un frotis realmente espeso al teñir?
  2. ¿Por qué los tintes básicos son más útiles que los tintes ácidos al teñir bacterias?
  3. ¿Por qué fijar con calor el frotis?
  4. ¿Qué nombres se les da a las formas que se ven en las 2 bacterias utilizadas en el laboratorio?

Tinción especial Departamento de Biología y Biotecnología A El

v Muchas especies de bacterias pueden existir en dos estados muy diferentes. v En ambientes favorables, existen como células vegetativas metabólicamente activas. v Cuando el ambiente se vuelve desfavorable, estas células se someten al proceso de esporogénesis y forman endosporas intracelulares.

v Cuando la célula vegetativa se degenera y muere, la endospora se libera como una espora. v Cuando las condiciones se vuelven favorables, la espora germina para convertirse nuevamente en una célula vegetativa. v La endospora son células bacterianas diferenciadas altamente resistentes que son altamente resistentes al calor, a la ebullición y al secado y son difíciles de destruir. Estable durante años.

v No confunda las esporas bacterianas con las esporas de hongos, que son estructuras muy diferentes. v Varias capas gruesas de esporas rodean a las esporas bacterianas, lo que las hace muy resistentes al calor, el frío, la desecación, la radiación y una variedad de agentes químicos (incluidas muchas manchas microbiológicas). v Se deben utilizar procedimientos de tinción especiales para visualizar las esporas con un microscopio compuesto.

v El verde de malaquita es el tinte principal. v Además, el tinte debe calentarse para que penetre en la capa de esporas. v Las bacterias se decoloran con agua. v El verde de malaquita es soluble en agua a menos que esté unido a las capas de esporas. v Safranin es la contratinción.

v Cuando se describen las bacterias formadoras de esporas, la ubicación de la endospora generalmente se indica como central, terminal o subterminal.

Procedimiento 1. Haga frotis de cada organismo en portaobjetos separados. en 2. Deje que los portaobjetos se sequen al aire y luego fije con calor. 3. Aplique unas gotas de verde malaquita a las bacterias. Coloque los portaobjetos directamente en una placa caliente precalentada a temperatura baja durante 2-3 minutos. No permita que la mancha se evapore. Aplique tinte adicional, si es necesario.

4. Retire los portaobjetos de la placa caliente y déjelos enfriar. . 5. Enjuague suavemente los portaobjetos con agua. 6. Aplique suficiente safranina a los portaobjetos para cubrir las bacterias. Deje que se asiente durante 30 segundos. 7. Enjuague suavemente los portaobjetos con agua.

8. Seque (no limpie) los portaobjetos con papel absorbente. Deje que los portaobjetos se sequen al aire. 9. Examine los portaobjetos bajo inmersión en aceite. Las bacterias deben aparecer rosadas y las esporas deben verse verdes.

v Cuando una mancha, como un tinte ácido, no puede penetrar las capas externas de un microbio, la célula aparecerá transparente sobre un fondo de color. v Esta mancha se denomina mancha negativa o de fondo. v Se realiza mezclando el tinte con una suspensión de bacterias en un portaobjetos y extendiendo la mezcla en una capa delgada para su visualización.

v Cápsulas: son estructuras compuestas de carbohidratos o glicoproteínas que se encuentran fuera de la pared celular de un organismo y, por lo tanto, están en contacto directo con el medio ambiente. v Muchas bacterias producen cápsulas en las condiciones adecuadas. v Bacterias con cápsulas: Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas putida

Funciones de una cápsula: - 1. Proteger la célula de la desecación (secado). 2. Proteger la célula de los fagocitos (que son engullidos por los glóbulos blancos). 3. Proporcionar una reserva de alimentos cuando existan ciertos compuestos orgánicos en exceso. 4. Un determinante de virulencia de microbios patógenos.

5. Sirven como agentes aglutinantes o de adhesión para unir células y / o una superficie como una roca en una corriente fluida o un diente. Las cápsulas no se tiñen fácilmente y, por lo tanto, se visualizan mediante técnicas de tinción negativa.

v Los organismos se preparan como un frotis en presencia de un tinte ácido y se dejan secar al aire porque el calor hará que la cápsula se encoja. v Por lo general, la mancha negativa (que colorea el fondo) va seguida de una simple mancha para colorear la bacteria. v La cápsula aparece como una capa incolora entre la bacteria y el fondo.

Procedimiento: - 1. Utilice una aguja de inoculación para suspender el organismo en una gota de tinta china en un extremo del portaobjetos. 2. Coloque el extremo corto de un portaobjetos de microscopio limpio en la suspensión y extienda la mezcla por el portaobjetos para formar una capa delgada. 3. Deje secar al aire. No lo fije con calor.

4. Cubra el frotis con azul de metileno durante 2-3 minutos. Enjuague suavemente con agua y deje secar al aire. 5. Examinar con inmersión en aceite. 6. Diagrame la apariencia del organismo. Interpretación: Las cápsulas aparecen como zonas claras (halos) alrededor del organismo refráctil.

NOTAS: Es más probable que los cultivos más antiguos muestren producción de cápsulas. 2. Cuando realice una tinción de cápsula en su desconocido, asegúrese de que el cultivo del que toma la muestra tenga al menos cinco días de antigüedad. 3. Esta tinción se utiliza para el examen microscópico directo de cápsulas de microorganismos. 4. La tinta china proporciona un fondo semiopaco contra el que se pueden visualizar fácilmente las cápsulas transparentes.


Los científicos a menudo usan una técnica de tinción celular en una muestra antes de ver los portaobjetos bajo el microscopio. Esto mejora la totalidad o parte de la celda para que sea más fácil de ver. La tinción resulta útil cuando desea discriminar entre células vivas y muertas en una muestra, estudiar los componentes individuales de una célula, ver muestras de tejido o resaltar un proceso metabólico en el momento de la tinción.

El yodo puro a temperatura ambiente es un sólido no metálico, casi negro, según la Enciclopedia Británica. Sin embargo, dado que el yodo altamente concentrado es venenoso y puede dañar la piel y los tejidos al entrar en contacto, a menudo se diluye. El yodo se volverá violeta cuando se use en el laboratorio en su forma de vapor contenido. A menudo, encontrará yodo en una botella con tapón como un líquido marrón diluido, porque se ha mezclado con potasio para disminuir la presión y la concentración de vapor, lo que hace que su uso sea más seguro.


Tinción simple: informe de laboratorio

● El frotis se dejó secar al aire. ● Una vez que los 3 frotis se secaron, se examinaron bajo el microscopio.

Discusión: En este experimento, se tiñeron 3 microorganismos usando un v iolet de cristal durante 15 segundos y se observaron bajo un microscopio óptico usando inmersión en aceite. Se observó que Bacillus subtilis (imagen 1) tiene forma de bastón y algunas células parecen haber estado formando cadenas. Staphylococcus aureus (imagen 2) parecía muy poblado y denso. Las células están agrupadas juntas, lo que sugiere que se esparcieron demasiadas bacterias sobre el portaobjetos, lo que dificultó la visualización de muchas células individuales, como en la imagen 1. Al observar Staphylococcus aureus bajo el microscopio, también fue difícil de determinar. la forma del espécimen. Debido a esto, se investigó la forma de Staphylococcus aureus para saber cómo debería haber aparecido. Las células de Staphylococcus aureus son redondeadas y se forman en racimos con forma de uva. (Mandal 2019). En la imagen 2, las células parecen agrupadas, pero están demasiado juntas como para que se haya observado que están redondeadas. Para haber mejorado los resultados y la observación de Staphylococcus aureus, durante la preparación se debería haber recogido menos crecimiento del agar inclinado y se debería haber extendido en el portaobjetos del microscopio. La menor cantidad de crecimiento habría facilitado la visualización de células individuales y la determinación de la forma de las bacterias. Por último, se observó que Escherichia coli (imagen 3), al igual que Bacillus subtilis, también tiene forma de bastón.

Conclusión: Se utiliza una simple tinción para resaltar todo el microorganismo para que las formas celulares y las estructuras básicas sean más visibles. El microorganismo se fija con calor para matar las bacterias y unirlas al portaobjetos. Se utilizó violeta cristal como tinción simple en Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, microorganismos que se observaron al microscopio.


Ver el vídeo: Prácticas de Microbiología. Tinción de Gram. Vídeo 1 (Diciembre 2021).