Información

¿Puede una proteína que cae por debajo de un umbral desencadenar otra respuesta?


¿Es posible que la caída de la concentración de una proteína por debajo de un umbral desencadene la liberación o producción de otra proteína?


Por supuesto, eso es posible. Daré un ejemplo sencillo. Si su proteína (X) es un inhibidor de la otra proteína (Y), entonces cuando X cae, Y aumentará. En realidad, esto no sería un "umbral".

Hay muchos mecanismos que pueden conducir a un umbral que incluyen la cooperatividad (en la acción de X) y retroalimentaciones positivas. Cómo funcionan estos mecanismos sería una cuestión completamente diferente. (Una lectura rápida sería este artículo de wikipedia).


Recomendaciones para la transfusión de plasma y plaquetas

La principal indicación para la transfusión de plasma es corregir deficiencias de factores de coagulación, para los que no se dispone de un concentrado específico, en pacientes con sangrado activo. Los productos disponibles son: plasma fresco congelado (PFC), plasma que ha sufrido inactivación viral con tratamiento disolvente / detergente (S / D FFP), con azul de metileno (MB FFP) o con psoralenos, en particular amotosaleno (S59) y luz. 1 pronto estará disponible la tecnología de inactivación que utiliza riboflavina 2.

Plasma fresco congelado

Definición

Un componente sanguíneo preparado a partir de sangre completa o recogido por aféresis, congelado dentro de los límites de tiempo ya una temperatura tal que conserve adecuadamente los factores de coagulación lábiles 3 & # x02013 5.

Los PFC preparados a partir de unidades de sangre total y los derivados de la aféresis son terapéuticamente equivalentes en términos de hemostasia y efectos secundarios. (Grado de recomendación: 1A) 4 .

Propiedades

FFP contiene niveles normales de factores de coagulación estables, albúmina e inmunoglobulinas. Contiene al menos el 70% del factor VIII coagulante original y al menos cantidades similares de los otros factores de coagulación lábiles e inhibidores naturales de la coagulación 1, 3 & # x02013 5.

Los PFC para uso clínico no deben contener anticuerpos anti-eritrocitos irregulares clínicamente significativos. Para aumentar su seguridad, los FFP se pueden poner en cuarentena por un período mínimo de 4 meses.

Las diferencias fisiológicas individuales en las concentraciones de proteínas plasmáticas significan que la definición genérica de PFC se aplica a productos que difieren notablemente en calidad.

Plasma tratado con solvente / detergente

S / D FFP es un producto farmacéutico, obtenido de un pool de aproximadamente 1,000 unidades de FFP, con las siguientes características 2, 6 & # x02013 34:

- alta estandarización lote por lote

- concentración / actividad declarada de las proteínas biológicamente activas

- riesgos inmunológicos reducidos relacionados con la presencia de anticuerpos, células (o sus fragmentos)

- inactivación de la mayoría de patógenos potencialmente transmisibles

- eliminación selectiva de unidades contaminadas por el virus de la hepatitis A o el parvovirus B19.

Plasma tratado con azul de metileno

El azul de metileno (MB) es un colorante de fenotiazina con efecto viricida 2, 35 & # x02013 40. MB FFP no es un producto farmacéutico, sino que se deriva del uso de un método de inactivación aplicado a unidades individuales de plasma.

El contenido de proteínas biológicamente activas de este producto no se puede estandarizar, por lo que la variabilidad biológica de las unidades sigue siendo alta.

La posible disminución del riesgo de infección residual es la misma que para S / D FFP.

Existe alguna evidencia en la literatura de que los métodos de inactivación viral causan una disminución en las concentraciones de algunos factores de coagulación e inhibidores de la coagulación 33 & # x02013 40.

Indicaciones

La transfusión de PFC está indicada en las siguientes situaciones (Tabla I):

Corrección de deficiencias congénitas de factores de coagulación, para las que no existe un concentrado específico, o deficiencias adquiridas de múltiples factores de coagulación, cuando el PT o aPTT, expresado como una relación, es & # x0003e 1,5, en las circunstancias enumeradas a continuación 1, 3 , 4, 41 & # x02013 67:

Sangrado continuo en pacientes con enfermedad hepática. (Grado de recomendación: 1C +) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67.

Prevención de hemorragias, en caso de cirugía o procedimientos invasivos, en pacientes con enfermedad hepática. (Grado de recomendación: 2C) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67 & # x02013 70.

Pacientes en tratamiento con antagonistas de la vitamina K, en presencia de hemorragia grave o hemorragia intracraneal o en preparación para una cirugía que no pueda posponerse (Grado de recomendación: 1C +) 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67, si el concentrado de complejo de protrombina, el tratamiento de primera elección, no está disponible 55, 59 & # x02013 65.

Pacientes con coagulación intravascular diseminada aguda (CID) y hemorragia activa, en asociación con la corrección de la causa subyacente (Grado de recomendación: 1C +) 41 & # x02013 51, 53, 54, 56 & # x02013 58, 67.

Corrección del sangrado microvascular en pacientes sometidos a transfusión masiva. Si el PT y el aPTT no se pueden obtener en un período razonable, se puede transfundir FFP en cualquier caso para intentar detener el sangrado. (Grado de recomendación: 1C +) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 66, 67.

Deficiencias de factores de coagulación únicos, en ausencia del concentrado específico (por ejemplo, deficiencia de factor V), en presencia de sangrado activo o para prevenir el sangrado, en el caso de cirugía o procedimientos invasivos. (Grado de recomendación: 1C +) 41 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 67.

Tratamiento aféreo de microangiopatías trombóticas (púrpura trombocitopénica trombótica, síndrome hemoliticurémico, anemia hemolítica, enzimas hepáticas elevadas y síndrome de recuento bajo de plaquetas [HELLP]), como líquido de reemplazo. (Grado de recomendación: 1A) 41 & # x02013 52, 56 & # x02013 58, 67.

Reconstitución de sangre total para exanguinotransfusión (Grado de recomendación: 2C) 71 , 72 .

Angioedema hereditario por deficiencia de esterasa, en ausencia del inactivador de C1 derivado plasmático específico (Grado de recomendación: 2C +) 50 .

Tabla I

Indicaciones para la transfusión de plasma.

Condición clínicaGoR
1. Corrección de deficiencias congénitas o adquiridas de factores de coagulación (para las que no existe un concentrado específico), cuando la relación PT o aPTT es & # x0003e1.5:
& # x02003 & # x02003- Enfermedad hepática:
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- sangrado activong1C +
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- Prevención de hemorragias en caso de cirugía o procedimientos invasivos.2C
& # x02003 & # x02003- Durante el tratamiento con antagonistas de la vitamina K (si el complejo de protrombina, que es el tratamiento de primera elección, no está disponible):1C +
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- en presencia de hemorragia mayor o intracraneal
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003- en preparación para la cirugía que no se puede retrasar
& # x02003 & # x02003- Coagulación intravascular diseminada aguda con sangrado activo, en asociación con la corrección de la causa subyacente1C +
& # x02003 & # x02003- Sangrado microvascular durante transfusiones masivas (& # x0003e1 volumen de sangre), incluso antes de los resultados de PT y aPTT1C +
& # x02003 & # x02003- Deficiencias de factores de coagulación únicos, en ausencia de concentrados específicos (por ejemplo, de FV), en presencia de hemorragia activa o para prevenir hemorragias durante un procedimiento invasivo1C +
2. Tratamiento aféreo de microangiopatías trombóticas (púrpura trombocitopénica trombótica, síndrome hemolítico-urémico, síndrome HELLP), como líquido de sustitución1A
3. Reconstitución de sangre total para exanguinotransfusiones2C
4. Angioedema hereditario en el caso de que no se disponga del inhibidor de la esterasa C12C +

Leyenda: GoR: Grado de recomendación HELLP: anemia hemolítica enzimas hepáticas elevadas y recuento bajo de plaquetas

Indicaciones en neonatos

Los tiempos de coagulación en el recién nacido, que en promedio son más largos que los del adulto, no están necesariamente relacionados con el riesgo de hemorragia 71 & # x02013 74. Este es aún más el caso en los recién nacidos prematuros, por lo que los resultados anormales de las pruebas de coagulación, en ausencia de síntomas o riesgo hemorrágico, no son una indicación para la transfusión de PFC.

La FFP está indicada para el sangrado causado por la deficiencia de vitamina K y el sangrado (o alto riesgo de sangrado) debido a la CID. También está indicado para el tratamiento de deficiencias congénitas de factores de coagulación únicos, cuando el concentrado específico no está disponible. (Grado de recomendación: 2C) 4, 71 & # x02013 74.

La FFP debe ser & # x02018safe & # x02019, en el sentido de haber sufrido inactivación viral o haber sido puesta en cuarentena.

Para más detalles, consulte las recomendaciones conjuntas de la Sociedad Italiana de Neonatología y SIMTI 72.

Métodos de uso

El FFP debe descongelarse entre 30 & # x000b0C y 37 & # x000b0C en un baño de agua con agitación continua o con otro sistema capaz de asegurar una temperatura controlada. El plasma debe ser transfundido tan pronto como sea posible después de descongelar, pero en cualquier caso dentro de las 24 horas, si se almacena a 4 & # x000b1 2 & # x000b0C 4, 5.

Consulte la hoja de resumen del producto para obtener información sobre el tiempo máximo entre la finalización de la descongelación de S / D FFP y el inicio de su transfusión.

FFP no se debe volver a congelar una vez descongelado (Grado de recomendación: 1C +) 4 .

Régimen de dosis

La dosis terapéutica recomendada de PFC es de 10 & # x0201315 ml / kg de peso corporal 1, 4, 43, 44, 47. Sin embargo, la dosis de PFC depende de la situación clínica y los parámetros de laboratorio. (Grado de recomendación: 1C +) 1, 4, 43, 44, 47, 50, lo que puede justificar la administración de dosis mayores 75 & # x02013 77.

Compatibilidad ABO / RhD

El plasma utilizado debe ser compatible con ABO con el receptor (Tabla II) (Grado de recomendación: 1C +) 3 , 4 , 50 .

Cuadro II

Terapia de transfusión con PFC: selección del fenotipo ABO de unidades a transfundir

Fenotipo ABO del receptorFenotipo ABO de unidades a transfundir (en orden de preferencia)
OO, A, B, AB
AA, AB
BB, AB
ABAB

No es necesario que la PFC sea compatible con Rh La profilaxis anti-D no es necesaria en los receptores Rh D-negativos de FFP Rh D-positivo (Grado de recomendación: 1C +) 3 , 4 .

Indicaciones inapropiadas

- Expansión del volumen circulatorio

- corrección de inmunodeficiencias

- corrección de deficiencias congénitas o adquiridas de factores de coagulación en ausencia de hemorragia, o corrección de trastornos de la hemostasia en pacientes con enfermedad hepática crónica que no sangran (Grado de recomendación: 1C +) 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 68, 69, 71 & # x02013 73, 77 & # x02013 80.

Contraindicaciones

Las contraindicaciones absolutas para el uso de PFC son intolerancia documentada al plasma o sus componentes y deficiencia congénita de inmunoglobulina A (IgA) en presencia de anticuerpos anti-IgA 4.

Las contraindicaciones relativas son insuficiencia cardíaca y edema pulmonar.

Índices de seguimiento para la auditoría clínica

- El uso de terapia transfusional con PFC en las siguientes situaciones:

expansión del volumen circulatorio

corrección de inmunodeficiencias

corrección de deficiencias congénitas o adquiridas de factores de coagulación en ausencia de hemorragia, o corrección de trastornos de la hemostasia en pacientes con enfermedad hepática crónica que no sangran.

- Evaluación de la idoneidad de la dosis de PFC.

Reacciones adversas a la transfusión de PFC

leve (urticaria): ocurre en el 1% de los pacientes

graves y anafilácticos: ocurren con una frecuencia de menos de 1 caso por cada 100.000 transfusiones.

- Lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión (TRALI) 81 & # x02013 85: edema pulmonar no cardiogénico que se desarrolla dentro de las 4 & # x020136 horas de la transfusión de PFC. Esta complicación puede evitarse mediante el uso de plasma de donantes masculinos que nunca han recibido una transfusión y de donantes femeninas nulíparas que nunca han recibido una transfusión, o mediante el uso de S / D FFP.

- Reacciones febriles 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: ocurren en menos del 1% de los pacientes transfundidos con PFC y hasta en el 10% de los pacientes sometidos a recambio plasmático.

- Toxicidad por citrato 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: esto puede ocurrir después de la transfusión rápida de grandes volúmenes de plasma y es particularmente importante en recién nacidos y en pacientes con enfermedad hepática.

- Transmisión de infecciones 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: el proceso de congelación inactiva las bacterias, la contaminación y el crecimiento bacteriano, con liberación de endotoxinas, antes de la congelación es extremadamente improbable. Sin embargo, todavía existe el riesgo, aunque mínimo, de transmisión de infecciones virales o infecciones debidas a otros patógenos desconocidos o no probados.

- Enfermedad de injerto contra huésped (EICH) 4: nunca se han notificado casos de EICH asociada a FFP. La congelación provoca la lisis de los linfocitos, por lo que no es necesaria la irradiación del plasma.

- Sobrecarga circulatoria 3, 4, 42 & # x02013 51, 56 & # x02013 58, 71 & # x02013 73: esto puede ocurrir, especialmente en pacientes con insuficiencia renal o cardiorrespiratoria.

- Inhibidores frente a proteínas deficientes 86: pueden desarrollarse tras la transfusión de plasma en pacientes con deficiencias severas de factores de coagulación.

Referencias


INTRODUCCIÓN

Durante la mitosis, los microtúbulos del huso sondean el espacio tridimensional de la célula en un proceso de "búsqueda y captura" que es importante para la interacción eficiente de los microtúbulos más extremos con la corteza celular y los cinetocoros (revisado en Kline-Smith y Walczak, 2004) . Se cree que un aumento en la dinámica de los microtúbulos al inicio de la mitosis facilita la orientación y alineación oportuna de los cromosomas en metafase. También se ha propuesto un cambio adicional en la dinámica de los microtúbulos para contribuir a las fuerzas que segregan los cromosomas y alargan el huso mitótico en anafase (revisado en Scholey et al., 2003). La inhibición de la dinámica de los microtúbulos por mutaciones en proteínas que se asocian con microtúbulos más extremos o por la adición de fármacos conduce a fallas en la alineación y segregación cromosómicas (Berlín et al., 1990 Dujardin et al., 1998 Gruss et al., 2002 Maiato et al., 2002 Rogers et al., 2002 Andrews et al., 2004 Cassimeris y Morabito, 2004 Kline-Smith y Walczak, 2004 Vaughan, 2004). Por lo tanto, regular adecuadamente las propiedades dinámicas de los microtúbulos es fundamental para garantizar la segregación precisa de los cromosomas en la mitosis.

Aunque los cambios en la dinámica de los microtúbulos durante la mitosis están bien documentados, los mecanismos que controlan el comportamiento de los microtúbulos son menos claros. Varias proteínas asociadas a microtúbulos, así como factores solubles que emanan de los cromosomas, se han implicado en la regulación de la dinámica de los microtúbulos, lo que sugiere que una red compleja de proteínas controla los microtúbulos durante la mitosis. Los extremos positivos de los microtúbulos son un importante sitio de unión para las proteínas que regulan los microtúbulos. Se ha demostrado que la familia de proteínas llamada + TIPs regula la dinámica de los microtúbulos en varios sistemas e incluye EB1, CLIP-170, CLASP, dineína, LIS1, subunidad de dinactina p150 pegada y poliposis coli adenomatosa (APC revisado en Karsenti y Vernos, 2001 Kline-Smith y Walczak, 2004 Vaughan, 2004). Además de compartir una localización común en los extremos positivos de los microtúbulos, estas proteínas típicamente modulan las transiciones entre el crecimiento y la contracción de los microtúbulos. Uno de los TIP + mejor caracterizados es el EB1, cuya función como factor “anti-pausa” está bien conservada. La inhibición de EB1 en varios sistemas da como resultado microtúbulos no dinámicos que pasan la mayor parte del tiempo en un estado de pausa (Tirnauer et al.,1999, 2002b Rogers et al., 2002). Experimentos de inmunodepleción de EB1 en Xenopus extractos da como resultado una reducción drástica en la longitud de los microtúbulos. De manera similar, el agotamiento del ARNi de EB1 en Drosophila embriones da como resultado una reducción de la estabilidad de los microtúbulos y la rotura de los husos mitóticos (Rogers et al., 2002 Tirnauer et al., 2002b). Por el contrario, se ha informado que otras proteínas + TIP, incluida LIS1, suprimen la dinámica de los microtúbulos in vitro al reducir las catástrofes, la inhibición de LIS1 da como resultado uniones defectuosas cinetocoro-microtúbulos (Faulkner et al., 2000 Coquelle et al., 2002 Tai et al., 2002). Por lo tanto, es probable que un equilibrio de actividades en los extremos de los microtúbulos plus optimice el proceso de búsqueda y captura, asegurando que los extremos de los microtúbulos plus encuentren de manera eficiente sus sitios de unión.

APC puede interactuar directamente con los microtúbulos a través de su región básica o puede interactuar indirectamente con los microtúbulos a través de su asociación con la proteína asociada a kinesina II, KAP3a, o con el + TIP, EB1 (Nathke et al., 1996 Mimori-Kiyosue et al.,2000a, 2000b Mogensen et al., 2002 Etienne-Manneville y Hall, 2003 Wen et al., 2004). Mediante estudios de unión de dos híbridos de levadura e in vitro, se ha demostrado que EB1 interactúa con el terminal carboxi de APC, mientras que KAP3a interactúa con el dominio de armadillo amino terminal en APC (Su et al., 1995 Jimbo et al., 2002). La unión del terminal carboxi de APC a EB1 mejora la capacidad de EB1 para unirse a lo largo de los microtúbulos polimerizados in vitro, argumentando que APC puede funcionar para "cargar" EB1 en microtúbulos más extremos (Nakamura et al., 2001). La posible conexión fisiológica entre APC y EB1 está respaldada por un trabajo reciente que muestra que la interacción entre estas dos proteínas es importante para la formación de microtúbulos estables en los fibroblastos migratorios (Wen et al., 2004). Estos hallazgos plantean la posibilidad de que APC pueda regular la actividad de + TIP, como EB1, en respuesta a señales asociadas con eventos celulares polarizados.

Curiosamente, la APC también se ha implicado en la función adecuada del huso mitótico. La APC se localiza en los extremos positivos de los microtúbulos del cinetocoro durante la mitosis, lo que sugiere que también puede influir en la estabilidad o la unión de los microtúbulos en este contexto. De acuerdo con esta hipótesis, las células madre embrionarias que carecen de APC de tipo salvaje y las células que expresan formas mutantes de APC son susceptibles a errores de segregación cromosómica (Fodde et al., 2001 Kaplan et al., 2001 Green y Kaplan, 2003 Dikovskaya et al., 2004 Louie et al., 2004). Un trabajo reciente demuestra que la segregación cromosómica y los errores de posicionamiento del huso pueden deberse a defectos de unión del microtúbulo más el extremo en las células que expresan formas mutantes de APC (Green y Kaplan, 2003 Tighe et al., 2004).Es posible que los mutantes APC afecten la capacidad de los microtúbulos para localizar su sitio de unión, al perturbar la dinámica de los microtúbulos o, alternativamente, al afectar la integridad del sitio de unión. EB1 y APC también se han implicado en el posicionamiento del huso en eucariotas superiores (Lu et al., 2001 McCartney et al., 2001 Yamashita et al., 2003). Por tanto, es razonable plantear la hipótesis de que EB1 y APC pueden cooperar en los extremos de los microtúbulos más para regular la dinámica de los microtúbulos durante la mitosis.

Anteriormente mostramos que una forma truncada de APC (APC 1-1450), similar a la proteína expresada en muchos cánceres colorrectales, compromete de manera dominante las uniones de microtúbulos en el extremo positivo durante la mitosis, lo que da como resultado un huso mitótico interrumpido y errores en la segregación cromosómica. En este artículo investigamos la base molecular que subyace a este fenotipo dominante. Encontramos que la inhibición de EB1 o APC causa defectos notablemente similares a los observados en células que expresan APC 1-1450. La inhibición de EB1 y APC no tiene un efecto aditivo, argumentando que estas proteínas funcionan juntas para regular los husos mitóticos. Encontramos que la inhibición de APC o EB1 causa defectos de alineación cromosómica pero no detención mitótica en contraste, la inhibición de otros TIPS + resulta en defectos de alineación cromosómica y una detención mitótica robusta. De acuerdo con una relación funcional entre APC y EB1, encontramos que APC 1-1450 forma un heterooligómero con APC endógena y que la formación de este complejo impide la asociación de EB1 con APC. Las imágenes en vivo de los cometas EB1-GFP revelan un aumento significativo en la frecuencia de pausas en las células que expresan APC 1-1450. Juntos, estos resultados proporcionan evidencia convincente de que APC regula el huso mitótico a través de EB1, además, las mutaciones de APC que inician tumores pueden promover errores de alineación cromosómica al tiempo que permiten la división celular, lo que potencialmente contribuye a la inestabilidad cromosómica en las células tumorales.


Introducción

La diversidad y la complejidad de los proteomas celulares han impulsado el desarrollo de una amplia gama de protocolos para mejorar los análisis por espectrometría de masas (MS). En los experimentos tradicionales de abajo hacia arriba, estos métodos se optimizan para mejorar la profundidad de la cobertura del proteoma mediante la generación de condiciones favorables para la digestión proteolítica y la recuperación de muestras (León et al, 2013 Tanca et al, 2013) y han llevado a la cartografía de los proteomas casi completos de varias líneas celulares de mamíferos (Beck et al, 2011 Moghaddas Gholami et al, 2013 Branca et al, 2014). Sin embargo, el rendimiento en los experimentos proteómicos cae abruptamente cuando las cantidades de proteína son limitadas, debido a ineficiencias relacionadas con el procesamiento de muestras y la sensibilidad del instrumento. Aunque las innovaciones recientes en la instrumentación espectrométrica de masas han acelerado la velocidad y la sensibilidad del análisis de proteomas (Hebert et al, 2014), se pueden obtener más mejoras haciendo hincapié en la optimización, simplificación y miniaturización de la preparación de muestras.

Para mejorar el procesamiento de las muestras, a menudo se utilizan agentes que ayudan en la disgregación y solubilización celular, como detergentes y caótropos. De manera problemática, la mayoría de estos aditivos son incompatibles con la proteólisis y el análisis de EM y, por lo tanto, es necesario eliminarlos mediante ultrafiltración (Wisniewski et al, 2009) y a base de perlas (Bereman et al, 2011 Hengel et al, 2012) o enfoques de precipitación, cada uno de los cuales aumenta la manipulación y la consiguiente pérdida de material. A medida que la proteómica basada en MS avanza hacia el análisis de muestras raras y con cantidades limitadas, los flujos de trabajo ultrasensibles que eliminan estas pérdidas son esenciales (Altelaar & Heck, 2012). Esto ha llevado al desarrollo de metodologías que minimizan el manejo y promueven una alta recuperación de muestras (Ethier & Hou, 2006 Umar et al, 2007 Vadeadores et al, 2009 Wang et al, 2010 Di Palma et al, 2011 Wisniewski et al, 2011a Sol et al, 2013 Erde et al, 2014 Kulak et al, 2014 Zougman et al, 2014). Sin embargo, estos protocolos tienen una flexibilidad limitada debido a varias deficiencias, incluidas las incompatibilidades de reactivos (detergentes, caotrópicos, sales), el uso requerido de alternativas de detergente (por ejemplo, anfipolitos), las restricciones relacionadas con el volumen absoluto de la muestra, el rendimiento y la manipulación excesiva. Posteriormente, estos flujos de trabajo se han limitado típicamente al procesamiento de cantidades absolutas de material & gt 1 μg o lograr una cobertura de proteoma reducida (

2.000 proteínas en total) al examinar cantidades sub-microgramos de proteína. Estos inconvenientes han impedido en gran medida el uso de proteómica en aplicaciones en las que son necesarias una alta reproducibilidad, sensibilidad y rendimiento, como en estudios clínicos o cribado de poblaciones.

La rápida expansión de la secuenciación de próxima generación ha impulsado el desarrollo de métodos susceptibles de preparación de bibliotecas de genomas de alto rendimiento que se facilitan en gran medida mediante la aplicación de perlas paramagnéticas en plataformas manuales y robóticas (DeAngelis et al, 1995 Wilkening et al, 2013). Sin embargo, el uso de perlas paramagnéticas no es común en la proteómica general, aunque se han empleado en aplicaciones especializadas para el acoplamiento covalente o la purificación por afinidad de proteínas, proteólisis inmovilizada (Fan et al, 2014), y para el enriquecimiento de péptidos modificados postraduccionalmente (Yeh et al, 2012 Zeng et al, 2012). Las tecnologías recientes basadas en partículas de nanodiamantes han ilustrado el agotamiento de las sustancias contaminantes y la mejora de la proteómica específica del compartimento (Chen et al, 2006 Pham et al, 2013). Sobre la base de los desarrollos tecnológicos iniciados por la inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) (DeAngelis et al, 1995) y tecnologías de nanodiamantes (Chen et al, 2006), y con el objetivo de mejorar y simplificar el procesamiento de muestras proteómicas genéricas, hemos desarrollado SP3. SP3 es un nuevo flujo de trabajo de proteómica de un solo tubo que proporciona una unión imparcial eficiente de proteínas y péptidos, lo que permite completar de manera rápida y eficiente los flujos de trabajo de proteómica comunes de una manera de alto rendimiento.

En este estudio, SP3 se aplica a una variedad de aplicaciones proteómicas convencionales y ultrasensibles. Basándonos en la observación de que SP3 proporcionó una plataforma mejorada para manejar cantidades de sub-microgramos de material determinadas a partir de células HeLa de perfiles de proteomas en profundidad, aplicamos SP3 para examinar el desarrollo embrionario utilizando Drosophila embriones. Si bien existe una gran cantidad de datos de expresión génica para Drosophila, su dinámica de proteoma durante el desarrollo ha sido el foco de relativamente pocos estudios (Carmena, 2009). Con un enfoque basado en SP3, el proteoma aquí se perfila a una profundidad de & gt 6.000 proteínas, de las 18.000 proteínas previstas en el Drosophila genoma, de embriones agrupados a las 2-4 h (estadios 5-7) y a las 10-12 h (estadios 13-15) de desarrollo. Este análisis se amplió para capturar la dinámica en una pantalla ultrasensible con una resolución de un solo embrión. Estos datos representan el catálogo más grande de la Drosophila proteoma embrionario hasta la fecha, al tiempo que proporciona una sensibilidad incomparable para las comparaciones cuantitativas que tienen el potencial de revelar una nueva variación del proteoma interindividual. Además, el uso de SP3 en estos estudios ilustra sus ventajas potenciales en otras áreas de la biología clínica y del desarrollo donde se requiere un análisis cuantitativo en profundidad reproducible para explicar la variación interindividual con cantidades de muestra escasas.


Excitabilidad del músculo esquelético

Nicholas Sperelakis,. Hugo González-Serratos, en Cell Physiology Source Book (cuarta edición), 2012

XIII Conducción del potencial de acción

Cuando el EPP, generado en la unión neuromuscular, alcanza el umbral para provocar un AP en la fibra del músculo esquelético de contracción de los vertebrados, un AP se propaga por la fibra muscular en ambas direcciones desde la placa terminal. (En algunas fibras musculares, hay una segunda placa terminal inervada por una motoneurona que sale de la médula espinal a otro nivel). El AP está sobrepasando (a aproximadamente +40 mV) y se propaga a una velocidad constante de aproximadamente 5 m / s sobre el sarcolema superficial. La propagación se produce por medio de la corrientes de circuito local que acompañan al impulso, como se discutió en el Capítulo 19. Se remite al lector a ese capítulo para obtener detalles sobre la corrientes radiales (transmembrana) y el corrientes longitudinales (axiales). Las corrientes longitudinales externas pueden utilizar todo el espacio ISF (ya que la corriente toma el camino de menor resistencia), lo que permite registrar el electromiograma (EMG) de la piel que recubre un músculo esquelético activado. La amplitud de los potenciales EMG aumenta cuando se activan más fibras dentro del músculo (suma de fibras), debido a la suma de las caídas de voltaje IR producidas por cada fibra activada simultáneamente. La frecuencia de los potenciales EMG refleja la frecuencia y asincronía de activación del músculo.

Las fibras del músculo esquelético están formadas por células de mioblastos que se han fusionado de un extremo a otro para convertirse en largos miotubos multinucleados y luego en fibras cilíndricas más adelante en el desarrollo. Se comportan como cables semiinfinitos. Es decir, un AP puede propagarse de un extremo de la fibra al otro, de manera uniforme y sin obstáculos. La constante espacial o constante de longitud (λ) del cable de fibra es de aproximadamente 1,5 mm para las fibras de sartorio de rana (Sperelakis et al., 1967) y de aproximadamente 0,76 mm para el músculo EDL de rata (Sellin y Sperelakis, 1978). La constante de longitud es la distancia sobre la cual un voltaje aplicado en una región decaería a 1 / e (1 / 2.717 = 0.368) o 36.8% del valor inicial. Es decir, en un cable pasivo, el voltaje decae exponencialmente con una cierta longitud constante dada por:

dónde VX es el voltaje a la distancia X y Vo es el voltaje en el origen (X = 0). λ viene dado por:

Asumiendo que ro (la resistencia longitudinal exterior) es insignificante en comparación con rI (esto sería cierto para una fibra superficial en un paquete sumergido en un baño grande):

dónde rmetro (Ω · cm) y rI (Ω / cm) son la resistencia de la membrana y la resistencia longitudinal interna normalizadas para la longitud unitaria de fibra, Rmetro (Ω · cm 2) es la resistencia de la membrana normalizada para el radio y la longitud de la fibra, RI (Ω · cm) es la resistividad del mioplasma (normalizada para la longitud y el área de la sección transversal), y a (cm) es el radio de la fibra. Rmetro a menudo se llama vagamente resistividad de membrana, pero esto no es exacto porque para la resistividad de membrana verdadera (ρmetro) debe haber una corrección para el espesor de la membrana δ:

Los factores que determinan la velocidad activa de propagación (θα) incluyen la intensidad de la corriente del circuito local, el potencial umbral y las propiedades del cable pasivo, λ y τmetro. Como se discutió anteriormente, cuanto mayor es la tasa de aumento del AP, mayor es la intensidad de la corriente del circuito local, por lo tanto, mayor es θα. Además de su dependencia de la densidad de los canales rápidos de Na + (determinante de la conductancia máxima de Na +, g ¯ Na), las propiedades cinéticas de la compuerta del canal y el potencial umbral (Vth), máx. dV / dt también está determinado por el RP (o potencial de despegue) (relacionado con el h versus mimetro curva), como se discutió anteriormente (Fig. 42.9). Además, debido a que el enfriamiento disminuye la activación del canal de Na (Q10≃3), máx. dV / dt y θα se ralentizan en consecuencia. Rmetro aumenta con el enfriamiento, la Q10 para RK en las fibras de sartorio de rana es de aproximadamente 2,8 (la difusión de iones en solución libre tiene un Q10 de aproximadamente 1,2) (Sperelakis, 1969). Para obtener una descripción de la conducción pasiva, consulte el Apéndice III de este capítulo.

FIGURA 42.9. Representación gráfica de la tasa máxima de aumento de la APl (máx. dV / dt) en función del reposo mimetro o potencial de despegue. Max dv / dt es una medida de la intensidad de la corriente de entrada (la capacitancia de la membrana es constante), que depende del número de canales disponibles para la activación h es el factor de inactivación de Hodgkin-Huxley como gramoN / A = g ¯ Na m 3 h, donde gramoN / A es la conductancia de Na +, g ¯ Na es la conductancia máxima y metro y h son variables h representa h a t = ∞ o estado estacionario (prácticamente, después de 20 ms). Los canales rápidos de Na + comienzan a inactivarse a aproximadamente -75 mV y la inactivación casi completa ocurre a aproximadamente -30 mV (h bajo). Por lo tanto, max dV / dt disminuye porque h disminuye.


3 RESULTADOS

3.1 La expresión de alto nivel de TIR1 causa el agotamiento de la proteína diana independiente de auxinas

Primero, comparamos las cepas PADH1–701-TIR1 y PADH1–409-TIR1 que expresan constitutivamente TIR1 a niveles altos o bajos, respectivamente (Figura 1a, b). Con este fin, marcamos C-terminalmente el factor de empalme Prp22 con una fusión entre un degron dependiente de auxina truncado, llamado AID * (Morawska & Ulrich, 2013) y seis repeticiones en tándem del epítopo FLAG, en las cepas PADH1–701-TIR1 y PADH1–409-TIR1. Para medir la tasa de agotamiento de la proteína diana, agregamos auxina (ácido indol-3-acético) a los cultivos (tiempo 0), y las muestras se tomaron después de 5, 15 y 30 minutos y se congelaron rápidamente.

La cuantificación de proteínas en las muestras (Figura 1b, c) muestra que en el momento 0 (sin auxina), los niveles de Prp22 eran un 47% más bajos en PADH1–701-TIR1 que en PADH1–409-TIR1. Como PADH1–701-TIR1 expresa constitutivamente TIR1 a un nivel más alto, esto puede indicar que un exceso de TIR1 puede causar un agotamiento incontrolado de la proteína diana. Además, la tasa de depleción de Prp22 fue mayor en PADH1–701-TIR1 que en PADH1–409-TIR1. A los 30 minutos de la adición de auxina, los niveles de Prp22 habían caído por debajo del 6% de los valores iniciales en PADH1–701-TIR1, en comparación con el 35% restante en PADH1–409-TIR1, lo que sugiere que los niveles altos de TIR1 promueven un agotamiento más rápido.

Por lo tanto, creamos una cepa inducible-TIR1 colocando el OsTIR1 gen bajo el control del promotor Z4EV (Z4EVpr). Esto se hizo reemplazando los no esenciales APE2 gen en la cepa YMN3 que expresa Z4EV (McIsaac et al., 2013) con un Z4EVpr-OsTIR1-Cassette V5 (Figura 1a). Para promover la localización de la proteína TIR1 en el núcleo, donde se encuentran nuestras proteínas objetivo, fusionamos una señal de localización nuclear (NLS) SV40 a la TIR1-secuencia de codificación. La cepa resultante, PZ4EV-NTIR1, produce la proteína TIR1-V5 rápidamente después de la adición de β-estradiol al medio de cultivo (Figura 1b), y se agregó auxina después de la preinducción de TIR1 durante 30 min. En estas condiciones, Prp22 se agotó rápidamente después de la adición de auxina, sin agotamiento detectable independiente de auxina (Figura 1b, c).

A continuación, para probar la hipótesis de que los niveles de TIR1 se correlacionan inversamente con los niveles de la proteína diana en ausencia de auxina, un cultivo de PZ4EV-NTIR1 con etiqueta AID * -6FLAG PRP22 se incubó con β-estradiol pero sin auxina, y se midieron los niveles de Prp22 a lo largo del tiempo. De acuerdo con nuestra observación anterior, a los 50 min de incubación con β-estradiol, el nivel de Prp22 había disminuido significativamente y alcanzó el 35% del valor inicial a las 2 h de incubación, momento en el cual la proteína TIR1-V5 estaba bien inducida (Figura 2 ). El agotamiento independiente de auxinas de Yhc1 y Rrp44 se muestra en la Figura S2 y fue menos pronunciado con el Rrp44 más abundante. Llegamos a la conclusión de que los niveles altos de TIR1 pueden causar un agotamiento de la proteína diana independiente de las auxinas en la levadura en ciernes.

3.2 La tasa de agotamiento se puede ajustar modulando la duración de la preincubación con β-estradiol

A continuación, investigamos cómo la tasa de depleción inducida por auxinas está influenciada por la duración de la preincubación de β-estradiol. Sobre la base de los resultados anteriores, anticipamos que no solo los tiempos de preincubación más largos conducirían a un agotamiento más rápido, sino también a un agotamiento más independiente de las auxinas y que puede haber un tiempo de preincubación óptimo, que probablemente sea específico del objetivo. Para probar esto, usamos como objetivos para el agotamiento, Prp22 (232 copias / celda), Prp2, otro factor de empalme esencial con abundancia similar (211 copias / celda), y la enzima de desencadenamiento más expresada, Dcp1 (4,189 copias / celda Kulak , Pichler, Paron, Nagaraj y Mann, 2014). Realizamos un análisis de agotamiento del curso del tiempo en el que los cultivos de estas cepas marcadas con AID * se preincubaron con β-estradiol durante diferentes tiempos (20, 30, 40 o 60 min) antes de la adición de auxina. A continuación, se tomaron muestras para el análisis de proteínas a intervalos de 5 minutos. A medida que los niveles de TIR1 aumentan con el tiempo de incubación de β-estradiol, esto nos permitió medir la relación entre la abundancia de TIR1 y la tasa de agotamiento dependiente de auxinas de diferentes proteínas diana.

El análisis de cuantificación de proteínas (Figura 3) muestra que diferentes proteínas diana se agotaron a diferentes velocidades. Una preincubación de 20 min con β-estradiol fue suficiente para reducir Prp22 y Prp2 a niveles bajos (≤ 20%) dentro de los 15 min posteriores a la adición de auxina, pero las preincubaciones más prolongadas con β-estradiol dieron como resultado una degradación independiente de auxina. Por el contrario, la Dcp1 más abundante requirió 60 min de preincubación de β-estradiol para lograr un agotamiento igualmente rápido y eficiente porque se debe degradar más proteína Dcp1 para lograr un agotamiento eficiente en términos de porcentaje de la cantidad inicial, y esto evidentemente requiere más Proteína TIR1. En particular, con las tres proteínas diana, hubo una correlación directa entre la duración de la preincubación de β-estradiol y la tasa de agotamiento, de modo que la duración del tratamiento con β-estradiol debe optimizarse para cada proteína diana (ver también Figura S2).

3.3 β-est AID codificada por plásmidos y el efecto de la localización de la proteína TIR1 sobre la eficiencia del agotamiento dirigido

Para facilitar la inserción de los componentes β-est AID en la levadura en ciernes, construimos un plásmido centromérico, pZTRL, que contiene P ACTO 1 -Z4EV y Z4EVp-OsTIR1 (sin NLS) casetes de expresión (Figura 4a). Luego probamos pZTRL y, al mismo tiempo, investigamos el efecto de fusionar un NLS a TIR1 sobre la eficiencia de agotamiento de una proteína nuclear. Con este fin, medimos los niveles de proteína diana TIR1 y Prp22 en la cepa portadora de pZTRL y en dos cepas que contienen genómicamente integrados TIR1, con (PZ4EV-NTIR1) o sin (PZ4EV-TIR1) NLS en el terminal N de TIR1 (Figura 4b, c).

Observamos que el nivel de proteína TIR1 inducido por β-estradiol era aproximadamente tres veces mayor en el genoma TIR1 (PZ4EV-TIR1) en comparación con la cepa genómica NLS-TIR1 (PZ4EV-NTIR1) o codificado por plásmido TIR1 cepas, lo que indica que TIR1 se expresa mejor cuando está integrado genómicamente y carece de NLS.Curiosamente, Prp22, que es una proteína localizada en el núcleo, se agotó rápidamente independientemente de la presencia o ausencia de NLS en el extremo N de la proteína TIR1. Esto sugiere que, para el agotamiento de las proteínas nucleares, no es necesario agregar un SV40 NLS a TIR1. En particular, el agotamiento dirigido fue más lento en la cepa TIR1 codificada por plásmido en comparación con las otras dos cepas, alcanzando el 15% en comparación con el 2% de los valores iniciales de Prp22 30 min después de la adición de auxina, probablemente debido a una menor expresión de TIR1 en esta cepa.


¿Puede el lanzamiento de monedas reemplazar los experimentos con animales?

En lugar de repetir un experimento en un modelo de ratón de la enfermedad en su laboratorio, los investigadores en Berlín, Alemania, utilizaron un lanzamiento de moneda para confirmar si un medicamento protege al cerebro contra un derrame cerebral, como se informó en su artículo publicado el 9 de abril en la revista de acceso abierto. PLOS Biología.

Con este experimento provocador y aparentemente absurdo, Sophie Piper y sus colegas del Instituto de Salud de Berlín (BIH) y la Charit & eacute -Universit & aumltsmedizin de Berlín exponen drásticamente un problema que potencialmente afecta a muchos estudios en biomedicina experimental. Los tamaños de muestra pequeños, a menudo por debajo de 10, y los umbrales casi universalmente sueltos para aceptar la significación estadística (5%) conducen a una alta tasa de resultados falsos positivos y una sobreestimación de los efectos verdaderos. Su estudio alerta a los investigadores de que, contrariamente a las expectativas comunes, la replicación de un estudio, en entornos que son comunes en muchos laboratorios en todo el mundo, puede no agregar más evidencia a lo que se podría ganar al lanzar una moneda.

Muchos campos de investigación están luchando con lo que se ha denominado "la crisis de la replicación". Muy a menudo, los investigadores de otro laboratorio no pueden replicar los resultados de un laboratorio, con tasas de replicación exitosas que a menudo caen por debajo del 50%. Esto ha debilitado la confianza en la solidez de la empresa científica en general y ha estimulado la búsqueda de causas subyacentes. Con este fin, muchos investigadores han comenzado a repetir experimentos dentro de sus laboratorios como parte integral de una ciencia sólida y una buena práctica científica. Sin embargo, en su artículo, Piper y sus colegas analizan la utilidad de replicar experimentos dentro de los laboratorios y envían un sorprendente mensaje de precaución con respecto a las prácticas de replicación actuales. Proporcionan antecedentes teóricos y prácticos detallados sobre cómo realizar e informar adecuadamente los estudios de replicación para ayudar a los científicos a ahorrar recursos y prevenir el uso inútil de animales, al tiempo que aumentan la solidez y reproducibilidad de sus resultados.

"La replicación es fundamental para el proceso científico. Podemos aprender de la replicación exitosa y fallida, pero solo si las diseñamos, realizamos e informamos adecuadamente", dijeron los autores.


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Abstracto

Objetivo- Estudios anteriores sugieren que la proteína de choque térmico (HSP) 60 tiene un papel contribuyente en el desarrollo de la aterosclerosis. Examinamos si la proteína HSP70 circulante y los anticuerpos anti-HSP70 están asociados con la enfermedad de las arterias coronarias (CAD).

Métodos y resultados Se analizaron muestras de sangre de 421 pacientes (62% hombres, edad media 57 años) evaluados para CAD mediante angiografía coronaria. El suero HSP70 fue detectable en el 67% de los sujetos del estudio con niveles que oscilaban entre 0,2 y 27,1 ng / ml (media, 1,08, mediana, 0,5). Los niveles de HSP70 fueron más altos en pacientes sin EAC que en pacientes con EAC (mediana, 0,72 versus 0,34 PAG= 0,0006). Las personas con niveles de HSP70 por encima de la mediana (0,5 ng / ml) tenían la mitad del riesgo de enfermedad coronaria que las personas con niveles por debajo de la mediana (razón de posibilidades ajustada, 0,52 límite de confianza del 95%, 0,32 a 0,86). La asociación de niveles altos de HSP70 con bajo riesgo de EAC fue independiente de los factores de riesgo de EAC tradicionales (PAG= 0,011). La gravedad de la enfermedad (número de vasos enfermos) también se asoció inversamente con los niveles de proteína HSP70 (PAG= 0,010). La razón de posibilidades ajustada de tener enfermedad multivaso para pacientes con niveles altos de proteína HSP70 fue de 0,54 (límite de confianza del 95%, 0,36 a 0,81). Por el contrario, no se encontró asociación entre la seropositividad de IgG anti-HSP70 y la prevalencia de EAC (PAG=0.916).

Conclusiones Estos datos proporcionan la primera evidencia de que los altos niveles de HSP70 humana están asociados con el bajo riesgo de CAD, probablemente a través de sus múltiples efectos protectores sobre la respuesta de una célula al estrés.

Las proteínas de choque térmico (HSP) constituyen una gran familia de proteínas que ayudan en la respuesta celular al estrés agudo. La importancia de estas proteínas es evidente por el hecho de que son ubicuas y están muy conservadas en todas las especies. Aunque las HSP son principalmente moléculas intracelulares, cuando se sobreexpresan en respuesta al estrés, pueden transportarse y residir en la membrana celular, donde pueden ser reconocidas por el sistema de vigilancia inmunitaria y funcionar como autoantígenos. También pueden liberarse de las células a la sangre y tener actividad biológica. 1,2 Por tanto, cuando se sobreexpresan, las HSP pueden evocar respuestas distintas de las asociadas con su ubicación intracelular, y estas respuestas pueden tener el potencial de tener consecuencias deletéreas. Por ejemplo, los niveles séricos de HSP60 estaban significativamente elevados en sujetos con aterosclerosis carotídea prevalente / incidente, así como en pacientes con hipertensión límite. 3,4 Se ha informado que los anticuerpos contra HSP60 están asociados tanto con la presencia como con la gravedad de la enfermedad arterial coronaria (EAC) clínicamente significativa. 5

La evidencia experimental sugiere un papel cardioprotector de otro miembro de esta familia, HSP70, en varios ejemplos de estrés miocárdico agudo. 6-8 Por ejemplo, los corazones de ratones transgénicos que sobreexpresan HSP70 exhiben una mayor resistencia a la lesión isquémica. 8 Debido a que se han detectado anticuerpos contra HSP70, como lo han hecho contra HSP60, esto plantea la posibilidad de que HSP70 pueda desencadenar respuestas autoinmunes que podrían atenuar cualquier efecto celular beneficioso intrínseco o, como la respuesta a HSP60, incluso exacerbar el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, se dispone de datos experimentales o clínicos limitados con respecto a los efectos de HSP70 sobre la aterogénesis.

El propósito de la presente investigación fue determinar si existen asociaciones entre la expresión de HSP70 y la aterogénesis. Específicamente, determinamos si la proteína HSP70 circulante y los anticuerpos anti-HSP70 están asociados con CAD.

Métodos

Asignaturas

Cuatrocientos veintiún individuos, bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de los Institutos Nacionales de Salud, ingresaron al estudio. La cohorte de estudio estuvo constituida por individuos con dolor torácico o con pruebas no invasivas compatibles con isquemia miocárdica que fueron remitidos para coronariografía. Todos los participantes se sometieron a un examen clínico y una evaluación de la exposición actual y pasada a los factores de riesgo de CAD tradicionales, como se describió anteriormente. 5 Un paciente se definió como con EAC si había evidencia angiográfica de aterosclerosis (≥50% de estenosis de al menos una arteria coronaria principal por angiografía coronaria). Se excluyeron los pacientes con valvulopatía cardíaca significativa o miocardiopatía no aterosclerótica. Ningún paciente admitido en el estudio tuvo un infarto de miocardio en los últimos 3 meses.

Proteína sérica HSP70 y anticuerpos anti-HSP70

Se obtuvieron muestras de suero de los sujetos del estudio antes del momento de la angiografía coronaria. Las muestras se congelaron a -80 ° C y las alícuotas se descongelaron solo cuando se realizaron pruebas específicas. Los niveles de proteína HSP70 en suero se determinaron usando kits de ELISA disponibles comercialmente (StressGen Biotechnologies Corp). Las concentraciones de proteína HSP70 se determinaron por comparación con una curva estándar de acuerdo con la dirección del fabricante. La curva estándar tiene un rango de 0,78 a 50 ng / mL y la sensibilidad del ensayo es de 0,2 ng / mL.

Los anticuerpos IgG contra HSP70 humana se determinaron mediante ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación de noventa y seis pocillos con 5 µg / ml de HSP70 recombinante (StressGen Biotechnologies Corp) en 100 µl de tampón carb / Bicarb (pH 9,6) por pocillo a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con tampón de lavado (Wampole) y bloquear con BSA al 3% en PBS a temperatura ambiente durante 3 horas, las placas se incubaron con 100 μL de muestras de suero diluidas en diluyente de suero (Wampole) a 1 en 50 a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de un lavado adicional, las placas se incubaron con anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido 1 en 10 000 con PBS. Después del lavado, se añadieron a los pocillos 100 µl de solución de cromógeno / sustrato que contenía tetrametilbencidina (Wampole). Se midió la absorbancia a 450 nm después de 10 minutos después de la adición de la solución de parada (Wampole). Después de la corrección de la absorbancia de fondo, una muestra de suero se consideró positiva para anticuerpos contra HSP70 humana si la densidad óptica excedía un valor de corte definido prospectivamente de 0,60. Este valor de corte se calcula a partir de los valores de absorbancia de control negativo y positivo.

Niveles de proteína C reactiva en suero

La proteína C reactiva (PCR) sérica se midió mediante tecnología de inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA) (analizador TDxFLEx, Laboratorio Abbott). Usando este ensayo, el 95% de los individuos sanos (n = 202) tenían un nivel de PCR de ≤0.5 mg / dL y el 98% tenían niveles ≤1.0 mg / dL, respectivamente, en sus sueros. El coeficiente de variación entre corridas de este ensayo (n = 31) fue de 4,3% y 2,2% a niveles medios de 1,10 y 2,94 mg / dL, respectivamente.

Análisis estadístico

Los datos distribuidos normalmente se presentan como media y desviación estándar (DE), mientras que los datos distribuidos de forma no normal se presentan como mediana y rango intercuartílico (IQR). Las comparaciones entre los puntos finales se realizaron utilizando t probar distribuciones paramétricas y el Mann-Whitney U prueba para distribuciones no paramétricas. Los datos categóricos se analizaron mediante la prueba de χ 2 o la prueba exacta de Fisher para muestras pequeñas. Todas las pruebas fueron de 2 caras. Las variables dicotómicas que indican la presencia y la gravedad de la EAC se modelaron en función de otros factores mediante regresión logística múltiple. La razón de posibilidades (OR) se utilizó como medida de la presencia y gravedad de la EAC en pacientes con un factor de riesgo determinado en comparación con aquellos sin ese factor o como factor multiplicativo por cada unidad de aumento en la edad o niveles de HSP70. Las covariables consideradas fueron edad, sexo masculino, tabaquismo, diabetes, hipercolesterolemia, hipertensión (factores de riesgo tradicionales de EAC), PCR sérica, proteína HSP70 y niveles de anticuerpos anti-HSP70. Todas las covariables se examinaron como predictores de la presencia y gravedad de la EAC en análisis univariados y como grupo en un modelo multivariado.

Resultados

Características de los pacientes

Se estudiaron un total de 421 sujetos, el 62% eran hombres y el 72% eran blancos, con edades comprendidas entre 30 y 82 años (media, 57,3 mediana, 57,0 años). Hubo 258 (61%) con evidencia angiográfica de EAC (≥50% de estenosis de al menos una arteria coronaria principal por angiografía coronaria). Con la excepción de la hipertensión, los factores de riesgo de EAC tradicionales (edad, sexo masculino, diabetes e hipercolesterolemia) se asociaron significativamente con el riesgo de EAC mediante análisis tanto univariados como multivariados. El tabaquismo se asoció significativamente con la EAC mediante el análisis univariante, pero no el análisis multivariado (Tabla 1).

TABLA 1. Asociación de la presencia de EAC con factores de riesgo tradicionales

Relación de la proteína HSP70 y los anticuerpos HSP70 con el riesgo de CAD

La proteína sérica HSP70 fue detectable en 283 de 421 (67%) sujetos del estudio, con niveles que variaban de 0.2 a 27.1 ng / mL (media, 1.08 mediana, 0.5 ng / mL). Los niveles de proteína HSP70 fueron más altos en pacientes sin EAC que en pacientes con EAC (mediana, 0,72 e IQR, 1,42 versus mediana, 0,34 e IQR, 1,21 ng / ml PAG= 0,001). Además, el grupo de nivel alto de HSP70 (por encima del valor mediano & gt0.5 ng / mL) contenía un 51% de pacientes con CAD, mientras que el grupo de bajo nivel de HSP70 tenía un 71% de pacientes con CAD (PAG& lt0.001). El análisis de regresión logística multivariante reveló que los individuos con niveles elevados de HSP70 tenían la mitad del riesgo de enfermedad coronaria que los individuos con niveles bajos (OR ajustado, 0,52, límite de confianza del 95% [CL], 0,32 a 0,86). La asociación de un nivel alto de HSP70 con un riesgo bajo de EAC fue independiente de los factores de riesgo de EAC tradicionales (PAG=0.011).

La Figura 1 muestra los efectos de la proteína HSP70 sobre el riesgo de CAD en cada grupo de concentración de proteína HSP70 (mostrado por el cuartil HSP70). Los individuos en el cuartil más alto de niveles de HSP70 (& gt75th) tenían un 59% menos de riesgo de enfermedad coronaria en comparación con aquellos en el cuartil más bajo (25th). Los OR con 95% de CL de riesgo de CAD asociado con una concentración de proteína HSP70 igual o mayor que los percentiles 25, 50, 75 y 90 de la distribución de control fueron 0,42 (0,26 a 0,66), 0,46 (0,28 a 0,75), 0,44 ( 0,24 a 0,79) y 0,38 (0,17 a 0,85), respectivamente. El ajuste de los factores de riesgo de CAD tradicionales no tuvo ningún impacto en la reducción del riesgo. No hubo linealidad en la relación entre la concentración de proteína HSP70 y la reducción del riesgo de EAC. A diferencia de la proteína HSP70, se detectaron anticuerpos anti-HSP70 humana en solo el 34% de los sujetos del estudio. No se encontraron diferencias en la prevalencia de seropositividad anti-HSP70 entre pacientes con CAD y sin CAD (34,2% versus 33,71%, respectivamente PAG=0.916).

Figura 1. O con 95% CL para CAD en el grupo de concentración de proteína HSP70 individual que se muestra en el cuartil HSP70.

Relación de la proteína HSP70 y los anticuerpos HSP70 con la gravedad de la CAD

También se observó una asociación similar de niveles de proteína HSP70 que caen por debajo o por encima de la mediana (& gt0,5 ng / ml) con la gravedad de la enfermedad, evaluada por el número de vasos enfermos (Figura 2). Los niveles de proteína HSP70 por encima de la mediana se relacionaron con una menor gravedad de la EAC (PAG para tendencia = 0.01). La OR ajustada de tener enfermedad multivaso para pacientes con niveles altos de HSP70 fue 0,54 (95% CL, 0,36 a 0,81 PAG= 0,003). Sin embargo, no hubo asociación entre los anticuerpos anti-HSP70 y la gravedad de la CAD (PAG=0.264).

Figura 2. Prevalencia de la gravedad de la EAC en relación con el nivel de proteína HSP70. Se definió que un paciente tenía EAC de 1, 2, 3 o ningún vaso según la documentación angiográfica de estenosis ≥ 50% de cada una de las 3 arterias coronarias principales. Se presentan datos de 395 pacientes en los que se disponía de datos sobre el número total de vasos enfermos. *PAG& lt0.01 al comparar los grupos de vasos múltiples en los grupos de HSP70 bajo versus alto usando una prueba univariante.

Relación de la proteína HSP70 y los anticuerpos HSP70 con los factores de riesgo tradicionales de CAD

La asociación de la proteína HSP70 con los factores de riesgo de EAC se presenta en la Tabla 2. Los niveles elevados de proteína HSP70 no se asociaron con el sexo masculino, el tabaquismo, la diabetes, la hipercolesterolemia o la hipertensión en los análisis univariados y multivariados (todos PAG& gt0.05). Aunque la proteína HSP70 se asoció significativamente con la edad, el nivel bajo de proteína HSP70 en pacientes con CAD fue independiente de la edad. No se encontró asociación entre la presencia de anticuerpos HSP70 y factores de riesgo de EAC (todos PAG& gt0.05, datos no mostrados).

TABLA 2. Asociación de niveles HSP70 con factores de riesgo CAD tradicionales

Relación de la proteína HSP70 y los anticuerpos de HSP70 con la inflamación

El nivel medio de PCR fue 0,84 ± 0,04 en individuos con alto nivel de proteína HSP70 y 0,90 ± 0,05 mg / dL ± EE en el grupo de proteína HSP70 baja (PAG= 0,361). El nivel medio de PCR fue 0,88 ± 0,05 en individuos con seropositividad anti-HSP70 y 0,87 ± 0,04 mg / dL ± EE en seronegatividad anti-HSP70 (PAG= 0,905). No se observó correlación entre los niveles de PCR y los niveles de proteína HSP70 o la presencia de anticuerpos HSP70 (ambos PAG& gt0.05).

Discusión

Las HSP son abundantes proteínas intracelulares, subdivididas en diferentes familias según su peso molecular. Se encuentran tanto en organismos procariotas como eucariotas y están muy conservados, y su función principal parece ser la de chaperonas, involucradas en el plegamiento y transporte de proteínas. 1,2

HSP70 es una de las PAS más estudiadas. Con estrés, HSP70 se traslada al núcleo y se asocia con nucléolos. 9,10 Comparte muchas de las funciones de la clase HSP y, además, parece proteger contra la lesión isquémica. Los estudios han demostrado que la exposición de corazones de animales aislados al estrés térmico o isquémico induce la expresión de HSP70, 11 y los estudios posteriores 12,13 mostraron que la exposición previa de todo el cuerpo al calor, que da como resultado niveles elevados de HSP70, mejora la recuperación de los corazones de animales de la isquemia. -lesión inducida. En estudios de base genética se encontraron pruebas más convincentes de un papel protector de HSP70 en la lesión inducida por isquemia. Estos han demostrado que la sobreexpresión de HSP70 en células cardíacas primarias cultivadas protege estas células contra el estrés térmico o isquémico, mientras que la sobreexpresión de HSP56 y HSP60 no tiene tal efecto protector. 14-16 Los estudios también encontraron que los corazones de ratones transgénicos que sobreexpresan HSP70 son más resistentes a la lesión isquémica. 17-20

Debido a los conocidos efectos protectores de las HSP, pero a la posibilidad de que las HSP puedan conducir a largo plazo, a través del desarrollo de autoanticuerpos, a enfermedades crónicas (como se demostró para HSP60) 1,2, se emprendió la presente investigación. Buscamos determinar si la proteína HSP70 circulante y los anticuerpos anti-HSP70 están asociados con CAD.

En nuestro estudio, la HSP70 sérica fue detectable en casi el 70% de los sujetos del estudio. Lo más interesante es que fue significativamente mayor en pacientes sin EAC que en pacientes con EAC, una asociación independiente de los factores de riesgo tradicionales. Además, la gravedad de la enfermedad, evaluada por el número de vasos enfermos, también se asoció inversamente con los niveles de HSP70. Por el contrario, los anticuerpos contra HSP70 estaban presentes en solo un tercio de los sujetos del estudio y no hubo asociación entre los anticuerpos contra HSP70 y CAD.

Los mecanismos responsables de la relación inversa entre los niveles séricos de HSP70 y CAD son, en este momento, conjeturas. Los niveles séricos elevados en sí mismos podrían ejercer importantes efectos biológicos. Por ejemplo, HSP70 administrada de forma exógena desencadena cascadas de señalización proinflamatoria mediadas en la superficie celular que conducen a la expresión de múltiples citocinas inflamatorias. 21,22 Sin embargo, se esperaría que esta actividad ejerciera efectos proateroscleróticos en lugar de antiateroscleróticos. De relevancia, las concentraciones extracelulares de HSP70 necesarias para ejercer efectos de señalización son aproximadamente 2 órdenes de magnitud más altas que las concentraciones séricas que medimos en esta investigación. Por lo tanto, creemos que las asociaciones inversas que encontramos entre los niveles séricos de HSP70 y CAD probablemente sean el resultado de los efectos intracelulares de la molécula, y los niveles séricos que medimos probablemente reflejen, de manera aproximada, los niveles intracelulares.

Los mecanismos protectores intracelulares más obvios se derivan de los efectos de las células chaperonas de acción de clase primaria de las HSP, que tienen amplios efectos sobre las proteínas intracelulares. Otras acciones podrían derivarse de esta función o podrían representar actividades independientes de HSP70. Por ejemplo, Suzuki et al 23 demostraron que HSP72 (una proteína principal en la familia HSP70) mejora la actividad de superóxido dismutasa de manganeso. Esta enzima preserva la función mitocondrial y limita la apoptosis relacionada con las mitocondrias durante la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica. Ethridge et al 24 encontraron una relación inversa entre los niveles intracelulares de HSP70 y la actividad de COX-2, una de las principales enzimas proinflamatorias. Aunque se ha demostrado que esta relación se deriva de la COX-2 que inhibe la expresión de HSP70, también se ha sugerido que esta relación recíproca es parte de un ciclo de retroalimentación negativa. Si es así, esto representa un importante efecto antiinflamatorio de HSP70. Es importante destacar que Shimizu et al 25 demostraron en ratas que HSP70 forma complejos con niveles inhibidores de κBα y atenúa la activación del factor nuclear-κB. Debido a que el factor nuclear κB en un factor de transcripción clave que modula la expresión de genes proinflamatorios, esta es otra actividad antiinflamatoria clave de HSP70.

Es interesante considerar los hallazgos dispares relacionados con la asociación con CAD de HSP60 versus HSP70. Los anticuerpos anti-HSP60 son comunes en la población y se ha demostrado que están asociados con el desarrollo de aterosclerosis. 1,26,27 También se encontró que los niveles séricos elevados de la proteína HSP60 estaban relacionados con la aterosclerosis. 3,4 Por el contrario, los anticuerpos anti-HSP70 elevados son relativamente poco frecuentes. 28,29 En este momento se desconoce por qué una HSP tiene la capacidad de provocar una respuesta autoinmune y predisponer a la EAC mientras que otra no la tiene.

También debe señalarse que Pockley et al 30 informaron, en contraste con nuestros hallazgos, que 20 pacientes con enfermedad vascular periférica y 13 con enfermedad vascular renal tenían niveles elevados de HSP70 circulante en comparación con sus controles emparejados por edad y sexo. En estos estudios, hubo un rango muy amplio de concentraciones de HSP70 (0 a 74 550 ng / mL en pacientes con enfermedad vascular periférica y 0 a 1960 ng / mL en controles). Estudiamos 421 pacientes y encontramos que la asociación entre niveles más altos de HSP70 y menor prevalencia de CAD y severidad de CAD persistió (OR ajustado, 0.52 CL 95%, 0.32 a 0.86) después del ajuste por factores de riesgo de CAD tradicionales (edad, sexo masculino, tabaquismo, diabetes, hipercolesterolemia e hipertensión). Por lo tanto, los resultados dispares entre nuestro estudio y el de Pockley et al pueden relacionarse con el tipo de paciente estudiado, el ensayo utilizado para cuantificar los niveles de HSP70 y los ajustes de datos incluidos en cada uno de los estudios. Además, Schett et al 31 encontraron que la lesión del miocardio conduce a una liberación de HSP60 y una supresión de la respuesta inmune anti-HSP65.Tales resultados sugieren que las diferencias en los niveles de anticuerpos circulantes HSP70 o HSP70 en pacientes sin CAD y CAD podrían atribuirse a una consecuencia de la formación de complejos inmunes. Tal posible mecanismo sería un tema muy digno de investigación futura.

En resumen, esta investigación proporciona la primera evidencia de que niveles altos de HSP70 humana, reflejados por niveles séricos elevados, están asociados con un riesgo bajo de CAD, presumiblemente a través de sus múltiples efectos protectores intracelulares sobre la respuesta celular al estrés. Los resultados de este estudio sugieren que el nivel sérico de la proteína HSP70 es un potente marcador de una menor susceptibilidad a la EAC y puede ser útil, junto con otros factores de riesgo actualmente reconocidos, para transmitir con mayor precisión el riesgo general de una persona para la EAC.


Otras variables

BASADO en los resultados de la visión a largo plazo, AmBisyon2040, los datos mostraron que el 79,2 por ciento de los filipinos solo quieren una vida sencilla y cómoda en 25 años. Solo el 3,9 por ciento de los filipinos quería tener la vida de los ricos.

Los indicadores de muestra de Matatag incluyen preguntar a los filipinos si pueden pasar suficiente tiempo con familiares y amigos, mientras que los de Maginhawa pueden incluir la incidencia del hambre, la diversidad de la dieta y las vacaciones, entre otros. Los indicadores de Panatag incluyen aquellos relacionados con la seguridad y la protección, incluidos los ahorros.

“Esto dará el porcentaje de quienes consideran que están disfrutando de la vida matatag, maginhawa y panatag [estable, cómoda y segura] que desean”, dijo Edillon. "Sí, esto puede responder a la pregunta sobre el debate 'decente' cuando se trata de la incidencia de la pobreza basada en FIES porque, según la encuesta de 2016, esta [AmBisyon] es la vida que queremos".

Edillon dijo que Neda ya realizó la prueba previa para la medida AmBisyon. El estudio piloto ya se llevó a cabo en todo el país, pero solo tuvo 5.000 encuestados. Dijo que era un ejercicio destinado a poner a prueba el cuestionario para que las cifras obtenidas de la encuesta no fueran definitivas.

Ella espera que con la aprobación y firma del presupuesto de 2019 el lunes, el gobierno pueda realizar la encuesta de referencia a nivel nacional para AmBisyon dentro del año. La Neda licitará el proyecto a un tercero, más probablemente una institución de investigación, para realizar la encuesta.