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8.4: Patogenicidad fúngica - Biología


Objetivos de aprendizaje

  • Nombre al menos tres factores de virulencia fúngica que promueven la colonización fúngica.
  • Nombre al menos dos factores de virulencia fúngica que dañan al huésped.

Al igual que con las bacterias, los factores de virulencia fúngica se pueden dividir en dos categorías: factores de virulencia que promueven la colonización fúngica del huésped; y factores de virulencia que dañan al huésped.

Factores de virulencia que promueven la colonización por hongos

Los factores de virulencia que promueven la colonización fúngica del huésped incluyen la capacidad de:

1. adherirse a las células huésped y resistir la remoción física;
2. invadir las células huésped;
3. competir por los nutrientes;
4. resistir las defensas inmunitarias innatas como la fagocitosis y el complemento; y
5. evadir las defensas inmunitarias adaptativas.

Ejemplos de factores de virulencia que promueven la colonización por hongos incluyen:

1. Un sistema inmunológico comprometido es el principal factor predisponente para las infecciones fúngicas graves. Una persona altamente inmunodeprimida, como una persona que toma medicamentos inmunosupresores para suprimir el rechazo de un trasplante, o una persona con infección por VIH avanzada, o una persona con otros trastornos inmunosupresores, se vuelve muy susceptible a infecciones por hongos que generalmente se consideran no muy dañinos para una persona sana con defensas normales.

2. Al igual que con las bacterias, la capacidad de adherirse a las células huésped con adhesinas de la pared celular parece influir en la virulencia de los hongos.

3. Algunos hongos producen cápsulas que les permiten resistir la absorción fagocítica, como la levadura. Cryptococcus neoformans y la forma de levadura de Histoplasma capsulatum (Figura ( PageIndex {1} )).

4. Candida albicans estimula la producción de una citocina llamada GM-CSF y esta citocina puede suprimir la producción de complemento por parte de monocitos y macrófagos. Esto puede disminuir la producción de opsonina C3b, así como las proteínas del complemento que mejoran la quimiotaxis de los fagocitos.

5. C. albicans también parece ser capaz de adquirir hierro de los glóbulos rojos.

6. albicans produce proteasas ácidas y fosfolipasas que ayudan en la penetración y daño de las membranas de la célula huésped.

7. Algunos hongos son más resistentes a la destrucción fagocítica, por ejemplo, Candida albicans, Histoplasma capsulatum, y Coccidioides immitis.

8. Existe evidencia de que cuando la forma de levadura de Candida entra en la sangre, activa genes que le permiten cambiar de su forma en ciernes a su forma hifal. Además, cuando es engullido por macrófagos, comienza a producir los tubos germinativos tubulares que penetran la membrana del macrófago provocando así su muerte.

Una pelicula de Candida matar a un macrófago desde el sitio web de Theriot Lab en la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford: Candida albicans matando macrófagos de adentro hacia afuera.

9. Factores como la temperatura corporal, el estrés osmótico, el estrés oxidativo y ciertas hormonas humanas activan una enzima histidina quinasa que regula el dimorfismo en los mohos dimórficos, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, y Coccidioides immitis, haciendo que cambien de su forma de moho avirulento a su forma de levadura virulenta. También desencadena la levadura. Candida albicans para cambiar de su forma de levadura a su forma de hifa más virulenta.

Factores de virulencia que dañan al huésped

Al igual que las bacterias, los PAMP fúngicos que se unen a los PRR pueden desencadenar una producción excesiva de citocinas que conducen a una respuesta inflamatoria dañina que daña tejidos y órganos. A medida que los hongos crecen en el cuerpo, pueden secretar enzimas para digerir las células. Estos incluyen proteasas, fosfolipasas y elastasas. En respuesta tanto al hongo como a la lesión celular, se liberan citocinas. Como se vio anteriormente en Patogenia bacteriana, esto conduce a una respuesta inflamatoria y muerte extracelular por los fagocitos que conduce a una mayor destrucción de los tejidos del huésped.

Muchos mohos secretan micotoxinas, especialmente cuando crecen en granos, nueces y frijoles. Estas toxinas pueden causar una variedad de efectos en humanos y animales si se ingieren, incluida la pérdida de coordinación muscular, pérdida de peso y temblores. Algunas micotoxinas son mutagénicas y cancerígenas. Aflatoxinas, producidas por ciertos Aspergilo especies, son especialmente cancerígenas. Un molde llamado Stachybotrys chartarum es un productor de micotoxinas que ha sido implicado como un problema potencial grave en hogares y edificios como una de las causas del "síndrome del edificio enfermo". Los síntomas de las micotoxinas en los seres humanos incluyen dermatitis, inflamación de las membranas mucosas, tos, fiebre, dolor de cabeza y fatiga.

Artículo de Medscape sobre infecciones asociadas con organismos mencionados en este objeto de aprendizaje. La inscripción para acceder a este sitio web es gratuita.

  • Candida albicans
  • Cryptococcus neoformans
  • Pneumocystis carinii
  • Infecciones dermatofíticas (tiña)
  • Coccidioides immitis
  • Histoplasma capsulatum
  • Blastomyces dermatitidis
  • Aspergilosis
  • Rhizopus
  • Alergia al moho

Resumen

Muchos de los mismos factores que permiten que las bacterias colonicen el cuerpo también permiten que los hongos colonicen. Muchos de los mismos factores que permiten que las bacterias dañen el cuerpo también permiten que los hongos causen daño.


Hongo patógeno

Los hongos patógenos enferman a las personas y a otros organismos y pueden matarlos. Para los humanos, se conocen alrededor de 300 especies patógenas de hongos. Algunos de ellos son Candida, Aspergilo, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis y Stachybotrys. Un ejemplo de Cryptococcus es Cryptococcus neoformans que causa meningitis grave en personas infectadas con el VIH o con SIDA.

La piel, el tracto gastrointestinal, el tracto respiratorio y el tracto genital-urinario son áreas del cuerpo que a menudo se infectan con hongos patógenos. Las personas con niveles más altos de monocitos / macrófagos, células T asesinas naturales invariantes (iNK) y células dendríticas tienen más posibilidades de controlar una infección por hongos y evitar que se propague por todo el cuerpo.


La imagen de arriba muestra Aspergillus terreus. Este hongo patógeno causa infecciones en los oídos, la piel, las uñas y los pulmones de personas con sistemas inmunológicos comprometidos.


Fondo

En los últimos 25 años, el patógeno humano oportunista Candida albicans se ha convertido en un problema médico grave. Este hongo ocupa ahora el cuarto lugar en la lista de infecciones adquiridas en el hospital, por delante de las bacterias gramnegativas, ya pesar de la reciente introducción de una nueva clase de antifúngicos, la resistencia a los medicamentos sigue siendo un problema [1]. En los últimos 15 años, se han aplicado técnicas moleculares para comprender la patogénesis de este organismo, así como para buscar nuevos objetivos farmacológicos. Sin embargo, C. albicans presenta varias dificultades para los biólogos moleculares: es diploide solo se ha demostrado una parte de un ciclo sexual, tiene un genoma muy plástico y es muy heterocigoto. Cada una de estas propiedades se investiga mejor a través de un enfoque genómico. Por lo tanto, el conocimiento de la secuencia del genoma ha sido un objetivo importante durante los últimos 10 años. Más recientemente, la estructura y la dinámica del genoma se han vuelto cada vez más importantes en este organismo a medida que se ha informado de la aneuploidía generalizada [2, 3], el papel del ADN repetido en la pérdida de cromosomas [4] y el reordenamiento cromosómico que conduce a la resistencia a los fármacos [5].

El Proyecto de Secuenciación del Genoma de Candida comenzó en 1996 y, en 2004, produjo un ensamblaje diploide construido a partir de una cobertura de 10,9 × (Ensamblaje 19), que proporcionó contigs únicos donde la heterocigosidad no era obvia y contigs alélicos donde había heterocigosidad significativa [6]. Hubo varios pasos importantes en el camino hacia esta versión que se detallan en una revisión de Nantel [7]. El primero fue la construcción de un mapa físico de un cromosoma, el cromosoma 7 [8]. Luego fueron las dos primeras versiones de los datos de la secuencia emergente, llamadas Ensamblaje 4 y Ensamblaje 6. Estos ensamblajes de menor densidad facilitaron una gran cantidad de análisis de genes, incluida la construcción de varios microarrays [9, 10], un análisis de genes haploinsuficientes para la filamentación [11], y la elucidación de varias familias de genes, incluidos varios importantes en la patogenia. Los ejemplos incluyen las aspartil proteinasas secretadas (SAVIAs) [12], las sustancias similares a las aglutininas (ALSs) [13], y las fosfolipasas (PLB y SOCIEDAD ANÓNIMA) [14, 15]. Actualmente se encuentran disponibles dos bibliotecas de interrupciones bastante completas. Una biblioteca se construyó sistemáticamente mediante la alteración dirigida de un alelo seguida de la inserción de un promotor regulado en el otro alelo [16]. La otra biblioteca de disrupción se construyó aleatoriamente mediante mutagénesis de transposones, utilizando como inserto en un alelo el casete UAU, que facilita la disrupción del segundo alelo a través de dos pasos de recombinación mitótica que ocurren espontáneamente [17].

Estas herramientas han avanzado enormemente el ritmo del análisis molecular de la patogenia y el estilo de vida de C. albicans, pero el Ensamblaje 19 no era una secuencia terminada, ya que contenía un total de 412 contigs, de los cuales 266 eran el conjunto haploide. Con el fin de proporcionar una secuencia completa, utilizamos la hibridación de cromosomas parcialmente purificados por electroforesis de campo de pulso, así como un mapa de sitio etiquetado de secuencia (STS) basado en una biblioteca de fosmidos para identificar la ubicación cromosómica de varios contigs. Luego utilizamos la bioinformática para analizar tanto la secuencia emergente de C. albicans cepa WO-1, la especie hermana Candida dubliniensis y las trazas primarias utilizadas para generar el Ensamblaje 4, y junto con el mapa STS y un mapa óptico de cromosomas completos para construir el Ensamblaje 21. Este ensamblaje tiene ocho secuencias de ADN lineales que incluyen nueve copias de la repetición intermedia llamada secuencia de repetición principal (MRS ), de los cuales tres han sido completamente secuenciados. El MRS se compone de tres subrepeticiones, denominadas RB2, RPS y HOK [18]. Además de las secuencias MRS intactas, hay 14 secuencias RB2 y 2 secuencias HOK. El ADN ribosómico constituye otra repetición, que no está incluida en el ensamblaje. Además de su utilidad para el mapeo de genes, Assembly 21 revela algunas características biológicas interesantes, incluida una familia de genes de factor de transcripción putativo con miembros proximales a 14 de los 16 telómeros, una secuencia similar a un telómero en el medio del cromosoma 1, información sobre las relaciones de la ubicación de los cromosomas con la similitud de las familias de genes, y una lista revisada del marco de lectura abierto (ORF).


Introducción

Las infecciones fúngicas invasivas (IFI) son causadas por hongos oportunistas como los filamentosos. Aspergillus fumigatus o las levaduras Candida albicans y Cryptococcus neoformans (Enoch et al., 2006). Aunque no suele ser una preocupación en las personas sanas, las IFI pueden afectar gravemente a los pacientes enfermos o inmunodeprimidos, incluidos los individuos con leucemia, los receptores de trasplantes y los que tienen VIH / SIDA (Comely et al., 2015 de Oliveira et al., 2014 Klingspor et al. al., 2015 Neofytos et al., 2013).

La incidencia de las IFI está aumentando y una gran proporción de estas IFI son nosocomiales (Beck-Sagué y Jarvis, 1993 Lehrnbecher et al., 2010). Se cree que esto se debe a un aumento en la población de individuos inmunodeprimidos (Lehrnbecher et al., 2010 Warnock, 2007). Las IFI tienden a tener altas tasas de mortalidad (Comely et al., 2015 Lehrnbecher et al., 2010) y, como resultado, la mejora de los tratamientos profilácticos y curativos actuales es de creciente interés. Es esencial que comprendamos las interacciones biológicas fundamentales y dinámicas entre el huésped y las células fúngicas para avanzar en la atención y el tratamiento de los pacientes con IFI.

La patogenia requiere una interacción entre un patógeno y su huésped. Existen numerosos ejemplos de interacciones huésped-hongos en el contexto de organismos que causan IFI. Aspergillus fumigatus se ha demostrado que se adhiere a la matriz extracelular del pulmón, así como a la superficie de las células epiteliales del pulmón humano (Gil et al., 1996, Sheppard, 2011). Además, la internalización de A. fumigatus esporas por células epiteliales in vitro se ha observado en numerosas ocasiones (Gomez et al., 2010 Oosthuizen et al., 2011 Wasylnka y Moore, 2003).

Candida albicans Se ha observado que invade las células hospedadoras induciendo endocitosis (Dalle et al., 2010) o mediante la invasión activa, un proceso mediante el cual las hifas rompen las membranas de las células epiteliales (Dalle et al., 2010, Wächtler et al., 2011). Se ha demostrado que C. neoformans infecta a su huésped a través de un mecanismo de internalización dependiente de actina (Guerra et al., 2014). Estas interacciones iniciales a menudo conducen a otras interacciones entre el huésped y el hongo en numerosos niveles. Las redes de interacción huésped-hongos son extremadamente complejas, ya que existen muchas diferencias inherentes entre las células de los mamíferos y las células de los hongos. Un análisis exhaustivo de estas redes implicaría el uso de técnicas de "ómicas" para capturar las perturbaciones biológicas dinámicas tanto drásticas como sutiles tanto en el hospedador como en el patógeno.

El estudio de varias "ómicas" biológicas generalmente se segrega en varios campos principales de la biología de alto rendimiento, en particular, genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica. Un análisis económico ideal de un organismo implica la recopilación de conjuntos de datos completos e imparciales representativos de todo el conjunto de biomoléculas de interés. Las técnicas que no seleccionan objetivos específicos o candidatos son de particular valor, ya que permiten la identificación de nuevas redes biológicas sin conocimiento previo. El uso de técnicas de alto rendimiento como estas se ha vuelto mucho más común recientemente, ya que pueden proporcionar una imagen más completa de las complejidades de las respuestas de un organismo o una célula a las condiciones experimentales o ambientales. Las técnicas cuantitativas más prevalentes, como las transferencias Western y la PCR cuantitativa de transcripción inversa, solo pueden analizar objetivos específicos y, por lo tanto, no pueden detectar cambios inesperados.

Históricamente, la biología de alto rendimiento se ha asociado con un costo monetario prohibitivo, lo que hace que muchas de estas técnicas sean inaccesibles para la mayoría de los investigadores. A pesar de esto, la biología de alto rendimiento tiene un potencial innegable para el análisis sistemático de un sistema biológico complejo, como una interacción huésped-patógeno (Fig. 1). La aceptación por parte de los investigadores se ha visto favorecida por un aumento en la asequibilidad de varias técnicas biológicas de alto rendimiento en los últimos años. Un ejemplo notable es el precio de la secuenciación comercial del genoma, con la secuenciación completa de un genoma humano ahora tan bajo como US $ 1000 (Veritas Genomics, 2015).

HIGO. 1. Biología de sistemas de interacciones entre organismos duales. Se analiza un sistema huésped-patógeno experimental definido utilizando métodos de alto rendimiento. Los datos recopilados se someten a análisis estadístico computacional y los resultados se analizan utilizando una serie de tecnologías bioinformáticas. El análisis de datos produce un modelo para la interacción biológica. La replicación da como resultado un modelo robusto y validado para el sistema biológico. Este modelo validado se utiliza luego para determinar aspectos del sistema que requieren más estudio y perfeccionamiento.

Hay revisiones anteriores sobre temas relacionados con la interacción huésped-hongos (Durmuş et al., 2015 Horn et al., 2012 Santamaría et al., 2011), y nuestra revisión se basa en estos al delinear e integrar métodos tanto experimentales como computacionales en biología de alto rendimiento. Hacemos especial hincapié en las innovaciones tecnológicas recientes que prometen aportar información valiosa sobre el campo relativamente limitado de las interacciones huésped-hongos.


Identificación y patogenicidad de hongos patógenos asociados con la pudrición del extremo del tallo de los frutos del aguacate en Kenia

Se han reportado pérdidas asociadas con la pudrición del extremo del tallo (SER) de frutos de aguacate en todas las regiones productoras de aguacate del mundo. En Kenia, los frutos de aguacate maduros presentan síntomas de SER durante el almacenamiento y la comercialización, pero no se ha establecido el agente causal de la enfermedad. Este estudio tuvo como objetivo identificar los patógenos fúngicos asociados con el SER de aguacate en Kenia y evaluar su patogenicidad. Se recolectaron aislados de hongos de frutos de aguacate sintomáticos de huertos seleccionados al azar y de los principales mercados dentro del condado de Murang'a, una importante región productora de aguacate en Kenia, entre septiembre de 2017 y marzo de 2018. Un total de 207 y 125 aislados de hongos, recuperados de huertos y principales Los mercados, respectivamente, se identificaron morfológicamente y se confirmaron mediante técnicas moleculares. Los aislamientos identificados fueron Lasiodiplodia theobromae (39.8%), Neofusicoccum parvum (24.4%), Nectria pseudotrichia (18.4%), Fusarium solani (7.2%), F. oxysporum (5.1%), F. equiseti (3,9%), y Geotricum candidum (1.2%). Geotricum candidum se recuperó exclusivamente de frutas del mercado. En la prueba de patogenicidad, L. theobromae, N. parvum, y N. pseudotrichia causó los síntomas de SER más graves. En consecuencia, se consideró que eran los principales patógenos de SER de frutos de aguacate en Kenia. Hasta donde sabemos, este es el primer informe del patógeno SER de frutos de aguacate en Kenia. Dada la importante contribución de los frutos de aguacate a los ingresos de los hogares y las divisas en Kenia, esta información es importante para desarrollar aún más las estrategias de gestión de la pérdida poscosecha de frutos de aguacate en Kenia.

1. Introducción

En Kenia, el aguacate (Persea americana Mill.) Es uno de los cultivos de frutas tropicales perennes más importantes y una de las principales fuentes de divisas. En 2017, representó alrededor del 74% en valor del total de frutas exportadas desde el país [1]. Actualmente, el aguacate “Hass” aporta aproximadamente el 80% de los frutos de aguacate producidos y exportados desde Kenia [2]. Otros cultivares producidos incluyen “Fuerte”, “Puebla”, “Duke” y “G6” [3]. La producción de aguacate en Kenia está dominada por pequeños agricultores (85%) dentro de varias zonas agroecológicas, que producen principalmente para el mercado de exportación, y el resto se vende en los mercados locales. El setenta por ciento (70%) de los frutos de aguacate se producen en las regiones central y oriental del país. Los frutos se exportan principalmente a la Unión Europea [2, 4]. Desde el año 2000, la superficie cultivada con aguacate ha aumentado significativamente, lo que ha llevado a un aumento de las exportaciones de aguacate de Kenia [4]. El aumento de la producción está impulsado por la alta demanda de frutas de aguacate en el mercado mundial debido a la conciencia de los consumidores sobre el valor dietético de la fruta [5]. A pesar del aumento de la producción y exportación de frutos de aguacate de Kenia, la alta incidencia de enfermedades fúngicas poscosecha, incluidas la antracnosis y la SER, limitan la comercialización de los frutos y contribuyen a aumentar las pérdidas de los productores [6, 7].

Los síntomas de la pudrición del extremo del tallo (SER) se desarrollan en la fruta del aguacate a medida que madura. Se caracteriza por un marchitamiento, seguido de una pudrición de color marrón a negro que comienza en el extremo del tallo de la fruta. A medida que avanza la pudrición, los haces vasculares internos pueden tener coloraciones de negro a marrón y eventualmente toda la fruta es consumida por la pudrición [8, 9]. Las frutas apenas presentan síntomas de SER antes de la cosecha. Además, el SER suele ocurrir en la planta de empaque durante el tránsito o después de la comercialización.

Se ha informado que varias especies de hongos causan SER en frutos de aguacate. En Chile, los patógenos fúngicos notificados como causantes de SER incluyeron miembros de la familia Botryosphaeriaceae, a saber Diplodia mutila, D. pseudoseriata, D. seriata, Dothiorella iberica, Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum australe, norte. nonquaesitum, y norte. parvum [10]. En Italia, norte. parvum, Colletotrichum gloeosporioides, o C. fructicola y Diaporthe foeniculacea o D. sterilis fueron los patógenos SER más aislados [9]. En California, Neofusicoccum luteum y Phomopsis perseae fueron reportados [8] mientras estaban en Sudáfrica, Thyronectria pseudotrichia, Dothiorella aromatica, Pestalotiopsis versicolor, Lasiodiplodia theobromae, Rhizopus stolonifer, Fusarium sambucinum, y Fusarium solani se informaron [11].

En Kenia, sin embargo, no se ha identificado el patógeno real que causa SER, pero por otro lado, se han descrito patógenos de antracnosis [12]. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo identificar el patógeno fúngico asociado con SER de frutos de aguacate en las tierras altas centrales de Kenia y probar su patogenicidad.

2. Materiales y métodos

2.1. Área de estudio y recolección de muestras

El estudio se llevó a cabo en el condado de Murang'a, que es el condado líder en producción y exportación de frutos de aguacate en Kenia [1]. Geográficamente, la provincia se encuentra entre las latitudes 0 ° 34 ′ sur y 1 ° 07 ′ sur y las longitudes 36 ° este y 37 ° 27 ′ este, con una elevación de 914 m s.n.m. en el este y 3353 m.s.n.m. en el oeste. Los frutos de aguacate se cultivan en las zonas agroecológicas dos, tres y cuatro que tienen rangos de temperatura promedio de 18.0 ° C a 27.2 ° C y una precipitación anual promedio de 1600 mm a 900 mm [13].

Entre septiembre de 2017 y marzo de 2018, se utilizó un muestreo sistemático para seleccionar 162 huertos incluidos en el estudio. Los huertos tenían más de cinco árboles frutales de aguacate “Hass”. Se recolectaron seis frutos de aguacate maduros al azar de cada cinco árboles frutales de aguacate seleccionados al azar en cada huerto muestreado. Además, se compraron 10 frutas "Hass", en diferentes etapas de maduración, a diferentes comerciantes en tres mercados principales (Kandara, Kirwara y Maragwa) dentro del condado a intervalos semanales durante dos meses. Se tomaron muestras de un total de 453 frutas de 4.860 frutas recolectadas en los huertos y 240 frutas del mercado, se empacaron en cajas de cartón y se transportaron a la Organización de Investigación Agrícola y Ganadera de Kenia (KALRO), Kandara, donde se incubaron a temperatura ambiente (22 ° C). C – 25 ° C) durante 7–14 días para permitir el desarrollo de SER.

2.2. Aislamiento de hongos

Las 207 frutas de los huertos y las 125 frutas del mercado que mostraron síntomas de SER se lavaron con agua del grifo limpia, se esterilizaron en la superficie con hipoclorito de sodio al 2% durante un minuto, se enjuagaron con agua destilada y se secaron al aire. Se colocaron asépticamente pequeños trozos de carne de los márgenes de la carne sintomática en placas Petri de 9 cm de diámetro que contenían agar papa dextrosa (PDA) modificado con sulfato de estreptomicina y se incubaron a temperatura ambiente (22 ° C-25 ° C) durante cinco días. Se obtuvieron cultivos puros transfiriendo las puntas de micelio en agar agua (WA) al 1,5% (peso / volumen) y se dejaron crecer durante la noche. Las puntas hifales del crecimiento de micelio en el WA se transfirieron posteriormente a PDA modificado con sulfato de estreptomicina. El frasco universal inclinado se utilizó para conservar los cultivos puros del patógeno y se almacenó en el frigorífico a 4 ° C para su uso posterior.

2.2.1. Preparación de la suspensión de conidios

Se inundaron cultivos puros de catorce días en PDA con agua destilada estéril. Se utilizó un asa de alambre estéril para raspar los conidios y ponerlos en suspensión. La suspensión se filtró a través de una tela de muselina de doble capa y el filtrado recogido se diluyó en serie a 1 x 105. Se utilizó un hemocitómetro para ajustar la concentración de esporas.

2.3. Caracterización morfológica del aislado

Para inducir la producción de conidios, se transfirieron pequeños trozos de micelio de los aislados a placas de Petri de 9 cm de diámetro con PDA modificado con astillas de madera de aguacate esterilizadas en autoclave y se incubaron a 25 ± 1 ° C durante cuatro semanas. Los aislamientos se identificaron morfológicamente en función de las características culturales y microscópicas descritas por Valencia et al. [10], Phillips y col. [14] y Watanabe [15]. Se utilizó azul de lactofenol en la identificación microscópica. La longitud y el ancho de los conidios (norte = 50) de cada aislamiento se midieron usando un microscopio óptico Zeiss-Primo Star, acoplado a una cámara AxioCam ERc 5s.

2.4. Caracteristicas moleculares
2.4.1. Extracción de ADN

Un protocolo mejorado de extracción de hongos descrito por Innis et al. [16] se utilizó para extraer ADN de tres aislados representativos de cada especie. Se utilizaron cultivos de hongos puros derivados de las esporas individuales incubadas en PDA. Se colocaron cuarenta miligramos (mg) de micelio en un tubo de microcentrífuga que contenía 300 μl de tampón de extracción (Tris-HCl, 200 mM Ph 8.5 EDTA, 25 mM 1 M NaCl 250 mM SDS, 0.5%) con perlas de vidrio. Los tubos se colocaron en una trituradora de agua fastprep®-24 durante un minuto a 2000 rpm. Doscientos microlitrosμSe añadió 1) de acetato de sodio 3 mM pH 5,2 y se refrigeró a -20ºC durante 10 minutos. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 13000 rpm. Después de eso, los sobrenadantes se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml nuevos. Se añadieron cantidades iguales de isopropanol a los sobrenadantes y se dejaron reposar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 13000 rpm y se descartó el sobrenadante. Quinientos μA continuación, se añadió 1 l de etanol al 70% a los sedimentos y se centrifugó a 13000 rpm durante 10 minutos para lavar el sedimento. Los gránulos de ácido nucleico obtenidos se secaron al aire y luego se resuspendieron en 50 μl de tampón TE bajo en sal (Tris-HCl, 1 mM, pH 8 EDTA, 0,1 mM) y se almacena a -20 ° C para su uso posterior. La calidad del ADN se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa y se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000S. El ADN se estandarizó o normalizó a 20 ng /μl para reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).

2.4.2. Amplificación y secuenciación de ADN

El ADN extraído se utilizó como plantillas en PCR. Dos juegos de cebadores, ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) y ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC), ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) e ITS1, se utilizaron en la amplificación de la región transcrita interna del ADNr de los aislados de hongos [16]. Volúmenes de reacción de PCR de 25 μl que contiene 2.5 μl de 0,2 μΜ de cada cebador, 5 × tampón de reacción My Taq, 0,25 μl Taq polimerasa (Bioline, Meridian Life Science, Memphis, EE. UU.), 40 ng /μl de cada plantilla de ADN y 12,75 μSe utilizaron l de agua molecular. Para la amplificación, se utilizó el ciclador térmico de ADN GeneAmp 9700 (Perkin-Elmer). El proceso implicó un paso de desnaturalización inicial a 94 ° C durante 30 s, seguido de 35 ciclos, desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, recocido a 55 ° C durante 30 s seguido de extensión durante 1 minuto a 68 ° C, y un paso de extensión final de 5 min a 68 ° C. Para confirmar la amplificación, los productos de PCR se procesaron en gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron bajo luz ultravioleta usando ENDURO ™ GDS. Los productos de PCR se limpiaron utilizando el kit de limpieza de PCR de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se enviaron para la secuenciación de Sanger con cebadores directos e inversos en la plataforma Inqaba Africa Genomic, Sudáfrica.

2.4.3. Análisis bioinformático

Los datos de la secuencia se analizaron asignando lecturas a muestras, índices, cebadores y adaptadores. Los cebadores se marcaron con Picard (https://broadinstitute.github.io/picard/index.html). Se utilizó Bam2fastq (https://gsl.hudsonalpha.org/information/software/bam2fastq) para convertir los archivos bam resultantes a fastq. La calidad de secuenciación general de las lecturas se evaluó visualmente utilizando el programa Fast QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Los parámetros de calidad utilizados en el filtrado de las lecturas incluyeron una longitud mínima de 250 pb y un valor de CC mínimo de 30. Se realizó el recorte correspondiente a los adaptadores y secuencias de baja calidad de todas las lecturas. El posterior análisis y procesamiento de las lecturas se realizó en el CLC Genomic Workbench 11.0, donde se fusionaron las lecturas superpuestas. El ensamblaje de novo de las lecturas sin ensamblar y la alineación de las lecturas sin procesar se realizó utilizando CLC Genomics Workbench 11.0 con parámetros predeterminados (contig mínimo = 100 pb, 23 K-mer, fracción de similitud = 80% y fracción de longitud = 50%). Se realizó un análisis BLAST de las secuencias ITS para respaldar la identificación morfológica de las muestras en la base de datos del NCBI. Las secuencias ITS se depositaron en GeneBank utilizando BankIT.

2.5. Prueba de patogenicidad

Para establecer los postulados de Koch, Geotrichum candidum, Fusarium equiseti, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum parvum, y Nectria pseudotrichia se sometieron a la prueba de patogenicidad descrita por Freeman et al. [17] y Twizeyimana et al. [8]. Se recolectaron frutas saludables “Hass” de las granjas que se sabe tienen una baja incidencia de SER en el condado de Murang'a. Los frutos se lavaron con agua limpia del grifo para eliminar los restos de tierra. Las frutas se esterilizaron en la superficie sumergiéndolas en etanol al 75% durante aproximadamente tres minutos, se enjuagaron con agua destilada y luego se secaron al aire. Cada uno de los aislados se sometió a dos métodos de inoculación.

Se utilizó un barrenador de corcho estéril (5 mm de diámetro) para enrollar el extremo del tallo de cada fruto y se colocaron sobre la herida discos miceliales de diámetro equivalente obtenidos del borde de cultivos puros en crecimiento activo. Se colocaron seis frutos inoculados para cada patógeno y seis frutos de control inoculados con PDA simple en bandejas individuales y se cubrieron con film transparente para conservar la humedad y evitar la contaminación. Los frutos se incubaron a temperatura ambiente de 24 ° C ± 1.

Después de romper el pedicelo de los frutos secados al aire, se colocó una suspensión de conidios (5 x 10 −5 conidiales / ml) en la abertura del extremo del tallo y se cubrió con una película adhesiva. Seis frutos inoculados por cada patógeno y seis frutos control inoculados con agua destilada se dispusieron en bandejas individuales y se cubrieron con film transparente. Los frutos inoculados se incubaron a 24 ± 1 ° C. La evaluación se realizó después de 12 días cortando los frutos longitudinalmente y calificando los síntomas de SER en una escala de calificación de 0 a 4 de la siguiente manera: 0 = sin pudrición visible 1 = 1 a 25% de pudrición 2 = 25 a 50% de pudrición 3 = 50 a 75% putrefacción 4 = ≥75% de pudrición (Figura 1). Al final de la prueba de patogenicidad, se realizó un reaislamiento de los frutos sintomáticos y las colonias de hongos reaislados se compararon morfológicamente con los aislamientos originales [8, 9]. La gravedad del SER en frutos de aguacate se calculó mediante la siguiente fórmula [18]:


8.4: Patogenicidad fúngica - Biología

Desde el deterioro de cultivos y alimentos hasta infecciones graves en especies animales, los parásitos y patógenos fúngicos están muy extendidos y son difíciles de tratar.

Objetivos de aprendizaje

Dar ejemplos de hongos que son parásitos y patógenos de plantas y animales.

Conclusiones clave

Puntos clave

  • En las plantas, los hongos pueden destruir el tejido vegetal directamente o mediante la producción de potentes toxinas, que generalmente terminan en la muerte del huésped e incluso pueden provocar ergotismo en animales como los humanos.
  • Durante la micosis, los hongos, como los dermatofitos, atacan con éxito a los huéspedes directamente colonizando y destruyendo sus tejidos.
  • Ejemplos de hongos parásitos y patógenos en animales que causan micosis incluyen Batrachochytrium dendrobatidis, Geomyces destructans, y Histoplasma capsulatum.
  • Las micosis sistémicas, como la fiebre del valle, la histoplasmosis o la enfermedad pulmonar, son enfermedades fúngicas que se propagan a los órganos internos y comúnmente ingresan al cuerpo a través del sistema respiratorio.
  • Las micosis oportunistas, infecciones fúngicas que son comunes en todos los entornos, se aprovechan principalmente de las personas que tienen un sistema inmunológico comprometido, como los pacientes con SIDA.
  • Los hongos también pueden causar micetismo, una enfermedad causada por la ingestión de hongos tóxicos que conduce al envenenamiento.

Términos clave

  • micosis: una enfermedad fúngica causada por infección y daño directo
  • dermatofito: un hongo parásito que secreta enzimas extracelulares que descomponen la queratina, causando infecciones en la piel, como la tiña inguinal y el pie de atleta.
  • aflatoxina: compuestos tóxicos y cancerígenos liberados por hongos del género Aspergillus contaminan las cosechas de frutos secos y cereales
  • cornezuelo: cualquier hongo del género Claviceps que sea parásito de las gramíneas

Patógenos y parásitos fúngicos

La producción de suficientes cultivos de buena calidad es esencial para la existencia humana. Las enfermedades de las plantas han arruinado los cultivos y han provocado una hambruna generalizada. Muchos patógenos de las plantas son hongos que causan la descomposición de los tejidos y, finalmente, la muerte del huésped. Además de destruir directamente el tejido vegetal, algunos patógenos vegetales estropean los cultivos al producir potentes toxinas. Los hongos también son responsables del deterioro de los alimentos y la pudrición de los cultivos almacenados. Por ejemplo, el hongo Claviceps purpurea causa el cornezuelo de centeno, una enfermedad de los cultivos de cereales (especialmente del centeno). Aunque el hongo reduce el rendimiento de cereales, los efectos de las toxinas alcaloides del cornezuelo del centeno en humanos y animales son de mucha mayor importancia. En los animales, la enfermedad se conoce como ergotismo. Los signos y síntomas más comunes son convulsiones, alucinaciones, gangrena y pérdida de leche en el ganado. El ingrediente activo del cornezuelo de centeno es el ácido lisérgico, que es un precursor de la droga LSD. El tizón, las royas y el mildiú polvoriento o velloso son otros ejemplos de hongos patógenos comunes que afectan los cultivos.

Patógenos fúngicos: Algunos patógenos fúngicos incluyen (a) el moho verde en la toronja, (b) el mildiú polvoriento en un zinnia, (c) la roya del tallo en una gavilla de cebada y (d) la podredumbre gris en las uvas.

Las aflatoxinas son compuestos tóxicos y cancerígenos liberados por hongos del género Aspergilo. Periódicamente, las cosechas de frutos secos y cereales están contaminadas por aflatoxinas, lo que provoca una retirada masiva de productos. Esto a veces arruina a los productores y provoca escasez de alimentos en los países en desarrollo.

Parásitos y patógenos animales y humanos

Los hongos pueden afectar a los animales, incluidos los humanos, de varias formas. Una micosis es una enfermedad fúngica que resulta de una infección y un daño directo. Los hongos atacan a los animales directamente colonizando y destruyendo tejidos. La micotoxicosis es el envenenamiento de los seres humanos (y otros animales) por alimentos contaminados por toxinas fúngicas (micotoxinas). Mycetismus describe la ingestión de toxinas preformadas en hongos venenosos. Además, las personas que muestran hipersensibilidad a los mohos y las esporas desarrollan reacciones alérgicas fuertes y peligrosas. Las infecciones por hongos son generalmente muy difíciles de tratar porque, a diferencia de las bacterias, los hongos son eucariotas. Los antibióticos solo se dirigen a las células procariotas, mientras que los compuestos que matan a los hongos también dañan al huésped animal eucariota.

Muchas infecciones por hongos son superficiales, es decir, ocurren en la piel del animal. Llamadas micosis cutáneas (& # 8220skin & # 8221), pueden tener efectos devastadores. Por ejemplo, la disminución de la población mundial de ranas en los últimos años puede ser causada por el hongo. Batrachochytrium dendrobatidis, que infecta la piel de las ranas y presumiblemente interfiere con el intercambio gaseoso. De manera similar, más de un millón de murciélagos en los Estados Unidos han muerto por el síndrome de la nariz blanca, que aparece como un anillo blanco alrededor de la boca del murciélago. Es causada por el hongo amante del frío. Geomyces destructans, que disemina sus esporas mortales en cuevas donde hibernan los murciélagos. Los micólogos están investigando la transmisión, el mecanismo y el control de G. destructans para detener su propagación.

Los hongos que causan las micosis superficiales de la epidermis, el cabello y las uñas rara vez se diseminan al tejido subyacente. Estos hongos a menudo se denominan erróneamente & # 8220dermatofitos & # 8221, de las palabras griegas dermis que significa piel y phyte que significa planta, aunque no son plantas. Los dermatofitos también se denominan & # 8220ringworms & # 8221 debido al anillo rojo que provocan en la piel. Secretan enzimas extracelulares que descomponen la queratina (una proteína que se encuentra en el cabello, la piel y las uñas), causando afecciones como el pie de atleta y la tiña inguinal. Estas afecciones generalmente se tratan con cremas y polvos tópicos de venta libre que se eliminan fácilmente. Las micosis superficiales más persistentes pueden requerir medicamentos orales recetados.

Infección por micosis: (a) La tiña se presenta como un anillo rojo en la piel (b) Trichophyton violaceum, que se muestra en esta micrografía de luz de campo brillante, causa micosis superficiales en el cuero cabelludo (c) Histoplasma capsulatum es un ascomiceto que infecta las vías respiratorias y causa síntomas similares a los de la influenza.

Las micosis sistémicas se diseminan a los órganos internos, más comúnmente ingresan al cuerpo a través del sistema respiratorio. Por ejemplo, la coccidioidomicosis (fiebre del valle) se encuentra comúnmente en el suroeste de los Estados Unidos, donde el hongo reside en el polvo. Una vez inhaladas, las esporas se desarrollan en los pulmones y provocan síntomas similares a los de la tuberculosis. La histoplasmosis es causada por el hongo dimórfico. Histoplasma capsulatum. También provoca infecciones pulmonares. En casos más raros, causa inflamación de las membranas del cerebro y la médula espinal. El tratamiento de estas y muchas otras enfermedades fúngicas requiere el uso de medicamentos antimicóticos que tienen efectos secundarios graves.

Las micosis oportunistas son infecciones fúngicas que son comunes en todos los entornos o forman parte de la biota normal. Afectan principalmente a personas que tienen un sistema inmunológico comprometido. Los pacientes en las últimas etapas del SIDA padecen micosis oportunistas que pueden poner en peligro la vida. La levadura Candida sp., un miembro común de la biota natural, puede crecer sin control e infectar la vagina o la boca (aftas bucales) si se altera el pH del entorno circundante, las defensas inmunitarias de la persona o la población normal de bacterias.

El micetismo puede ocurrir cuando se comen hongos venenosos. Causa una serie de muertes humanas durante la temporada de recolección de hongos. Muchos cuerpos fructíferos comestibles de hongos se parecen a parientes altamente venenosos. Se advierte a los cazadores de hongos aficionados que inspeccionen cuidadosamente su cosecha y eviten comer hongos de origen dudoso.


Contenido

El control de las enfermedades de las plantas es fundamental para la producción confiable de alimentos y presenta problemas importantes en el uso agrícola de la tierra, el agua, el combustible y otros insumos.Las plantas tanto en poblaciones naturales como cultivadas tienen una resistencia inherente a las enfermedades, pero hay numerosos ejemplos de impactos devastadores de enfermedades de las plantas como la Gran Hambruna de Irlanda y el tizón del castaño, así como enfermedades de las plantas graves y recurrentes como el tizón del arroz, el nematodo del quiste de la soja y los cítricos. llaga gangrenosa.

Sin embargo, el control de enfermedades tiene un éxito razonable en la mayoría de los cultivos. El control de enfermedades se logra mediante el uso de plantas que han sido cultivadas para una buena resistencia a muchas enfermedades y mediante enfoques de cultivo de plantas como la rotación de cultivos, el uso de semillas libres de patógenos, la fecha de siembra y la densidad de plantas adecuadas, el control de la humedad del campo y el pesticida. usar. Se necesitan avances continuos en la ciencia de la fitopatología para mejorar el control de enfermedades y mantenerse al día con los cambios en la presión de las enfermedades causados ​​por la evolución y el movimiento en curso de los patógenos de las plantas y por los cambios en las prácticas agrícolas.

Las enfermedades de las plantas provocan importantes pérdidas económicas para los agricultores de todo el mundo. En grandes regiones y muchas especies de cultivos, se estima que las enfermedades suelen reducir el rendimiento de las plantas en un 10% cada año en entornos más desarrollados, pero la pérdida de rendimiento por enfermedades a menudo supera el 20% en entornos menos desarrollados. La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación estima que las plagas y enfermedades son responsables de aproximadamente el 25% de la pérdida de cultivos. Para resolver esto, se necesitan nuevos métodos para detectar enfermedades y plagas de manera temprana, como sensores novedosos que detectan los olores de las plantas y la espectroscopia y biofotónica que son capaces de diagnosticar la salud y el metabolismo de las plantas. [2]

En la mayoría de los patosistemas, la virulencia depende de las hidrolasas, y de la clase más amplia de proteínas que degradan la pared celular, que degradan la pared celular. La gran mayoría de los CWDP son producidos por patógenos y dirigidos a pectinas (por ejemplo, pectinesterasa, pectato liasa y pectinasas). Para los microbios, los polisacáridos de la pared celular son en sí mismos una fuente de alimento, pero principalmente una barrera a superar.

Muchos patógenos también crecen de manera oportunista cuando el huésped rompe sus propias paredes celulares, con mayor frecuencia durante la maduración de la fruta. [3]

Hongos Editar

La mayoría de los hongos fitopatógenos pertenecen a los ascomicetos y basidiomicetos. Los hongos se reproducen tanto sexual como asexualmente a través de la producción de esporas y otras estructuras. Las esporas pueden esparcirse a grandes distancias por el aire o el agua, o pueden transmitirse por el suelo. Muchos hongos que habitan el suelo son capaces de vivir saprotroficamente, llevando a cabo parte de su ciclo de vida en el suelo. Estos son saprótrofos facultativos. Las enfermedades fúngicas se pueden controlar mediante el uso de fungicidas y otras prácticas agrícolas. Sin embargo, a menudo se desarrollan nuevas razas de hongos que son resistentes a varios fungicidas. Los hongos patógenos biotróficos colonizan el tejido vegetal vivo y obtienen nutrientes de las células hospedadoras vivas. Los hongos patógenos necrotróficos infectan y matan el tejido del huésped y extraen nutrientes de las células muertas del huésped. Los patógenos fúngicos importantes de las plantas incluyen: [ cita necesaria ]

Ascomycetes Editar

  • Fusarium spp. (Enfermedad del marchitamiento por Fusarium)
  • Thielaviopsis spp. (podredumbre del afta, podredumbre negra de la raíz, Thielaviopsis raíz podrida)
  • Verticillium spp.
  • Magnaporthe grisea (explosión de arroz)
  • Sclerotinia sclerotiorum (podredumbre algodonosa)

Basidiomicetos Editar

  • Ustilago spp. (obscenidades) obscenidades de cebada
  • Rhizoctonia spp.
  • Phakospora pachyrhizi (roya de la soja)
  • Puccinia spp. (oxidaciones severas de cereales y pastos)
  • Armillaria spp. (especies de hongos de la miel, patógenos virulentos de los árboles)

Organismos similares a hongos Editar

Oomycetes Editar

Los oomicetos son organismos parecidos a hongos. [4] Incluyen algunos de los patógenos vegetales más destructivos, incluido el género Phytophthora, que incluye los agentes causales del tizón tardío de la papa [4] y la muerte súbita del roble. [5] [6] Especies particulares de oomicetos son responsables de la pudrición de la raíz.

A pesar de no estar estrechamente relacionados con los hongos, los oomicetos han desarrollado estrategias de infección similares. Los oomicetos son capaces de utilizar proteínas efectoras para desactivar las defensas de una planta en su proceso de infección. [7] Los fitopatólogos comúnmente los agrupan con patógenos fúngicos.

Los patógenos de plantas de oomicetos importantes incluyen:

Phytomyxea Editar

Algunos hongos limosos en Phytomyxea causan enfermedades importantes, incluida la raíz del club en el repollo y sus parientes y la costra polvorienta en las papas. Estos son causados ​​por especies de Plasmodiophora y Spongospora, respectivamente.

Bacterias Editar

La mayoría de las bacterias asociadas con las plantas son en realidad saprótrofas y no dañan la planta en sí. Sin embargo, una pequeña cantidad, alrededor de 100 especies conocidas, pueden causar enfermedades. [8] Las enfermedades bacterianas son mucho más frecuentes en las regiones tropicales y subtropicales del mundo.

La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de varilla (bacilos). Para poder colonizar la planta tienen factores de patogenicidad específicos. Se conocen cinco tipos principales de factores de patogenicidad bacteriana: usos de enzimas que degradan la pared celular, toxinas, proteínas efectoras, fitohormonas y exopolisacáridos.

Patógenos como Erwinia las especies usan enzimas que degradan la pared celular para causar podredumbre blanda. Agrobacterium Las especies cambian el nivel de auxinas para causar tumores con fitohormonas. Los exopolisacáridos son producidos por bacterias y bloquean los vasos del xilema, lo que a menudo conduce a la muerte de la planta.

Las bacterias controlan la producción de factores de patogenicidad mediante la detección de quórum.

Patógenos vegetales bacterianos importantes:

Fitoplasmas y espiroplasmas Editar

Fitoplasma y Espiroplasma son géneros de bacterias que carecen de paredes celulares y están relacionados con los micoplasmas, que son patógenos humanos. Juntos se conocen como mollicutes. También tienden a tener genomas más pequeños que la mayoría de las otras bacterias. Normalmente son transmitidos por insectos chupadores de savia, que se transfieren al floema de la planta donde se reproduce.

Virus, viroides y organismos similares a virus Editar

Hay muchos tipos de virus de plantas y algunos incluso son asintomáticos. En circunstancias normales, los virus de las plantas solo causan una pérdida de rendimiento de los cultivos. Por tanto, no es económicamente viable intentar controlarlos, salvo cuando infectan especies perennes, como árboles frutales.

La mayoría de los virus vegetales tienen genomas pequeños de ARN monocatenario. Sin embargo, algunos virus de plantas también tienen ARN bicatenario o genomas de ADN mono o bicatenario. Estos genomas pueden codificar solo tres o cuatro proteínas: una replicasa, una proteína de cubierta, una proteína de movimiento, para permitir el movimiento de célula a célula a través de plasmodesmos y, a veces, una proteína que permite la transmisión por un vector. Los virus vegetales pueden tener varias proteínas más y emplear muchos métodos de traducción molecular diferentes.

Los virus de las plantas generalmente se transmiten de una planta a otra mediante un vector, pero también se produce la transmisión mecánica y por semillas. La transmisión del vector es a menudo por un insecto (por ejemplo, pulgones), pero se ha demostrado que algunos hongos, nematodos y protozoos son vectores virales. En muchos casos, el insecto y el virus son específicos para la transmisión de virus, como el saltahojas de la remolacha que transmite el virus de la parte superior rizada que causa la enfermedad en varias plantas de cultivo. [11] Un ejemplo es la enfermedad del mosaico del tabaco, en la que las hojas se empequeñecen y la clorofila de las hojas se destruye. Otro ejemplo es Bunchy top of banana, donde la planta se empequeñece y las hojas superiores forman una roseta apretada.

Nematodos Editar

Los nematodos son animales pequeños, multicelulares, parecidos a gusanos. Muchos viven libremente en el suelo, pero hay algunas especies que parasitan las raíces de las plantas. Son un problema en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, donde pueden infectar cultivos. Nematodos del quiste de la papa (Globodera pallida y G. rostochiensis) se distribuyen ampliamente en Europa y América del Norte y del Sur y causan daños por valor de 300 millones de dólares en Europa cada año. Los nematodos agalladores tienen un rango de hospedadores bastante amplio, parasitan los sistemas radiculares de las plantas y, por lo tanto, afectan directamente la absorción de agua y nutrientes necesarios para el crecimiento y la reproducción normales de las plantas, [12] mientras que los nematodos quísticos tienden a infectar solo unas pocas especies. Los nematodos pueden provocar cambios radicales en las células de las raíces para facilitar su estilo de vida.

Protozoos y algas Editar

Hay algunos ejemplos de enfermedades de las plantas causadas por protozoos (p. Ej., Phytomonas, un cinetoplasto). [13] Se transmiten como zoosporas duraderas que pueden sobrevivir en estado de reposo en el suelo durante muchos años. Además, pueden transmitir virus de plantas. Cuando las zoosporas móviles entran en contacto con un pelo de la raíz, producen un plasmodio que invade las raíces.

Algunas algas parásitas incoloras (p. Ej., Cephaleuros) también causan enfermedades de las plantas. [ cita necesaria ]

Plantas parasitarias Editar

En el estudio de la fitopatología se incluyen plantas parasitarias como la retama, el muérdago y la cáscara. Dodder, por ejemplo, puede ser un conducto para la transmisión de virus o agentes similares a virus desde una planta huésped a una planta que no es típicamente un huésped, o para un agente que no es transmisible por injerto.

  • Enzimas que degradan la pared celular: Se utilizan para romper la pared celular de la planta con el fin de liberar los nutrientes en su interior.
  • Toxinas: Estos pueden ser no específicos del huésped, que dañan todas las plantas, o específicos del huésped, que causan daño solo en una planta huésped.
  • Proteínas efectoras: Estos pueden secretarse al entorno extracelular o directamente a la célula huésped, a menudo a través del sistema de secreción de tipo tres. Se sabe que algunos efectores suprimen los procesos de defensa del huésped. Esto puede incluir: reducir los mecanismos de señalización interna de las plantas o reducir la producción de fitoquímicos. [14] Se conocen bacterias, hongos y oomicetos por esta función. [4] [15]
  • Esporas: Las esporas de hongos fitopatógenos pueden ser una fuente de infección en las plantas hospedadoras. Las esporas se adhieren primero a la capa cuticular de las hojas y los tallos de la planta huésped. Para que esto suceda, la espora infecciosa debe ser transportada desde la fuente del patógeno, esto ocurre a través del viento, el agua y vectores como insectos y humanos. Cuando existen condiciones favorables, la espora producirá una hifa modificada llamada tubo germinativo. Este tubo germinal forma más tarde una protuberancia llamada apresorio, que forma paredes celulares melanizadas para acumular presión de tracción. Una vez que se acumula suficiente presión de turgencia, el apresorio ejerce presión contra la capa cuticular en forma de una clavija de penetración endurecida. Este proceso también se ve favorecido por la secreción de enzimas que degradan la pared celular del apresorio. Una vez que la clavija de penetración entra en el tejido del huésped, desarrolla una hifa especializada llamada haustorio. Según el ciclo de vida de los patógenos, este haustorio puede invadir y alimentar a las células vecinas de forma intracelular o existir intercelularmente dentro de un huésped. [dieciséis]

Algunos trastornos abióticos pueden confundirse con trastornos inducidos por patógenos. Las causas abióticas incluyen procesos naturales como la sequía, las heladas, las inundaciones por nieve y granizo y el drenaje deficiente, la deposición de nutrientes por deficiencia de sales minerales, como el cloruro de sodio y el yeso, quemadura por el viento y la rotura por tormentas e incendios forestales. Desórdenes similares (generalmente clasificados como abióticos) pueden ser causados ​​por la intervención humana, lo que resulta en compactación del suelo, contaminación del aire y del suelo, salinización causada por el riego y la salazón de carreteras, aplicación excesiva de herbicidas, manipulación torpe (por ejemplo, daños a los árboles por la cortadora de césped), y vandalismo. [ cita necesaria ]

Epidemiología: El estudio de los factores que influyen en el brote y la propagación de enfermedades infecciosas. [17]

Un tetraedro de enfermedades (pirámide de enfermedades) captura mejor los elementos relacionados con las enfermedades de las plantas. Esta pirámide utiliza el triángulo de la enfermedad como base, que consta de elementos como: huésped, patógeno y medio ambiente. Además de estos tres elementos, los humanos y el tiempo agregan los elementos restantes para crear un tetraedro de enfermedad.

Historia: Epidemias de enfermedades de las plantas históricamente conocidas basadas en enormes pérdidas:

- Tizón del castaño en América del Norte [20]

Factores que afectan las epidemias:

Huésped: Nivel de resistencia o susceptibilidad, edad y genética.

Patógeno: cantidad de inóculo, genética y tipo de reproducción.

La resistencia a las enfermedades de las plantas es la capacidad de una planta para prevenir y acabar con las infecciones por patógenos vegetales.

Las estructuras que ayudan a las plantas a prevenir enfermedades son: capa cuticular, paredes celulares y células protectoras de los estomas. Estos actúan como una barrera para evitar que los patógenos entren en la planta huésped.

Una vez que las enfermedades han superado estas barreras, los receptores de las plantas inician vías de señalización para crear moléculas que compitan contra las moléculas extrañas. Estas vías están influenciadas y desencadenadas por genes dentro de la planta huésped y son susceptibles de ser manipuladas por el mejoramiento genético para crear variedades de plantas que sean resistentes a patógenos destructivos. [21]

Cuarentena doméstica Editar

Un parche de vegetación enferma o plantas individuales se puede aislar de otro crecimiento saludable. Las muestras pueden destruirse o reubicarse en un invernadero para su tratamiento o estudio.

Inspección y cuarentena de puertos y fronteras Editar

Otra opción es evitar la introducción de organismos no nativos nocivos controlando todo el tráfico y la actividad de personas (por ejemplo, el Servicio Australiano de Inspección y Cuarentena), aunque la legislación y la aplicación son cruciales para garantizar una eficacia duradera. El volumen actual de comercio mundial está brindando, y seguirá brindando, oportunidades sin precedentes para la introducción de plagas de plantas. [McC 1] En los Estados Unidos, incluso para mejorar estimar del número de tales introducciones, y por lo tanto la necesidad de imponer cuarentena e inspección en puertos y fronteras, requeriría un aumento sustancial de las inspecciones. [McC 2] En Australia, una deficiencia similar de comprensión tiene un origen diferente: las inspecciones portuarias no son muy útiles porque los inspectores saben muy poco sobre taxonomía. A menudo hay plagas que el gobierno australiano ha priorizado como dañinas para mantenerlas fuera del país, pero que tienen parientes taxonómicos cercanos que confunden el tema. Y los inspectores también se encuentran con lo contrario: nativos inofensivos, nativos no descubiertos o nativos recién descubiertos con los que no necesitan preocuparse pero que son fáciles de confundir con los miembros de su familia extranjera proscritos. [BH 1]

La irradiación de alimentos con rayos X y haz de electrones / haz E se ha probado como tratamiento de cuarentena para frutas y verduras originarias de Hawai. La FDA de los EE. UU. (Administración de Alimentos y Medicamentos), el USDA APHIS (Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal), los productores y los consumidores aceptaron los resultados: una erradicación de plagas más completa y una menor degradación del sabor que el tratamiento térmico. [22]

Edición cultural

La agricultura en algunas sociedades se mantiene a pequeña escala, atendida por pueblos cuya cultura incluye tradiciones agrícolas que se remontan a la antigüedad. (Un ejemplo de tales tradiciones sería la capacitación de por vida en técnicas de terrazas de parcelas, anticipación y respuesta al clima, fertilización, injertos, cuidado de semillas y jardinería dedicada.) Las plantas que son monitoreadas de manera atenta a menudo se benefician no solo de una protección externa activa sino también de una mayor protección. vigor general. Si bien es primitiva en el sentido de ser la solución más intensiva en mano de obra, cuando es práctica o necesaria, es más que adecuada.

Resistencia de las plantas Editar

Los desarrollos agrícolas sofisticados ahora permiten a los productores elegir entre especies cruzadas sistemáticamente para garantizar la mayor resistencia en sus cultivos, según sea adecuado para el perfil patológico de una región en particular. Las prácticas de mejoramiento se han perfeccionado durante siglos, pero con el advenimiento de la manipulación genética es posible un control aún más fino de los rasgos de inmunidad de un cultivo. Sin embargo, la ingeniería de plantas alimenticias puede ser menos gratificante, ya que la mayor producción se ve frecuentemente compensada por la sospecha popular y la opinión negativa acerca de esta "manipulación" de la naturaleza.

Química Editar

Se pueden emplear muchos compuestos naturales y sintéticos para combatir las amenazas anteriores. Este método funciona eliminando directamente los organismos que causan enfermedades o frenando su propagación; sin embargo, se ha demostrado que tiene un efecto demasiado amplio, por lo general, para ser bueno para el ecosistema local. Desde un punto de vista económico, todos los aditivos naturales, excepto los más simples, pueden descalificar un producto del estado "orgánico", reduciendo potencialmente el valor del rendimiento.

Edición biológica

La rotación de cultivos puede ser un medio eficaz para evitar que una población parasitaria se establezca bien, ya que un organismo que afecta las hojas se moriría de hambre cuando el cultivo de hojas se reemplaza por un tipo tuberoso, etc. Pueden existir otros medios para socavar los parásitos sin atacarlos directamente. .

Edición integrada

El uso de dos o más de estos métodos en combinación ofrece una mayor probabilidad de efectividad.

La patología vegetal se ha desarrollado desde la antigüedad, comenzando con Theophrastus, pero el estudio científico comenzó en el período moderno temprano con la invención del microscopio y se desarrolló en el siglo XIX. [23]


Capítulo 8.4: Procesamiento de muestras para cultivo de hongos

Cuando se sospecha que una muestra contiene un agente etiológico fúngico, debe procesarse para cultivo fúngico, independientemente de los hallazgos microscópicos directos. La recuperación de hongos patógenos en cultivo proporciona un diagnóstico definitivo de enfermedad micótica, identifica el agente etiológico de la infección y permite la evaluación de la susceptibilidad in vitro a los agentes antifúngicos. Si no hay suficiente material para microscopía y cultivo, toda la muestra debe usarse para cultivo, ya que este es el procedimiento más sensible para la detección de hongos. Los métodos de procesamiento y cultivo de muestras están diseñados para conservar la viabilidad del hongo y obtener el máximo rendimiento de organismos a partir de muestras clínicas. La elección de los medios para el aislamiento de hongos a partir de material clínico se basa principalmente en la especie más probable que se encuentre en un sitio particular o bajo una condición clínica reconocida. Los medios selectivos se incluyen cuando otros microorganismos, en particular bacterias, también pueden estar presentes en la muestra. Las muestras deben procesarse lo antes posible después de su recepción. Algunas muestras pueden requerir un tratamiento previo antes del cultivo.


Identificación y patogenicidad de hongos patógenos asociados con la pudrición del tallo de los frutos del aguacate en Kenia.

En Kenia, el aguacate (Persea americana Mill.) Es uno de los cultivos de frutas tropicales perennes más importantes y una de las principales fuentes de divisas. En 2017, representó alrededor del 74% en valor del total de frutas exportadas desde el país [1]. Actualmente, el aguacate "Hass" aporta aproximadamente el 80% de los frutos de aguacate producidos y exportados desde Kenia [2]. Otros cultivares producidos incluyen "Fuerte", "Puebla", "Duke" y "G6" [3].La producción de aguacate en Kenia está dominada por pequeños agricultores (85%) dentro de varias zonas agroecológicas, que producen principalmente para el mercado de exportación, y el resto se vende en los mercados locales. El setenta por ciento (70%) de los frutos de aguacate se producen en las regiones central y oriental del país. Las frutas se exportan principalmente a la Unión Europea [2,4]. Desde el año 2000, la superficie cultivada con aguacate ha aumentado significativamente, lo que ha llevado a un aumento de las exportaciones de aguacate de Kenia [4]. El aumento de la producción está impulsado por la alta demanda de frutas de aguacate en el mercado mundial debido a la conciencia de los consumidores sobre el valor dietético de la fruta [5]. A pesar del aumento de la producción y exportación de frutos de aguacate de Kenia, la alta incidencia de enfermedades fúngicas poscosecha, incluidas la antracnosis y la SER, limitan la comercialización de los frutos y contribuyen a aumentar las pérdidas de los productores [6, 7].

Los síntomas de la pudrición del extremo del tallo (SER) se desarrollan en la fruta del aguacate a medida que madura. Se caracteriza por un marchitamiento, seguido de una pudrición de color marrón a negro que comienza en el extremo del tallo de la fruta. A medida que avanza la pudrición, los haces vasculares internos pueden tener coloraciones de negro a marrón y eventualmente toda la fruta es consumida por la pudrición [8, 9]. Las frutas apenas presentan síntomas de SER antes de la cosecha. Además, el SER suele ocurrir en la planta de empaque durante el tránsito o después de la comercialización.

Se ha informado que varias especies de hongos causan SER en frutos de aguacate. En Chile, los hongos patógenos reportados como causantes de SER incluyeron miembros de la familia Botryosphaeriaceae, a saber, Diplodia mutila, D. pseudoseriata, D. seriata, Dothiorella iberica, Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum australe, N. nonquaesitum y N. parvum [10]. En Italia, N. parvum, Colletotrichum gloeosporioides o C. fructicola y Diaporthe foeniculacea o D. sterilis fueron los patógenos SER más aislados [9]. En California, se reportaron Neofusicoccum luteum y Phomopsis perseae [8] mientras que en Sudáfrica, se reportaron Thyronectria pseudotrichia, Dothiorella aromatica, Pestalotiopsis versicolor, Lasiodiplodia theobromae, Rhizopus stolonifer, Fusarium sambucinum y Fusarium solani [11].

En Kenia, sin embargo, no se ha identificado el patógeno real que causa SER, pero por otro lado, se han descrito patógenos de antracnosis [12]. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo identificar el patógeno fúngico asociado con SER de frutos de aguacate en las tierras altas centrales de Kenia y probar su patogenicidad.

2.1. Área de estudio y recolección de muestras. El estudio se llevó a cabo en el condado de Murang'a, que es el condado líder en producción y exportación de frutos de aguacate en Kenia [1]. Geográficamente, el condado se encuentra entre las latitudes 0 [grados] 34 'sur y 1 [grados] 07' sur y las longitudes 36 [grados] este y 37 [grados] 27 'este, con una elevación de 914 m sobre el nivel del mar en el este y 3353 m asl en el oeste. Los frutos de aguacate se cultivan en las zonas agroecológicas dos, tres y cuatro que tienen rangos de temperatura promedio de 18.0 [grados] C a 27.2 [grados] C y una precipitación anual promedio de 1600 mm-900 mm [13].

Entre septiembre de 2017 y marzo de 2018, se utilizó un muestreo sistemático para seleccionar 162 huertos incluidos en el estudio. Los huertos tenían más de cinco árboles frutales de aguacate "Hass". Se recolectaron seis frutos de aguacate maduros al azar de cada cinco árboles frutales de aguacate seleccionados al azar en cada huerto muestreado. Además, se compraron 10 frutas "Hass", en diferentes etapas de maduración, de diferentes comerciantes en tres mercados principales (Kandara, Kirwara y Maragwa) dentro del condado a intervalos semanales durante dos meses. Se tomaron muestras de un total de 453 frutas de 4.860 frutas recolectadas en los huertos y 240 frutas del mercado, se empacaron en cajas de cartón y se transportaron a la Organización de Investigación Agrícola y Ganadera de Kenia (KALRO), Kandara, donde se incubaron a temperatura ambiente (22 [ grados] C-25 [grados] C) durante 7-14 días para permitir el desarrollo de SER.

2.2. Aislamiento de hongos. Las 207 frutas de los huertos y las 125 frutas del mercado que mostraron síntomas de SER se lavaron con agua del grifo limpia, se esterilizaron en la superficie con hipoclorito de sodio al 2% durante un minuto, se enjuagaron con agua destilada y se secaron al aire. Se colocaron asépticamente pequeños trozos de carne de los márgenes de la carne sintomática en placas de Petri de 9 cm de diámetro que contenían agar dextrosa de patata (PDA) modificado con sulfato de estreptomicina y se incubaron a temperatura ambiente (22 [grados] C-25 [grados] C) durante cinco dias. Se obtuvieron cultivos puros transfiriendo las puntas de micelio en agar agua (WA) al 1,5% (peso / volumen) y se dejaron crecer durante la noche. Las puntas hifales del crecimiento de micelio en el WA se transfirieron posteriormente a PDA modificado con sulfato de estreptomicina. La botella universal inclinada se utilizó para conservar los cultivos puros del patógeno y se almacenó en el frigorífico a 4 [grados] C para su uso posterior.

2.2.1. Preparación de suspensión de conidios. Se inundaron cultivos puros de catorce días en PDA con agua destilada estéril. Se utilizó un asa de alambre estéril para raspar los conidios y ponerlos en suspensión. La suspensión se filtró a través de una tela de muselina de doble capa y el filtrado recogido se diluyó en serie a 1x [105]. Se utilizó un hemocitómetro para ajustar la concentración de esporas.

2.3. Caracterización morfológica del aislado. Para inducir la producción de conidios, se transfirieron pequeños trozos de micelio de los aislados a placas de Petri de 9 cm de diámetro con PDA modificado con astillas de madera de aguacate esterilizadas en autoclave y se incubaron a 25 [+ o -] 1 [grados] C durante cuatro semanas. Los aislamientos se identificaron morfológicamente en función de las características culturales y microscópicas descritas por Valencia et al. [10], Phillips y col. [14] y Watanabe [15]. Se utilizó azul de lactofenol en la identificación microscópica. La longitud y el ancho de los conidios (N = 50) de cada aislamiento se midieron usando un microscopio óptico ZeissPrimo Star, acoplado a una cámara AxioCam ERc 5s.

2.4. Caracteristicas moleculares

2.4.1. Extracción de ADN. Un protocolo mejorado de extracción de hongos descrito por Innis et al. [16] se utilizó para extraer ADN de tres aislados representativos de cada especie. Se utilizaron cultivos de hongos puros derivados de las esporas individuales incubadas en PDA. Se colocaron cuarenta miligramos (mg) de micelio en un tubo de microcentrífuga que contenía 300 µl de tampón de extracción (Tris-HCl, 200 mM Ph 8.5 EDTA, 25 mM 1 M NaCl 250 mM SDS, 0.5%) con perlas de vidrio. Los tubos se colocaron en un molino genogrinder fastprep [R] -24 durante un minuto a 2000 rpm. Se añadieron 200 microlitros ([micro] l) de acetato de sodio 3 mM pH 5,2 y se refrigeraron a -20 ° C durante 10 minutos. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 13000 rpm. Después de eso, los sobrenadantes se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml nuevos. Se añadieron cantidades iguales de isopropanol a los sobrenadantes y se dejaron reposar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 13000 rpm y se descartó el sobrenadante. A continuación, se añadieron quinientos [micro] l de etanol al 70% a los sedimentos y se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 minutos para lavar el sedimento. Los sedimentos de ácido nucleico obtenidos se secaron al aire y luego se resuspendieron en 50 [micro] l de tampón TE bajo en sal (Tris-HCl, 1 mM, pH 8 EDTA, 0,1 mM) y se almacenaron a -20 [grados] C para su uso posterior. . La calidad del ADN se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa y se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000S. El ADN se estandarizó o normalizó a 20 ng / [micro] l para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).

2.4.2. Amplificación y secuenciación de ADN. El ADN extraído se utilizó como plantillas en PCR. Se utilizaron dos conjuntos de cebadores, ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC), ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AACAAG G) e ITS1, en la amplificación de la región transcrita interna rDNA de los aislados de hongos [ dieciséis]. Volúmenes de reacción de PCR de 25 [micro] l que contienen 2,5 [micro] l de 0,2 [micro] M de cada cebador, 5 * tampón de reacción My Taq, 0,25 [micro] l de polimerasa Taq (Bioline, Meridian Life Science, Memphis, EE. UU.) Se utilizaron 40 ng / [micro] l de cada molde de ADN y 12,75 [micro] l de agua molecular. Para la amplificación, se utilizó el ciclador térmico de ADN GeneAmp 9700 (Perkin-Elmer). El proceso implicó un paso de desnaturalización inicial a 94 [grados] C durante 30 s, seguido de 35 ciclos, desnaturalización a 94 [grados] C durante 30 s, recocido a 55 [grados] C durante 30 s seguido de una extensión durante 1 minuto a 68 [grados] C, y un paso de extensión final de 5 min a 68 [grados] C. Para confirmar la amplificación, los productos de PCR se procesaron en gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron bajo luz ultravioleta usando ENDURO ™ GDS. Los productos de PCR se limpiaron utilizando el kit de limpieza de PCR de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se enviaron para la secuenciación de Sanger con cebadores directos e inversos en la plataforma Inqaba Africa Genomic, Sudáfrica.

2.4.3. Análisis bioinformático. Los datos de la secuencia se analizaron asignando lecturas a muestras, índices, cebadores y adaptadores. Los cebadores se marcaron utilizando Picard (https: //broadinstitute.github. Io / picard / index.html). Se utilizó Bam2fastq (https://gsl.hudsonalpha.org/information/software/bam2fastq) para convertir los archivos bam resultantes a fastq. La calidad de secuenciación general de las lecturas se evaluó visualmente utilizando el programa Fast QC (http: // www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Los parámetros de calidad utilizados en el filtrado de las lecturas incluyeron una longitud mínima de 250 pb y un valor de CC mínimo de 30. Se realizó el recorte correspondiente a los adaptadores y secuencias de baja calidad de todas las lecturas. El posterior análisis y procesamiento de las lecturas se realizó en el CLC Genomic Workbench 11.0, donde se fusionaron las lecturas superpuestas. El ensamblaje de novo de las lecturas sin ensamblar y la alineación de las lecturas sin procesar se realizó utilizando CLC Genomics Workbench 11.0 con parámetros predeterminados (contig mínimo = 100 pb, 23 K-mer, fracción de similitud = 80% y fracción de longitud = 50%). Se realizó un análisis BLAST de las secuencias ITS para respaldar la identificación morfológica de las muestras en la base de datos del NCBI. Las secuencias ITS se depositaron en GeneBank utilizando BankIT.

2.5. Prueba de patogenicidad. Para establecer los postulados de Koch, Geotrichum candidum, Fusarium equiseti, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum parvum y Nectria pseudotrichia se sometieron a la prueba de patogenicidad descrita por Freeman et al. [17] y Twizeyimana et al. [8]. Se recolectaron frutas saludables "Hass" de las granjas que se sabe tienen una baja incidencia de SER en el condado de Murang'a. Los frutos se lavaron con agua limpia del grifo para eliminar los restos de tierra. Las frutas se esterilizaron en la superficie sumergiéndolas en etanol al 75% durante aproximadamente tres minutos, se enjuagaron con agua destilada y luego se secaron al aire. Cada uno de los aislados se sometió a dos métodos de inoculación.

Se utilizó un barrenador de corcho estéril (5 mm de diámetro) para enrollar el extremo del tallo de cada fruto y se colocaron sobre la herida discos miceliales de diámetro equivalente obtenidos del borde de cultivos puros en crecimiento activo. Se colocaron seis frutos inoculados para cada patógeno y seis frutos de control inoculados con PDA simple en bandejas individuales y se cubrieron con film transparente para conservar la humedad y evitar la contaminación. Los frutos se incubaron a temperatura ambiente de 24 [grados] C [+ o -] 1.

Después de romper el pedicelo de los frutos secados al aire, se colocó una suspensión de conidios (5 * [10 -5] conidiales / ml) en la abertura del extremo del tallo y se cubrió con una película adhesiva. Seis frutos inoculados por cada patógeno y seis frutos control inoculados con agua destilada se dispusieron en bandejas individuales y se cubrieron con film transparente. Los frutos inoculados se incubaron a 24 [+ o -] 1 [grados] C. La evaluación se realizó después de 12 días cortando los frutos longitudinalmente y calificando los síntomas de SER en una escala de calificación de 0-4 de la siguiente manera: 0 = sin pudrición visible 1 = 1-25% de podredumbre 2 = 25-50% de pudrición 3 = 50-75% putrefacción 4 = [mayor o igual a] 75% de descomposición (Figura 1). Al final de la prueba de patogenicidad, se realizó un reaislamiento de los frutos sintomáticos y las colonias de hongos reaislados se compararon morfológicamente con los aislamientos originales [8, 9]. La gravedad del SER en frutos de aguacate se calculó mediante la siguiente fórmula [18]:

porcentaje de índice de enfermedad (PDI) = suma de calificaciones numéricas / no. de frutos examinados * grado máximo * 100. (1)

2.6. Análisis de los datos. Los datos secuenciados de Sanger se analizaron y procesaron utilizando CLC Genomic Workbench versión 11.0. Análisis de varianza (ANOVA) seguido del post-hoc de Tukey que se utilizó para comparar la tasa de crecimiento porcentual media de los hongos inoculados, mientras que la prueba t de Student se utilizó para comparar las lesiones de SER en frutos bajo diferentes métodos de inoculación. El análisis estadístico se realizó utilizando la pestaña Min v8 (Minitab, LLC).

3.1. Aislamiento e identificación de especies fúngicas. Después de la incubación de los frutos durante 7-14 días, se desarrolló una pudrición de color marrón oscuro a negro en los frutos del aguacate, y ocasionalmente se observaron micelios de hongos en la superficie del fruto. Internamente, se observó una decoloración de los haces vasculares (Figura 2). A medida que la fruta maduraba, la podredumbre progresaba en toda la fruta. Se recolectaron un total de 207 aislamientos de los frutos de los huertos, y se recolectaron 125 aislamientos de los frutos de los mercados.

Según las características de la colonia y los conidios, los aislamientos se agruparon en siete grupos (Tabla 1).

La colonia de Lasiodiplodia theobromae del grupo 1 en PDA era redonda y lisa. Al principio, se desarrolló un micelio filamentoso aéreo blanco con centro gris. Con la edad, la colonia se volvió gris y luego de gris oscuro a negro (Figuras 3 (a) y 3 (b)). Los picnidios eran de color gris y eran simples o agregados. Los conidios eran de subovoides a elipsoides. Inicialmente, eran aseptados, de paredes gruesas e hialinas, sin embargo, con el tiempo, formaron un solo tabique medio y se volvieron de color marrón oscuro en un rango de 17.35 a 29.31 * 11.23 a 14.91 [micro] m (media 22.68 * 5.70 [micro] m) . Las características morfológicas fueron consistentes con lo descrito por Valencia et al. [10], Phillips y col. [14] y Watanabe [15].

Grupo 2 La colonia de Neofusicoccum parvum en PDA era rugosa con márgenes irregulares. Inicialmente, se desarrolló un micelio aéreo filamentoso denso blanco que con el tiempo pasó de oscuro a negro (Figuras 3 (c) y 3 (d)). Los picnidios eran negros, globosos y simples o agregados. Los conidios eran redondeados a subovoides, aseptados e hialinos con contenido granular, y con el tiempo cambiaron de marrón claro a negro con un tamaño de 19,77 a 15,25 * 4,10 a 7,5 [micro] m (media de 17,01 * 5,70 [micro] m ). Las características morfológicas fueron consistentes con lo descrito por Valencia et al. [10] y Phillips et al. [14].

Las colonias de Nectria pseudotrichia del grupo 3 en PDA eran blancas, algodonosas, con crecimiento de micelio aéreo filamentoso. El crecimiento de la colonia fue regular y rugoso, con márgenes suaves (Figuras 3 (e) y 3 (f)). Los conidios eran de ovoides a subovoides con un contenido granular verdoso que variaba de 6,27 a 12,50 * 2,20 a 9,40 [micro] m (media 8,49 * 4,95 [micro] m). Las características morfológicas fueron consistentes con lo descrito por Hirooka et al. [19].

Las colonias de Fusarium solani del grupo 4 en PDA eran blancas, algodonosas, con micelio floco. Los márgenes de la colonia eran regulares y suaves. La tasa de crecimiento fue baja. La parte inferior era de color pálido a marrón (Figuras 3 (g) y 3 (h)). Los microconidios eran hialinos, ovalados y algunos eran cilíndricos con bordes lisos que van desde 5,02 a 8,52 * 2,91 a 5,50 [micro] m (media 6,88 * 3,79 [micro] m), mientras que los macroconidios eran hialinos, ligeramente curvados y anchos con dos a tres septos que alcanzan un rango de 13,05 a 34,18 * 2,10 a 5,50 [micro] m (media 18,85 * 3,36 [micro] m). Las características morfológicas fueron consistentes con lo descrito por Hafizi et al. [20] y Watanabe [15].

Las colonias de Fusarium oxysporum del grupo 5 en PDA tenían abundantes micelios aéreos de color blanco a cremoso. Los márgenes de la colonia eran lisos y, a veces, ligeramente curvados. El reverso de la colonia era de color rojo pálido a violeta melocotón (Figuras 3 (i) y 3 (j)). Se produjeron numerosas microconidias ovoides a en forma de riñón sin septos de 11,2 a 19,9 * 4,5 a 8,4 [micro] m (media de 15,4 * 6,1 [micro] m). Las macroconidias eran de paredes delgadas, falcadas a casi rectas, y ambos extremos eran casi puntiagudos con 2-3 septos que iban de 22,1 a 43,9 * 5,1 a 12,5 [micro] m (media 28,4 * 7,5 [micro] m). Las características fueron similares a lo observado por Hafizi et al. [20], Hussain y col. [21] y Watanabe [15].

Las colonias de Fusarium equiseti del grupo 6 en PDA eran blancas, con abundante micelio algodonoso que se oscurecía con la edad. Se observó una pigmentación difusible de color marrón pálido a marrón oscuro (Figuras 3 (k) y 3 (l)). Sin embargo, los microconidios no estaban presentes, se observaron macroconidios largos y delgados ligeramente curvados en los extremos con tres a seis septos de 25,3 a 46,7 * 3,5 a 4,6 [micro] m (media 37,2 * 3,24 [micro] m) como lo observó Motlagh de manera similar [22] y Watanabe [15].

Las colonias de Geotricum candidum del grupo 7 en PDA no eran densas y de color blanco a beige se adhirieron al medio de cultivo con márgenes suaves (Figuras 3 (m) y 3 (n)). Los micelios formaron artroconidios de márgenes lisos, que eran hialinos, unicelulares y subglobosos o cilíndricos con ápices redondeados o truncados que alcanzaban 6,1 a 19,7 * 2,3 a 10,3 [micro] m (media 11,38 * 5,56 [micro] m). Las características morfológicas del hongo fueron consistentes con las descritas por Zhang et al. [23], Alam y col. [24] y Watanabe [15].

Además, para respaldar la identificación morfológica de las muestras, los marcadores moleculares ITS5 e ITS4 e ITS1 e ITS5 se utilizaron para la identificación molecular y arrojaron consistentemente altos niveles de discriminación de especies. La amplificación por PCR para los ITS produjo productos de 526 a 550 pb. A partir del análisis de explosión, los aislados de hongos pudieron identificar siete especies. Los aislamientos reportados en este estudio se han asociado con frutas tropicales. Estos incluían F. equiseti (MK922072, MK922069), F.oxysporum (MK922065), F.solani (MK922070, MK922071, MK922066), G. candidum (MK215811, MK922075), L.theobromae (MK922068, MK922073), N. parvum (MK922067) y N. pseudotrichia (MK922074). La coincidencia más cercana entre los aislamientos de este estudio y los extraídos del GeneBank tuvo un rango de similitud del 99 al 100% y se muestra en la (Tabla 2).

3.2. Pruebas de patogenicidad. Los frutos de aguacate inoculados con micelio y los inoculados con suspensiones de esporas desarrollaron síntomas similares a los observados en frutos obtenidos de huertas y mercados (Figura 1). Todos los frutos inoculados desarrollaron síntomas de SER independientemente del aislado o método de inoculación utilizado.Sin embargo, la gravedad de la enfermedad difirió entre las diferentes especies de hongos, así como el método de inoculación (Tabla 3). Cuando se inoculó con micelio, la severidad de SER varió entre 6.67% y 90.83% y cuando se utilizó suspensión de esporas la severidad varió entre 97.50% y 16.67% (Tabla 3). Lasiodiplodia theobromae, N. parvum y N. pseudotrichia causaron los síntomas de SER más graves en ambas inoculaciones y podrían considerarse las más virulentas. No se observaron síntomas en los frutos de control. Se detectaron diferencias estadísticas (p & lt 0.05) en el desarrollo de síntomas cuando los frutos de aguacate "Hass" se inocularon diferencialmente con micelios o suspensiones conidiales de N. parvum, N. pseudotrichia, F. solani, F. equiseti, F. oxysporum y G . candidum. Sin embargo, no hubo significación estadística en el desarrollo de síntomas cuando se inocularon con L. theobromae (Tabla 3).

Informamos que el SER de aguacate fue causado por Lasiodiplodia theobromae, Neofusicoccum parvum, Nectria pseudotrichia, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti y Geotricum candidum en las tierras altas centrales de Kenia. Este es el primer informe sobre la identificación de hongos patógenos SER de frutos de aguacate en Kenia. Los patógenos identificados se han asociado con SER de frutos de aguacate en otras regiones productoras de aguacate en el mundo, como América del Norte (California), Chile, Sudáfrica e Italia [8-11]. Del estudio actual, L. theobromae fue el patógeno aislado con mayor frecuencia, seguido de N. parvum y N. pseudotrichia. El estudio corrobora los informes de Galsurker et al. [25] que identificó a L. theobromae como un patógeno emergente de SER de frutas en todo el mundo. El patógeno se ha asociado con SER de mangos y papayas [26, 27] y también se ha identificado como un patógeno principal que causa enfermedad poscosecha de muchas frutas [28].

Además, los resultados corroboran los hallazgos de otras regiones productoras de aguacate del mundo donde se informó que los miembros de la familia Botryosphaeriaceae son la principal causa de SER de frutos de aguacate. Se ha informado que las especies de Botryosphaeriaceae causan SER de aguacate en Sudáfrica, Italia, California y Nueva Zelanda. En Sudáfrica, N. pseudotrichia fue el patógeno más aislado y, ocasionalmente, se aisló L. theobromae. En Italia, California y Nueva Zelanda, N. parvum fue el patógeno más aislado [8-11, 29]. Las temperaturas influyen en el patógeno SER predominante en un área. Las especies de Botryosphaeriaceae prosperan a altas temperaturas, mientras que el estrés hídrico estimula las infecciones latentes de la especie [25, 30]. La producción de aguacate en el condado de Murang'a se concentra en la región baja del condado, caracterizada por un clima cálido y rangos de temperatura entre 18.0 [grados] C y 27.2 [grados] C [13]. Esto podría explicar por qué L. theobromae y N. parvum fueron los patógenos fúngicos más aislados.

En California, N. parvum y otras especies de Botryosphaeriaceae (N. australe, N. luteum, Fusicoccum aesculi y Dothiorella iberica) se asociaron con SER [8]. Sin embargo, en nuestro estudio, sólo se aisló N. parvum, similar a los informes sobre el patógeno SER de frutos de aguacate en Italia [9]. Se encontró que tres especies de Fusarium, a saber, F. solani, F. oxysporum y F. equiseti, eran patógenos menores de SER en Kenia. Se informaron hallazgos similares en Sudáfrica, Nueva Zelanda [11, 31] y Etiopía [30]. Geotricum candidum se aisló exclusivamente de cuatro frutos de aguacate del mercado y nunca de los frutos del huerto. El patógeno se ha asociado con pudriciones ácidas de tomates, frutas cítricas y verduras [32]. En los mercados al aire libre en Kenia, donde se compraron las frutas de aguacate, las frutas de aguacate, cítricos y otras especies se colocan juntas, lo que permite la infección cruzada entre esas especies de frutas.

Colletotrichum gloeosporioides, que se ha informado anteriormente como causante de SER de aguacate en Italia y California [8, 11], no fue aislado en nuestro estudio que corrobora los informes de Chile [10]. Además, Twizeyimana et al. [8] identificó C. gloeosporioides como un patógeno SER débil del aguacate y sólo es importante cuando se combina con otros patógenos SER.

Las características morfológicas junto con el análisis de ADN se utilizaron para identificar y diferenciar L. theobromae, N. parvum y N. pseudotrichia. Lasiodiplodia theobromae creció rápidamente y colonizó la placa de Petri en dos días. Neofusicoccum parvum y N. pseudotrichia colonizaron la placa de Petri en cuatro y cinco días, respectivamente. Los tres patógenos mostraron características morfológicas casi similares. Sin embargo, las secuencias ITS de estos hongos permitieron claramente la diferenciación de las especies.

Lasiodiplodia theobromae fue el patógeno más aislado de frutos de huertos y mercados, seguido de N. parvum y N. pseudotrichia. Durante los estudios de patogenicidad, los tres patógenos también causaron la SER más severa en frutos de aguacate. Los tres patógenos son, por tanto, identificados como los principales agentes causales de la SER de aguacate en Kenia.

Se deben realizar más estudios en otras regiones productoras de aguacate en el país para obtener una imagen clara de la etiología SER en Kenia. Además, se deben establecer prácticas de manejo de SER precosecha y poscosecha de frutos de aguacate en el país.

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Los autores agradecen a la dirección de la Organización de Investigación Agrícola y Ganadera de Kenia (KALRO), el Centro de Investigación de Kandara y Biotecnología, Kabete, por proporcionar las instalaciones necesarias para llevar a cabo estudios morfológicos y moleculares. Los autores también agradecen a Inqaba Biotech., Sudáfrica, por la secuenciación del ADN.

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[21] M. Z. Hussain, M. A. Rahman, M. N. Islam, M. A. Latif y M. A. Bashar, "Identificación morfológica y molecular de Fusarium oxysporum Sch. Aislado de la marchitez de la guayaba en Bangladesh", Revista de Botánica de Bangladesh, vol. 41, no. 1, págs. 49-54, 2012.

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[23] L. Zhang, Y. H. Li, X. M. Zhang, Q. H. Zhang y H. Q. Xian, "Primer informe de pudrición ácida causada por Geotrichum candidum en morifructus en China", Plant Disease, vol. 102, no. 12, pág. 2640, 2018.

[24] M. W. Alam, A. Rehman, A. U. Malik et al., "Primer informe de Geotrichum candidum que causa pudrición ácida poscosecha de melocotón en Punjab, Pakistán", Plant Disease, vol. 101, no. 8, pág. 1543, 2017.

[25] O. Galsurker, S. Diskin, D. Maurer, O. Feygenberg y N. Alkan, "Pudrición del extremo del tallo de la fruta", Horticulturae, vol. 4, no. 4, pág. 50, 2018.

[26] JO Honger, CE William, D. Owusu-Ansah, K. Siaw-Adane y GT Odamtten, "Patogenicidad y sensibilidad a los fungicidas del agente causal de la pudrición del tallo del mango en Ghana", Ghana Journal of Agricultural Science, vol. 49, no. 1, págs. 37-52, 2015.

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[28] H. Mohamed y A. Saad, "El control biológico de la enfermedad poscosecha (Botryodiplodia theobromae) de la guayaba (Psidium guajava L.) mediante la aplicación de cepas de levadura", Biología y tecnología poscosecha, vol. 53, no. 3, págs. 123-130, 2009.

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[30] M. Kebede y A. Belay, "Hongos asociados con la pudrición del fruto del aguacate poscosecha en la ciudad de jimma, suroeste de Etiopía", Journal of Plant Pathology and Microbiology, vol. 10, no. 3, pág. 2, 2019.

[31] R. C. Ploetz, Enfermedades de los cultivos de frutas tropicales, CABI, Wallingford, Reino Unido, 2003.

[32] C. R. Thornton, D. C. Slaughter y R. M. Davis, "Detección del patógeno de pudrición ácida Geotrichum candidum en frutas y jugos de tomate mediante el uso de un ELISA basado en anticuerpos monoclonales altamente específicos", International Journal of Food Microbiology, vol. 143, no. 3, págs. 166-172, 2010.

E. K. Wanjiku, (1,2) J. W. Waceke, (1) B. W. Wanjala [ID], (3) y J. N. Mbaka (4)

(1) Departamento de Ciencia y Tecnología Agrícola, Universidad Kenyatta (KU), Nairobi, Kenia

(2) Departamento de Sanidad y Producción Animal, Universidad Mount Kenya (MKU), Nairobi, Kenia

(3) Instituto de Investigación en Biotecnología, Organización de Investigación Agrícola y Ganadera de Kenia (KALRO), Nairobi, Kenia

(4) Instituto de Investigación en Horticultura, Organización de Investigación Agrícola y Ganadera de Kenia (KALRO), Nairobi, Kenia

La correspondencia debe dirigirse a B. W. Wanjala [email protected]

Recibido el 29 de noviembre de 2019 Revisado el 5 de junio de 2020 Aceptado el 11 de junio de 2020 Publicado el 9 de julio de 2020

Editor académico: Giuseppe Comi

Leyenda: Figura 1: Síntomas de SER en frutos de aguacate "Hass" inoculados artificialmente. Guía para la puntuación de gravedad de la escala de podredumbre de la enfermedad (0-4). (a) y (b) representan 0 (c) y (d) representan 1 (e) y (f) representan 2 (g) y (h) representan 3 (i) y (j) representan 4.

Leyenda: Figura 2: Síntomas de SER que se muestran después de la incubación. (a) decoloración marrón de la pulpa del fruto (b) decoloración negra de los haces vasculares (c) y (d) micelio fúngico que se desarrolla en la superficie.

Leyenda: Figura 3: Características de la colonia (reverso y anverso) de aislados patógenos de SER en PDA. (a) y (b) representan el reverso y el frente de Lasiodiplodia theobromae (GA11) (c) y (d) Neofusicoccumparvum (GA7) (e) y (f) Nectriapseudotrichia (GA13) (g) y (h) Fusarium solani (1GEF8 ) (i) y (j) Fusarium oxysporum (MS4a) (k) y (l) Fusarium equiseti (1GF17) (m) y (n) Geotricum candidum (GA6).


Volumen 8 - 2017 - Índice

18. Neophyllachora gen nov. (Phyllachorales), tres nuevas especies de Phyllachora de Poaceae y resurrección de Polystigmataceae (Xylariales)
Dayarathne MC, Maharachchikumbura SSN, Jones EBG, Goonasekara ID, Bulgakov TS, Al-Sadi AM, Hyde KD, Lumyong S y McKenzie EHC
Micosfera 8 (10), 1598-1625

20. Los hongos anchos comestibles de la sección Bivelares de Agaricus del oeste de China
Zhang MZ, Li GJ, Dai RC, Xi YL, Wei SL y Zhao RL
Micosfera 8 (10), 1640-1652

24. Nuevas especies fúngicas de Phaeosphaeriaceae con una conexión morfo asexual / sexual.
Karunarathna A, Papizadeh M, Senanayake IC, Jeewon R, Phookamsak R, Goonasekara ID, Wanasinghe DN, Wijayawardene NN, Amoozegar MA, Shahzadeh Fazeli SA, Camporesi E, Hyde KD, Weerahewa HLD, Lumyong S, McKenzie EHC
Micosfera 8 (10), 1818-1834

26. Establecimiento de Zygosporiaceae fam. nov. (Xylariales, Sordariomycetes) basado en datos de secuencia de ADNr para acomodar Zygosporium.
Li JF, Phookamsak R, Jeewon R, Tibpromma S, Maharachchikumbura SSN, Bhat DJ, Chukeatirote E, Lumyong S, Hyde KD, McKenzie EHC
Micosfera 8 (10), 1855-1868

27. ¿Pueden los datos de secuencia de ITS identificar hongos endófitos de cultivos? Un estudio de caso de Rhizophora apiculata
Doilom M, Manawasinghe IS, Jeewon R, Jayawardena RS, Tibpromma S, Hongsanan S, Meepol W, Lumyong S, Jones EBG, Hyde KD
Micosfera 8 (10), 1869–1892

56. Magnicamarosporium diospyricola sp. nov. (Sulcatisporaceae) de Tailandia
Phukhamsakda C, Bhat DJ, Hongsanan S, Tibpromma S, Yang JB, Promputtha I
Micosfera 8 (4) 512–520

60. Nuevo registro de Trichoglossum rasum de Asia
Prabhugaonkar A, Pratibha J
Micosfera 8 (4) 583–591

62. Taxonomía y filogenia de Sparticola muriformis sp. nov. sobre hierba en descomposición
Karunarathna A, Phookamsak R, Wanasinghe DN, Wijayawardene NN, Weerahewa HLD, Khan S, Wang Y
Micosfera 8 (4) 603–614

66. Notas de la micosfera 1-50: Hierba (Poaceae) que habita Dothideomycetes
Thambugala KM, Wanasinghe DN, Phillips AJL, Camporesi E, Bulgakov TS, Phukhamsakda C, Ariyawansa HA, Goonasekara ID, Phookamsak R, Dissanayake A, Tennakoon DS, Tibpromma S, Chen YY, Liu ZY, Hyde KD
Micosfera 8 (4) 697–796

68. Especies de Diaporthe asociadas con la muerte regresiva del melocotonero en Hubei, China
Dissanayake AJ, Zhang W, Liu M, Hyde KD, Zhao W, Li XH, Yan JY
Micosfera 8 (5) 533–549

70. El análisis filogenético molecular revela siete nuevas especies de Diaporthe de Italia
Dissanayake AJ, Camporesi E, Hyde KD, Zhang Wei, Yan JY, Li XH
Micosfera 8 (5) 853–877

71. El estado actual de las especies en Diaporthe
Dissanayake AJ, Phillips AJL, Hyde KD, Yan JY, Li XH
Micosfera 8 (5) 1106-1156

90. Variabilidad genética en Setchelliogaster tenuipes (Setch.) Pouzar basada en códigos de barras de ADN ITS
Sulzbacher MA, Bevilacqua CB, Baldoni DB, Jacques RJS, Antoniolli ZI et al.
Micosfera 8 (7) 899–907

93. Mycosphere Essays 19: Avances recientes y desafíos futuros en taxonomía de hongos celomicetos
Wijayawardene NN, Papizadeh M, Phillips AJL, Wanasinghe DN, Bhat DJ, Weerahewa HLD, Shenoy BD, Wang Y, Huang YQ
Micosfera 8 (7) 934–950

94. Estado de hongos micorrízicos en granjas orgánicas del sur de Florida
Toprak B, Soti P, Jovel E, Alverado L, Jayachandran K
Micosfera 8 (7) 951–958

102. Hongos de manchas de alquitrán de Tailandia
Tamakaew N, Maharachchikumbura SSN, Hyde KD, Cheewangkoon R.
Micosfera 8 (8) 1054-1058

110. New Cylindrocladiella spp. de suelos de Tailandia
Lombard L, Cheewangkoon R, Crous PW
Micosfera 8 (8) 1088-1104

120. Hacia una clasificación natural de Amplistromataceae
Daranagama DA, Tian Q, Liu XZ, Hyde KD
Micosfera 8 (9) 1392–1402

121. Especies de mildiú polvoroso en la papaya: una historia de confusión y diversidad oculta
Braun U, Meeboon J, Takamatsu S, Blomquist C, Fernández Pavía SP, Rooney-Latham S, Macedo DM
Micosfera 8 (9), 1403–1423

122. Ensayo sobre la micosfera 19. Especies de Cordyceps que parasitan insectos himenópteros y hemípteros
Shrestha B, Tanaka E, Hyun MW, Han JG, Kim CS, Jo JW, Han SK, Oh J, Sung JM, Sung GH
Micosfera 8 (9), 1424-1442

124. Hacia la incorporación de hongos asexuales en una clasificación natural: lista de verificación y notas 2012-2016
Wijayawardene NN, Hyde KD, Tibpromma S, Wanasinghe DN, Thambugala KM, Tian Q, Wang Y, Fu L
Micosfera 8 (9), 1457-1555

125. Nuevas especies y registros de Bipolaris y Curvularia de Tailandia
Marin-Felix Y, Senwanna C, Cheewangkoon R y Crous PW
Micosfera 8 (9), 1556-1574

126. Dendryphiella fasciculata sp. nov. y notas sobre otras especies de Dendryphiella
Liu NG, Hongsanan S, Yang J, Lin CG, Bhat DJ, Liu JK, Jumpathong J, Boonmee S, Hyde KD y Liu ZY
Micosfera 8 (9), 1575-1586

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