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¿Cuál es el significado funcional de la diferencia en la relación cardiolipina / colesterol en diferentes membranas?


Leí en alguna parte que la membrana plasmática tiene poca cardiolipina pero exceso de colesterol, mientras que la membrana mitocondrial interna es rica en cardiolipina y tiene poco colesterol. Solo quería saber por qué existe esta diferencia.


Según wikipedia, la cardiolipina se encuentra en dos lugares, la membrana mitocondrial interna y las membranas bacterianas. Dado el origen endosimbiótico de las mitocondrias, tiene sentido que retengan algún remanente de su ascendencia bacteriana. Pero lo que es más importante, la cardiolipina juega un papel en las funciones enzimáticas de las membranas mitcondriales. La cardiolipina forma una estructura de resonancia bicíclica que le permite atrapar un protón, lo que ayuda a la fosforilación oxidativa.

Debido a que esta estructura también responde al pH y a los cationes divalentes, puede cambiar su comportamiento de conformación y agregación a medida que cambian las condiciones celulares.

La cardiolipina también juega un papel en mantener unidas las estructuras cuaternarias del complejo enzimático. El complejo mitocondrial III requiere 1 cardiolipina, el complejo IV requiere 2 cardiolipinas y el complejo V se une a 4 cardiolipinas.

La cardiolipina también juega un papel en la apoptosis, donde se oxida y sufre cambios conformacionales que hacen que se mueva de las membranas mitocondriales internas a externas y genere poros por los que el citocromo C puede escapar y desencadenar la apoptosis.

El colesterol se puede oxidar fácilmente en oxiesteroles, que se cree que realizan una variedad de funciones, pero no se comprenden completamente. Si los niveles de colesterol en las mitocondrias fueran altos, creo que se oxidaría y causaría problemas. http://en.wikipedia.org/wiki/Oxysterol


Contenido de fosfolípidos y colesterol del tejido ventricular del hámster sirio cardiomiopático ☆

Se investigó una relación entre el desarrollo de miocardiopatía hereditaria en el hámster sirio (BIO 14.6) y los cambios en el contenido de colesterol y fosfolípidos ventriculares. En un intento por distinguir los cambios puramente relacionados con la edad en los lípidos, se examinaron hámsteres cardiomiopáticos jóvenes (30 días) y viejos (230 días) y normales (RB). Los viejos ventrículos de hámster cardiomiopático contenían más colesterol en base al peso seco y nitrógeno proteico del tejido no conjuntivo que los ventrículos normales a la misma edad. El contenido de fósforo fosfolípido fue menor en el músculo ventricular de los hámsteres miopáticos jóvenes en comparación con los normales de la misma edad, mientras que no hubo diferencias significativas en los animales más viejos. A pesar de la pérdida de función de los viejos corazones miopáticos, la composición de fosfolípidos no se alteró notablemente. El músculo ventricular miopático antiguo contenía un 12% menos de fosfatidil etanolamina y un 14% más de fosfatidil inositol que el tejido normal antiguo. La cardiolipina, un indicador del contenido mitocondrial, no se modificó.


Regulación genética del transporte y metabolismo de lípidos intestinales

Acil-Coenzima A Colesterol Aciltransferasa 2 y Regulación de la Absorción de Colesterol Intestinal

La esterificación del colesterol celular se logra mediante dos enzimas: ACAT1, que se distribuye ampliamente, pero se expresa en niveles bajos en el hígado y el intestino, y ACAT2, que es la enzima responsable de la esterificación del colesterol en estos tejidos (69). Para examinar el papel de ACAT2 en la regulación de la absorción intestinal de colesterol, Repa y colegas (221) generaron ACAT2 - / - ratones y demostró una absorción de colesterol reducida (pero no eliminada), particularmente en el contexto de una mayor ingesta de colesterol en la dieta. Además, la reducción en el ARNm de NPC1L1 observada en animales de tipo salvaje después de la alimentación con colesterol se amplificó en ACAT2 —- ratones, lo que sugiere que la acumulación de colesterol intestinal intracelular libre regulaba aún más la expresión de NPC1L1 más allá de los efectos observados en ratones de tipo salvaje. Además, estos trabajadores demostraron un aumento en la abundancia de ARNm de ABCG5 / G8 en ACAT2 - / - ratones, pero ningún aumento adicional después de la suplementación con colesterol, lo que sugiere que la regulación de la expresión de ABCG5 / G8 en respuesta a la suplementación con esteroles implica ACAT2. Se observó un aumento sorprendente en la expresión del transportador de eflujo basolateral ABCA1 en ACAT2 - / - ratones, y se observó un aumento adicional en la abundancia de ARNm de ABCA1 en ACAT2 - / - ratones alimentados con una dieta alta en colesterol. Estos datos sugieren que la acumulación de colesterol libre en los enterocitos en respuesta a la deficiencia de ACAT2 conduce a una regulación positiva de los mecanismos de salida de colesterol basolateral, aunque aún no se ha identificado la forma de las partículas de lipoproteínas asociadas con esta secreción de colesterol aumentada. Sin embargo, según la información actual, el candidato más probable serían las partículas de HDL formadas por las acciones de ABCA1 y ApoA-I (v. Fig. 67-3).


La proporción de triglicéridos / colesterol HDL. ¿Qué es ideal?

La relación TG / HDL-C se puede calcular fácilmente a partir del perfil de lípidos estándar. Simplemente divida su TG por su HDL-C.

Sin embargo, al buscar la proporción ideal, debe verificar si sus valores de lípidos se proporcionan en mg / dl como en los EE. UU. O mmol / L como en Australia, Canadá y la mayoría de los países europeos.

Si los valores de lípidos se expresan en mg / dl (como en EE. UU.)

La relación TG / HDL-C inferior a 2 es ideal

La relación TG / HDL-C superior a 4 es demasiado alta

La relación TG / HDL-C superior a 6 es demasiado alta

Si usa mmol / L (la mayoría de los países excepto los EE. UU.), Debe multiplicar esta proporción por 0.4366 para alcanzar los valores de referencia correctos. También puede multiplicar su razón por 2.3 y utilice los valores de referencia anteriores.

Si los valores de lípidos se expresan en mmol / L (como en Australia, Canadá y Europa)

La relación TG / HDL-C inferior a 0,87 es ideal

La relación TG / HDL-C superior a 1,74 es demasiado alta

La relación TG / HDL-C por encima de 2,62 es demasiado alta

En este artículo, la relación TG / HDL-C se proporciona como en los EE. UU. (Mg / dl).


Resultados

Perfil clínico, bioquímico e histológico

Se estudiaron un total de 9 sujetos en cada grupo (Tabla 1). Los 3 grupos fueron similares con respecto al género, etnia, edad, índice de masa corporal, azúcar en sangre en ayunas, hemoglobina glicosilada y funciones de síntesis hepática. Los sujetos con NASH tenían niveles más altos de aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa que se acercaron pero no alcanzaron significación. Aunque el colesterol total fue más alto en sujetos con NAFL y NASH que en los controles (PAG & lt 0,05 para ambos), no hubo diferencias significativas en el colesterol de lípidos de alta densidad o el colesterol de lípidos de baja densidad. Los sujetos con NAFL tenían esteatosis aislada (grado medio ± SEM: 2,1 ± 0,6) o esteatosis con inflamación leve (puntuación media de actividad de NAFLD ± SEM: 3,2 ± 0,3), mientras que aquellos con NASH tenían una puntuación media de esteatosis ± SEM de 1,8 ± 0,4 y una puntuación de actividad de NAFLD ± SEM de 5,1 ± 0,4 (PAG & lt 0,03 frente a NAFL).

Parámetro Control (n = 9) NAFL (n = 9) NASH (n = 9)
Género F / M 7/2 6/3 6/3
Caucásico / Afroamericano 7/2 8/1 9/0
Edad media (años) 46.6 ± 3.8 48.5 ± 4.8 47 ± 3.2
IMC (kg / m 2) 34.5 ± 4.3 37.5 ± 5.2 34 ± 1.8
Glucosa en ayunas (mg / dl) 87.5 ± 4.9 119.2 ± 39.6 123.3 ± 29.3
Hemoglobina glicosilada (%) 5.2 ± 0.4 5.8 ± 0.1 5.8 ± 0.1
AST (rango normal: 0-65 U / l) 42 ± 16.6 36.8 ± 5 77.4 ± 14.2
ALT (rango normal: 0-65 U / l) 55.7 ± 27.4 49 ± 10.2 119.4 ± 25.8
Fosfatasa alcalina (U / l) 82.4 ± 9.1 113.4 ± 22.8 111 ± 13.9
Bilirrubina total (mg / dl) 0.6 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.5 ± 0.1
Albúmina (g / dl) 4.1 ± 0.1 4 ± 0.3 4 ± 0.1
Plaquetas (1000 / mm 3) 255.5 ± 27.9 281.3 ± 40.5 233 ± 23.3
Colesterol total (mg / dl) 166.5 ± 10.5 230.6 ± 13.8* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
234 ± 11.2* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
Colesterol HDL (mg / dl) 57.5 ± 8.5 40.2 ± 6.3 50.5 ± 2.1
Colesterol LDL (mg / dl) 87 ± 4 127 ± 22.6 99 ± 3.8
Triglicéridos (mg / dl) 220 ± 22 397.8 ± 135.2 274 ± 19.4
Grado de esteatosis 0 2.1 ± 0.6 1.8 ± 0.4
Puntuación de actividad de NAFLD 0 3.2 ± 0.3 5.1 ± 0.4† † PAG & lt 0,05 frente a NAFL (t prueba).
Etapa de fibrosis 0 1.3 ± 0.3 1.8 ± 0.4
  • Los datos se expresan como la media ± SEM. ALT indica alanina aminotransferasa AST, aspartato aminotransferasa BMI, índice de masa corporal HDL, lípidos LDL de alta densidad, lípidos de baja densidad NAFL, hígado graso no alcohólico NAFLD, enfermedad del hígado graso no alcohólico NASH, esteatohepatitis no alcohólica.
  • * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
  • PAG & lt 0,05 frente a NAFL (t prueba).

Contenido total de lípidos hepáticos (tabla 2)

El contenido total de lípidos hepáticos aumentó notablemente en NAFL y NASH (PAG & lt 0,001) esto se debió principalmente a un mayor contenido de TAG (PAG & lt 0,001). Del mismo modo, el DAG también se incrementó significativamente (PAG & lt 0.03 para NAFL y NASH). En comparación con los controles normales, la relación TAG / DAG (producto / precursor) aumentó significativamente tanto en NAFL como en NASH (7 frente a 26 frente a 31, PAG & lt 0,001 para ambos). El contenido de ácidos grasos n-6 en los lípidos totales aumentó de los controles a NAFL y NASH (media ± SEM: 4131 ± 210 versus 6424 ± 605 versus 8449 ± 1012 nmol / gm, PAG & lt 0.03 para NASH versus los controles) y se asoció con una proporción total n-6: n-3 significativamente mayor en NAFL y NASH (PAG & lt 0,05 para ambos frente a los controles). Sin embargo, el contenido de FFA no aumentó ni en NAFL ni en NASH. Además, hubo un incremento gradual en FC de normal a NAFL a NASH (PAG & lt 0.05 para el control versus NASH). Sin embargo, esto no fue acompañado por un aumento de CE en NAFL o NASH.

Parámetro Control (n = 9) NAFL (n = 9) NASH (n = 9)
Lípidos totales 15,978 ± 1,157 49,991 ± 10,718* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
43,658 ± 6,162* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
SFA total 7,189 ± 586 22,889 ± 5,328* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
18,756 ± 3,003* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
MUFA totales 3,527 ± 258 19,616 ± 4,937 14,819 ± 2,204* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
Total de PUFA 5,104 ± 347 7,328 ± 606* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
9,822.62 ± 1,094* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
Total n-3 949 ± 153 862 ± 49 1,336 ± 180
Total n-6 4,131 ± 210 6,424 ± 605 8,449 ± 1,012* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
relación n-6 / n-3 4.8 ± 0.4 7.6 ± 0.8* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
6.9 ± 0.9* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
FFA 5,533 ± 1,210 5,929 ± 1,487 6,115 ± 584
TROZO DE CUERO 1,922 ± 430 4,946 ± 1,232* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
3,304 ± 473* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
ETIQUETA 13,609 ± 2,300 128,585 ± 34,201* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
104,035 ± 20,451* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
Relación TAG / DAG 7 26* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
31* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
CE 7,589 ± 1,548 8,522 ± 1,846 7,774 ± 808
FC 7,538 ± 718 10,382 ± 1,079 12,862 ± 1,707* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
CL 4,447 ± 620 5,023 ± 585 6,063 ± 902
LYPC 1,936 ± 308 1,800 ± 505 2,239 ± 475* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
ordenador personal 20,321 ± 1,098 15,322 ± 1,247* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
16,874 ± 1,319
EDUCACIÓN FÍSICA 14,599 ± 813 11,456 ± 494* * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).
14,828 ± 1,359
PD 4,114 ± 577 5,295 ± 1,774 4,199 ± 706
SM 4,194 ± 587 3,773 ± 590 5,684 ± 685
  • Todos los valores se expresan como la media (nmol / g de tejido) ± SEM. CE indica éster de colesterol CL, cardiolipina DAG, diacilglicerol FC, colesterol libre FFA, ácido graso libre LYPC, lisofosfatidilcolina MUFA, ácido graso monoinsaturado NAFL, hígado graso no alcohólico NASH, esteatohepatitis no alcohólica PC, fosfatidilcolina PE, ácido poli (fosfatidilcolina) graso etanaturado SFA, ácido graso saturado SM, esfingomielina TAG, triacilglicerol.
  • * PAG & lt 0,05 frente al control (análisis de varianza).

El contenido hepático total de PL no fue significativamente diferente en los 3 grupos (media ± SEM: controles = 49,889 ± 3220 nmol / g de tejido, NAFL = 42,671 ± 3714 nmol / g de tejido y NASH = 49,614 ± 2599 nmol / g de tejido, PAG = no significativo). Sin embargo, a pesar de un aumento significativo en los lípidos totales y FC, el contenido total de PC se redujo (PAG & lt 0,03 para NAFL frente al control). Esto fue acompañado por un aumento de lisofosfatidilcolina (LYPC, es decir, lisolecitina) en sujetos con NASH (PAG & lt 0,05). También hubo una tendencia a la disminución de la EP que fue significativa solo para NAFL (PAG & lt 0,05) en contraste, los niveles de fosfatidilserina (PS) permanecieron sin cambios. Aunque el contenido hepático de esfingomielina (SM) y CL aumentaron, no alcanzaron niveles de significación.

Composición de ácidos grasos de los AGL hepáticos (Cuadro 3 de AGL)

Hubo una tendencia a una disminución progresiva de los controles a NAFL y luego NASH para los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) n-6 y n-3 dentro de los FFA hepáticos. El contenido de ácido linoleico (18: 2n-6), el punto de partida para el procesamiento de ácidos grasos esenciales (AGE) n-6, 18 no se alteró tanto en NAFL como en NASH. Sin embargo, hubo una tendencia hacia el agotamiento progresivo del ácido γ-linolénico (18: 3n-6), que está inmediatamente aguas abajo del ácido linoleico, 18, 19 desde el control hasta NAFL y NASH (PAG & lt 0,01 frente a NASH). Esto también se observó con el ácido araquidónico (20: 4-n6), que está más abajo del ácido γ-linolénico, con una disminución significativa de NASH (PAG & lt 0,05 frente a los controles). La relación producto / precursor para la vía n-6 (20: 4n-6: 18: 2n-6) tuvo una tendencia a la baja, alcanzando significancia para NASH (PAG & lt 0,03 frente a los controles). Los niveles de ácido hidromiel (20: 3n-9), que típicamente aumentan en la deficiencia de EFA, 20 permanecieron inalterados en NAFL y NASH.

Ácido graso Control (n = 9) NAFL (n = 9) NASH (n = 9)
14:0 6.6 ± 1.5 5.4 ± 0.9 5.9 ± 0.7
15:0 1.6 ± 0.3 1.2 ± 0.2 1.6 ± 0.1
16:0 30 ± 0.7 31.5 ± 1.6 32.3 ± 1.2
18:0 19.6 ± 0.9 16.8 ± 2.6 19 ± 1.8
16: 1n-7 1.6 ± 0.2 2.4 ± 0.3 2 ± 0.3
18: 1n-7 1.8 ± 0.3 1.8 ± 0.3 1.8 ± 0.3
18: 1n-9 15.8 ± 0.8 19.2 ± 1.9 17.5 ± 1.4
24: 1n-9 1.2 ± 0.3 1 ± 0.3 1.1 ± 0.1
18: 2n-6 7.5 ± 0.8 8.2 ± 1.4 8.3 ± 0.8
18: 3n-6 1.1 ± 0.4 0.5 ± 0.2 0.2 ± 0.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
20: 4n-6 4.9 ± 0.8 4 ± 1.1 3.1 ± 0.4* * PAG & lt 0,05 frente al control.
20: 5n-3 0.4 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1
22: 6n-3 1.3 ± 0.3 1.1 ± 0.3 0.8 ± 0.2
SFA 59.3 ± 1.9 56.4 ± 2.4 60.4 ± 1.9
MUFA 22.2 ± 1.1 26.2 ± 1.7 24.2 ± 1.8
PUFA 18.4 ± 1.8 17.4 ± 1.7 15.3 ± 1.1
LCPUFA 6.6 ± 1.1 5.4 ± 1.4 4.1 ± 0.6* * PAG & lt 0,05 frente al control.
n-3 PUFA 3.2 ± 0.5 2.9 ± 0.3 2.2 ± 0.4
n-6 PUFA 15.1 ± 1.5 14.3 ± 1.5 12.9 ± 0.8
relación n-6 / n-3 5.3 ± 0.8 5.1 ± 0.4 6.7 ± 0.8* * PAG & lt 0,05 frente al control.
† † PAG & lt 0.05 versus NAFL (análisis de varianza).
Relación 20: 4n-6/18: 2n-6 0.7 ± 0.1 0.6 ± 0.2 0.4 ± 0.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
Relación 20: 5n-3/18: 3n-3 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.3 ± 0.1
  • Todos los valores son la media (% en moles) ± SEM. FFA indica ácidos grasos libres LCPUFA, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (suma de 20: 4n-6, 20: 5n-3 y 22: 6n-3) MUFA, ácidos grasos monoinsaturados NAFL, hígado graso no alcohólico NASH, esteatohepatitis PUFA no alcohólica , ácido graso poliinsaturado SFA, ácido graso saturado.
  • * PAG & lt 0,05 frente al control.
  • PAG & lt 0.05 versus NAFL (análisis de varianza).

El ácido α-linolénico (18: 3n-3), el punto de partida para procesar n-3 EFA, 18 no se alteró. Hubo una tendencia a una disminución progresiva de los controles a NAFL a NASH para el ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) y el ácido docosahexanoico (22: 6n-3), los productos posteriores del ácido α-linolénico (18: 3n-3 ), que se acercó pero no alcanzó importancia en EHNA. La relación producto / precursor para la vía n-3 (20: 5n-3: 18: 3n-3) también tuvo una tendencia a la baja, acercándose a la importancia para NASH.

Composición de ácidos grasos de DAG y TAG hepáticos

Tanto DAG como TAG aumentaron significativamente en sujetos con NAFL y NASH (Fig. 1A). Hubo una tendencia al aumento de ácidos grasos saturados (SFA) en DAG y TAG, esto fue impulsado por un aumento de palmitato (16: 0) pero compensado por una disminución de ácido esteárico (18: 0). También hubo una tendencia al aumento de ácidos grasos monoinsaturados (MUFAs Fig. 1B), específicamente ácido oleico (18: 1-n9), en DAG y TAG tanto para NAFL como NASH.

Composición de lípidos hepáticos en sujetos con síndrome metabólico e histología hepática normal (controles, n = 9), hígado graso no alcohólico (NAFL, n = 9) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH, n = 9). (A) Distribución de clases de lípidos dentro de los lípidos hepáticos. los X El eje representa las clases de lípidos de ácidos grasos libres (FFA), diacilglicerol (DAG) y triacilglicerol (TAG). los y Los ejes representan el contenido de lípidos en los 3 grupos de estudio (nmol / g de tejido), con FFA y DAG mostrados a la izquierda y eje y TAG a la derecha y eje. NAFL y NASH habían aumentado significativamente el DAG hepático (PAG & lt 0.05) y TAG (PAG & lt 0,002). El contenido de FFA no cambió en ninguno de los grupos. (B) Hubo una tendencia de aumento en el porcentaje molar de ácidos grasos saturados (SFA) y ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) dentro de TAG tanto en NAFL como en NASH. Sin embargo, el contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de TAG se redujo significativamente en NAFL y NASH (PAG & lt 0,01). (C) Ambos n-3 (izquierda y eje) y n-6 (derecha y eje) Los PUFA disminuyeron significativamente en NAFL y NASH (PAG & lt 0,02). (D) La relación n-6: n-3 fue significativamente mayor en NAFL y NASH (PAG & lt 0.01 para ambos). (E, F) Se grafican los cambios relativos del control (mostrados como 100%). El ácido araquidónico (20: 4n-6), el ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) y el ácido docosahexanoico (22: 6n-3) se redujeron significativamente tanto en NAFL como en NASH. (B-F) Los datos que se muestran son datos de porcentaje en moles (porcentaje de cada ácido graso del total de ácidos grasos dentro de cada clase de lípidos) dentro de la clase TAG. Todos los valores se expresan como la media ± SEM. *PAG & lt 0,05 frente a los controles. Las barras huecas representan los controles, las barras sólidas representan NAFL y las barras inclinadas representan NASH.

Por el contrario, hubo una disminución significativa de PUFA asociado con DAG y TAG en NAFL y NASH (Fig. 1B). Los porcentajes molares de ácidos grasos n-3 y n-6 en TAG disminuyeron tanto en NAFL como en NASH (Figura 1C), sin embargo, la disminución en n-6 fue menor que en los ácidos grasos n-3, lo que resultó en una aumento neto significativo en las proporciones de ácidos grasos n-6: n-3 en TAG (Fig. 1D). Hubo una reducción significativa del ácido araquidónico (20: 4n-6), un ácido graso clave n-6 (Fig. 1E). Además, el ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) y el ácido docosahexanoico (22: 6n-3), los 2 productos posteriores del ácido α-linolénico (18: 3n-3) en la vía n-3, se agotaron significativamente (Fig. . 1F). Estos cambios fueron cualitativamente similares a los cambios observados en los grupos FFA y DAG.

Composición de ácidos grasos hepáticos CE

El contenido de CF hepático aumentó progresivamente de los controles con histología normal a NAFL a NASH (PAG & lt 0,05 para NASH frente al control Fig. 2A). Sin embargo, el contenido total de CE no cambió significativamente ni en NAFL ni en NASH. Hubo un enriquecimiento de SFA y un aumento leve e insignificante de MUFA, específicamente ácido oleico. Hubo un enriquecimiento significativo de los CE con PUFA (Fig. 2B, C). Tanto los PUFA n-6 como los n-3 aumentaron en NAFL y NASH, pero los hallazgos fueron significativos solo para los ácidos grasos n-6 (Fig. 2C). La relación global n-6: n-3 no cambió significativamente (Fig. 2D). Aunque el ácido linoleico (18: 2n-6) se enriqueció particularmente dentro de las CE tanto en NAFL como en NASH, los niveles de ácido araquidónico no se alteraron significativamente (Fig. 2E).Aunque hubo una tendencia a un aumento del ácido docosahexanoico (22: 6n-3) en la EHNA, esto no alcanzó significación (Fig. 2F).

Composición del colesterol hepático en los controles (n = 9), hígado graso no alcohólico (NAFL n = 9) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH n = 9). Las partes B-F reflejan cambios dentro de la clase de ésteres de colesterol (CE) y provienen de los datos de porcentaje en moles (porcentaje de cada ácido graso del total de ácidos grasos dentro de cada clase de lípidos). (A) Distribución de CE y colesterol libre (FC) dentro de los lípidos hepáticos. Hubo un aumento gradual en el contenido de CF hepático de los controles a NAFL a NASH (PAG & lt 0.05, NASH versus el control). El contenido de CE fue comparable en los 3 grupos. (B) La CE hepática se redujo significativamente en ácidos grasos saturados (AGS PAG & lt 0.02) y enriquecido con ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs PAG & lt 0.01) tanto en NAFL como NASH. (C) Aunque ambos n-3 (izquierda y eje) y n-6 (derecha y eje) Los PUFA aumentaron en NAFL y NASH, fue significativo solo para n-6 (PAG & lt 0,02). (D) La relación n-6: n-3 no fue significativamente diferente entre los 3 grupos. (E, F) Se grafican los cambios relativos del control (mostrados como 100%). El contenido de ácido linoleico (18: 2n-6) fue significativamente mayor (PAG & lt 0,01), con una tendencia a una disminución del ácido araquidónico (20: 4n-6) y una tendencia a un aumento del ácido docosahexanoico (22: 6n-3) tanto en NAFL como en NASH. Todos los valores se expresan como la media ± SEM. *PAG & lt 0,05 frente a los controles. Las barras huecas representan los controles, las barras sólidas representan NAFL y las barras inclinadas representan NASH.

Composición de ácidos grasos de los PL hepáticos

El contenido total de PC en el hígado disminuyó tanto en NAFL como en NASH, pero no se observaron cambios significativos en PS o CL (Fig. 3A, B). Hubo un aumento correspondiente en LYPC (PAG & lt 0,05 para NASH frente al control Fig. 3A). Los porcentajes molares de SFA, MUFA y PUFA se mantuvieron sin cambios en PC (Fig. 3C). Tampoco hubo cambios significativos en los ácidos grasos n-6 o n-3 totales en CP (Fig. 3D). Aunque el contenido de ácido linoleico n-6 EFA (18: 2n-6) no se alteró, hubo una disminución progresiva escalonada en el ácido araquidónico (20: 4n-6) que fue significativa para NASH (PAG & lt 0,05 frente a los controles Fig. 3E). La disminución resultante en la relación producto / precursor para la vía n-6 (20: 4n-6: 18: 2n-6) alcanzó significación para NASH (PAG & lt 0,01 frente a los controles).

Composición de fosfolípidos hepáticos en controles (n = 9), hígado graso no alcohólico (NAFL n = 9) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH n = 9). Las partes C-F muestran cambios dentro de la fosfatidilcolina (PC) basados ​​en datos de porcentaje molar (porcentaje de cada ácido graso del total de ácidos grasos dentro de cada clase de lípidos). (A) El contenido de PC en el hígado se redujo tanto en NAFL como en NASH. Esto se asoció con un aumento significativo de lisofosfatidilcolina (LYPC PAG & lt 0,05) y una tendencia de aumento de la esfingomielina hepática (SM derecha y eje) solo en NASH. (B) No se observaron cambios significativos en la fosfatidilserina (PS) y las cardiolipinas (CL), con una disminución de la fosfatidiletanolamina (PE) en la NAFL. (C) No se encontraron alteraciones en los contenidos de ácidos grasos saturados (SFA), ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) del PC hepático. (D) El n-3 (izquierda y eje) y n-6 (derecha y eje) Los PUFAs se mantuvieron sin cambios en NAFL y NASH. (E, F) Se grafican los cambios relativos de los controles (mostrados como 100%). El ácido araquidónico (20: 4n-6) en la PC hepática se redujo significativamente en NASH (PAG & lt 0,01). También hubo una tendencia a una disminución en el ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) y el ácido docosahexanoico (22: 6n-3) tanto en NAFL como en NASH. Todos los valores se expresan como la media ± SEM. *PAG & lt 0,05 frente a los controles. Las barras huecas representan los controles, las barras sólidas representan NAFL y las barras inclinadas representan NASH.

El contenido de ácido α-linolénico (18: 3n-3) de PC no cambió en NAFL y NASH (Fig. 3F). Sin embargo, hubo una tendencia a la disminución de productos de ácidos grasos n-3 aguas abajo, específicamente ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) y ácido docosahexanoico (22: 6n-3). Esta tendencia estaba en consonancia con el perfil observado en TAG y DAG y en el grupo de FFA en el hígado. Además, de acuerdo con el perfil observado en estas clases de lípidos, hubo una tendencia progresiva, pero no significativa, de un aumento en la relación total n-6: n-3 en CP de 6,7 en controles normales a 7,6 en NAFL y 8,5 en NASH.

Cambios en los ácidos grasos esenciales n-6 y n-3

El porcentaje molar de ácido graso n-6 se redujo en FFA, DAG y TAG, pero alcanzó significación solo para TAG en NAFL y NASH (Tabla 4). El ácido araquidónico (20: 4n-6) se redujo relativamente de la mayoría de las clases de lípidos. Específicamente, hubo un 31% y 36% de disminución en el contenido de ácido araquidónico (20: 4n-6) de PC (PAG & lt 0.03) y DAG (PAG = no significativo) en NASH, respectivamente, las principales fuentes de su liberación para la síntesis de prostaglandinas inflamatorias. 21 Esta disminución se observó a pesar de que no hubo cambios significativos en su precursor ácido linoleico (18: 2n-6) en ninguna de estas clases.

Clase de lípidos n-3 PUFA n-6 PUFA Relación n-6: n-3
Control NAFL NASH Control NAFL NASH Control NAFL NASH
FFA 3.1 ± 0.5 2.8 ± 0.3 2.2 ± 0.4 15.1 ± 1.5 14.3 ± 1.5 12.9 ± 0.8 5.2 ± 0.8 5.1 ± 0.4 6.7 ± 0.8* * PAG & lt 0,05 frente al control.
† † PAG & lt 0.05 versus NAFL (análisis de varianza).
TROZO DE CUERO 4.0 ± 1.3 2.1 ± 0.4 2.1 ± 0.4 17.5 ± 1.9 11.8 ± 1.2* * PAG & lt 0,05 frente al control.
16.1 ± 0.6 6 ± 0.9 6.4 ± 1.2 10.3 ± 2.5
ETIQUETA 1.9 ± 0.3 0.6 ± 0.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
1.2 ± 0.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
18.8 ± 0.7 10.8 ± 1.7* * PAG & lt 0,05 frente al control.
15.5 ± 1.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
10.2 ± 0.9 16.1 ± 1.4* * PAG & lt 0,05 frente al control.
13.2 ± 0.8* * PAG & lt 0,05 frente al control.
CE 1.5 ± 0.4 2.2 ± 0.2 2.7 ± 0.5 17.4 ± 1.9 28.2 ± 4.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
26.3 ± 2.8* * PAG & lt 0,05 frente al control.
16 ± 3.1 13.5 ± 2.4 12.8 ± 2.6
CL 6.4 ± 0.7 5.6 ± 0.5 8 ± 2.1 32.8 ± 3.5 29.3 ± 3.4 29.9 ± 1.8 5.4 ± 0.7 5.4 ± 0.5 5.6 ± 1.3
LYPC 2.5 ± 0.5 2.8 ± 0.3 2.8 ± 0.3 10.8 ± 1.2 12.9 ± 0.9 12.4 ± 0.9 5.5 ± 1 4.7 ± 0.4 4.85 ± 0.6
ordenador personal 5.6 ± 0.8 4.5 ± 0.4 4.8 ± 0.6 34.5 ± 0.8 32.5 ± 1.7 33.9 ± 0.9 6.7 ± 0.7 7.6 ± 0.8 8.5 ± 1.6
EDUCACIÓN FÍSICA 12.9 ± 1.4 11 ± 1.1 12 ± 1.2 32.8 ± 1.3 33.3 ± 1.5 31.3 ± 1.3 2.8 ± 0.4 3.2 ± 0.3 2.9 ± 0.4
PD 8.6 ± 1.9 8.7 ± 1.5 8.6 ± 1.1 18.3 ± 2.3 20.1 ± 2.8 16.6 ± 1.5 3.5 ± 1.2 2.4 ± 0.2 2 ± 0.1
SM 3.2 ± 0.3 2.3 ± 0.6 2.8 ± 0.6 11.1 ± 0.8 10.6 ± 1.4 10.2 ± 1.3 3.5 ± 0.1 5.8 ± 1.3 4.8 ± 0.9
Ácido araquidónico (20: 4n-6) Ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) Ácido docosahexanoico (22: 6n-3)
FFA 4.8 ± 0.8 4 ± 1.1 3.1 ± 0.3* * PAG & lt 0,05 frente al control.
0.41 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.3 ± 0.3 1.1 ± 0.3 0.8 ± 0.2
TROZO DE CUERO 4.8 ± 1 2.2 ± 0.5 3.1 ± 0.5 0.22 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.1 ± 0.3 0.6 ± 0.2 0.7 ± 0.2
ETIQUETA 1.3 ± 0.2 0.3 ± 0.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
0.3 ± 0.1* * PAG & lt 0,05 frente al control.
0.14 ± 0.04 0.02 ± 0.01* * PAG & lt 0,05 frente al control.
0.05 ± 0.02* * PAG & lt 0,05 frente al control.
0.5 ± 0.1 0.06 ± 0.01* * PAG & lt 0,05 frente al control.
0.2 ± 0.05* * PAG & lt 0,05 frente al control.
CE 4.2 ± 0.4 3.9 ± 0.7 3.2 ± 0.4 0.24 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.6 ± 0.2 1.0 ± 0.4
CL 7.6 ± 0.5 7.4 ± 1.0 6.3 ± 0.4 0.17 ± 0.03 0.3 ± 0.1 0.3 ± 0.1 5 ± 0.7 4.1 ± 0.4 5.5 ± 1.9
LYPC 4.6 ± 0.9 5.7 ± 0.8 4.5 ± 0.7 0.21 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.3 ± 0.3 1.4 ± 0.3 1.6 ± 0.3
ordenador personal 12.3 ± 1.2 9.5 ± 1.1 8.5 ± 0.6* * PAG & lt 0,05 frente al control.
1.0 ± 0.3 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.1 3.5 ± 0.5 2.5 ± 0.2 2.9 ± 0.5
EDUCACIÓN FÍSICA 22.4 ± 1.1 21.0 ± 1.4 18.8 ± 0.8 0.6 ± 0.2 0.8 ± 0.2 0.9 ± 0.3 10.8 ± 1.4 8.5 ± 0.9 9.5 ± 1.3
PD 10.3 ± 2.2 11.2 ± 2.4 8.8 ± 1 0.4 ± 0.1 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1 6.3 ± 1.5 6.2 ± 1.5 6.6 ± 1.0
SM 3.6 ± 0.4 3.2 ± 0.7 2.7 ± 0.6 0.2 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.5 ± 0.5 1.4 ± 0.4 1.5 ± 0.5
  • Todos los valores son la media (% en moles) ± SEM. CE indica éster de colesterol CL, cardiolipina DAG, diacilglicerol FFA, ácido graso libre LYPC, lisofosfatidilcolina NAFL, hígado graso no alcohólico NASH, esteatohepatitis no alcohólica PC, fosfatidilcolina PE, fosfatidiletanolamina PUFA, poliinsaturado graso PSseromialglicerina.
  • * PAG & lt 0,05 frente al control.
  • PAG & lt 0.05 versus NAFL (análisis de varianza).

El porcentaje molar de ácidos grasos n-3 disminuyó en FFA, DAG, TAG y PC en NASH pero fue significativo solo para TAG (Tabla 4). El ácido eicosapentanoico (20: 5n-3) y el ácido docosahexanoico (22: 6n-3) se agotaron significativamente en TAG y se observó una tendencia de agotamiento en FFA, DAG y, en menor grado, PC. Estos cambios se produjeron a pesar del contenido inalterado del precursor n-3 EFA ácido α-linolénico (18: 3n-3). Hubo una tendencia a un aumento en la relación n-6: n-3 en varias clases de lípidos, pero alcanzó significación solo para FFA (28% NASH versus ambos grupos, PAG & lt 0.05) y TAG (57% NAFL y 29% NASH, versus el control, PAG & lt 0,05). Los PUFA de cadena larga (suma de 20: 4n-6, 20: 5n-3 y 22: 6n-3) se redujeron significativamente en NASH (PAG & lt 0.05 versus el control) dentro de FFA.


3 RESULTADOS

3.1 Diferencias en el perfil del proteoma entre tejidos tumorales de CHC impulsados ​​por NAFLD y tejidos adyacentes no tumorales

En total, se identificaron y cuantificaron 1965 proteínas (Tabla S5). Para evitar un posible sesgo de identificación errónea, nos centramos en 238 proteínas que se identificaron en todas las muestras. Se generó un diagrama de volcán para mostrar la distribución de expresión diferencial (Figura 1A). Entre las 238 proteínas, 100 proteínas presentaron una expresión diferencial significativa entre los tejidos de HCC y los tejidos adyacentes no tumorales (PAG & lt .05) (Tabla S6). Aquí, 65 proteínas fueron reguladas positivamente y 35 proteínas fueron reguladas negativamente en el HCC. El análisis de la vía indicó que las principales vías enriquecidas incluían la cetogénesis, la vía I del mevalonato y la degradación de la isoleucina I (Figura 1B y Tabla S7). Las proteínas alteradas significativas se analizaron utilizando el sistema de clasificación PANTHER (http://pantherdb.org/). 22 La mayoría de las proteínas pertenecían a componentes celulares (58,68%), poseían actividad catalítica (45,33%) y estaban implicadas en procesos metabólicos (31,77%) (Figura S1). El análisis de la vía fue consistente con los hallazgos de un informe anterior de un aumento del proceso de glucólisis y una disminución del proceso de beta-oxidación de ácidos grasos. Además, nuestros resultados de proteómica fueron comparables con los de un estudio anterior, lo que indica que existía una diferencia de mecanismo potencial entre el CHC asociado con NAFLD y otros tipos de CHC. 23-25 ​​Los resultados de la proteómica del carcinoma hepatocelular en estadio temprano mostraron que el carcinoma hepatocelular estaba relacionado con la infección por el virus de la hepatitis B (VHB-HCC) y con una alteración de la homeostasis del colesterol, acompañada de una alta expresión de esterol. O-aciltransferasa 1 (SOAT1). 23 No obstante, nuestro estudio sugirió que las diferencias en la expresión de proteínas entre los tejidos de CHC impulsados ​​por NAFLD y los tejidos adyacentes no tumorales se centraron principalmente en la cetogénesis. Esta diferencia sugirió que se deberían aplicar diferentes diagnósticos y estrategias terapéuticas a diferentes tipos de CHC.

3.2 VDAC1 está desregulado en el HCC impulsado por NAFLD y asociado con NAFLD

Para priorizar los genes asociados con NAFLD, se realizó un análisis de asociación de todo el transcriptoma en cepas de ratones BXD. Se calculó la correlación entre el porcentaje de masa de grasa corporal y las transcripciones de 100 proteínas candidatas. Entre todos los candidatos, VDAC1 presentó una correlación significativa con el porcentaje de masa grasa corporal (R = 0.469, PAG = .008) (Figura 1C y Tabla S1). Para confirmar aún más la asociación entre VDAC1 y NAFLD, se evaluó la correlación entre VDAC1 y una serie de fenotipos de enfermedad del hígado graso tanto a nivel de transcripción como de péptido. Los fenotipos incluyeron masa grasa corporal, peso corporal, masa hepática, masa adiposa blanca, colesterol en plasma, glucosa basal en plasma en ayunas y área bajo curva de glucosa en una prueba de tolerancia oral a la glucosa (AUC de glucosa en OGTT) (Figura 1E y Tabla S2). Los resultados sugirieron que tanto los niveles de expresión de genes como de proteínas de VDAC1 estaban correlacionados con los rasgos de NAFLD.

Se validó aún más la desregulación de VDAC1 en HCC. Nuestros resultados proteómicos sugirieron un aumento de 3,3 veces en VDAC1 en tejidos de HCC. Este resultado se validó mediante una transferencia de Western (Figuras 1D y S2) y se confirmó además en una cohorte clínica externa. En la cohorte LIHC del Atlas del genoma del cáncer (TCGA), los niveles de expresión de Vdac1 se regularon positivamente en los tejidos de HCC en comparación con los tejidos no tumorales (Normal norte = 50, tumor norte = 371, PAG & lt .0001) (Figura 2A) y aumentó al aumentar el grado del tumor (Figura 2B). Además, la expresión de VDAC1 de alto nivel se correlacionó con un resultado clínico deficiente (alto, norte = 91 Bajo, norte = 91 PAG = .013) (Figura 2C). En conjunto, estos resultados indicaron que VDAC1 se asoció con NAFLD y CHC impulsado por NAFLD desregulado.

3.3 Análisis genético del sistema de Vdac1 en cepas de ratones BXD

A continuación, se realizó un análisis genético del sistema para revelar la regulación de la expresión de VDAC1. Se examinaron los niveles de expresión génica de VDAC1 en tejido hepático 39 cepas de ratón BXD y sus correspondientes cepas parentales. Solo hubo 1 conjunto de sondas (10 375 941) que se dirigieron al primer exón del Vdac1 gen en la matriz Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST. La expresión de Vdac1 varió ampliamente entre las cepas de BXD con un cambio de 1,41 veces (Figura 3A). La expresión promedio de Vdac1 en todas las cepas de BXD fue 12,12 ± 0,02 (log2 escala, media ± error estándar de la media (SEM)). La cepa con mayor nivel de expresión fue BXD45, mientras que la cepa con menor expresión fue BXD61. Para identificar variantes de secuencia que afectaron la expresión de Vdac1 en hígado de ratón, realizamos un mapeo de intervalo simple para Vdac1 en todo el genoma del ratón. Se identificó una expresión significativa QTL (eQTL) en el cromosoma 11 a 52,01 Mb con una LRS de 18,3, y que estaba cerca de la ubicación física de Vdac1 en el cromosoma 11 a 52,36 Mb (Figura 3B y Tabla S8). Además, también identificamos 4 eQTL sugerentes ubicados en otros cromosomas (Figura 3B y Tabla 2). Estos resultados indicaron que el Vdac1 El nivel de ARNm fue tanto cis- y trans-regulado, simultáneamente. Para los otros 4 trans-eQTL, recuperamos un total de 361 genes codificadores de proteínas de su intervalo de confianza de 1,5 LOD (Tabla 2). Entre ellos, 18 genes se correlacionan significativamente con el nivel de expresión de Vdac1 (Tabla 2). A partir de los datos del proteoma hepático, había 20 proteínas VDAC1 dirigidas a péptidos. Para evaluar la correlación entre las transcripciones de Vdac1 y los péptidos, se realizó un análisis de correlación. Entre los 20 péptidos, se enumeraron los 5 péptidos principales más correlacionados con la transcripción de VDAC1, Péptido 3 (R = 0,458, PAG = .005), Péptido 10 (R = 0.472, PAG = .004), Péptido 14 (R = 0.493, PAG = .002), Péptido 15 (R = 0.437, PAG = .008) y Péptido 19 (R = 0.496, PAG = .002) (Figura S3 y Tabla S4). Por lo tanto, se eligieron los péptidos 3, 10, 14, 15, 19 para representar la proteína VDAC1 para un análisis adicional.

Chr Comienzo Fin LRS Marcador # de gen Genes correlacionados con Vdac1
2 98 107 16.263 rs33188980 87 Tcp11l1 Apip Cd59a Cd59b Lmo2 Ldlrad3 Eif3m Qser1
5 132 136 14.215 rs36653585 66 Lat2 Limk1 Mdh2
14 73 100 12.941 151 Klf5 Rcbtb2 Tpt1 Mzt1 Sucla2 Esd
X 64 72 16.188 rs33876026 57 Prrg3

3.4 La red de coexpresión génica y el análisis de enriquecimiento de funciones indicaron que VDAC1 está asociado con la disfunción de las mitocondrias

Para explorar el mecanismo potencial de VDAC1 involucrado en HCC impulsado por NAFLD, el Vdac1 Se implementaron redes de coexpresión génica y análisis de enriquecimiento funcional. Con el objetivo de identificar Vdac1 genes implicados en módulos de genes, las sondas filtradas se enviaron al paquete WGCNA 18 para construir redes de coexpresión de genes. La potencia de umbral suave β (8) se eligió en función de los criterios de topología sin escala (Figura 4A, B). Utilizando este poder de umbral suave, identificamos 35 módulos de coexpresión distintos a los que se asignaron diferentes colores. Vdac1 estaba ubicado en el módulo verde que contiene 589 genes (Figura 4C y Tabla S9). Para verificar la participación del módulo verde en los procesos biológicos, realizamos análisis de enriquecimiento GO y KEGG utilizando el kit de herramientas en línea WebGestalt. Encontramos que este módulo se enriqueció significativamente en procesos biológicos como el proceso de oxidación-reducción, la muerte celular y la vía de señalización apoptótica (Tabla 3). Este módulo verde también se enriqueció en varias vías de KEGG, incluida la fosforilación oxidativa, NAFLD y el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA) (Tabla 3). El análisis reveló que Vdac1 y sus genes coexpresados ​​presentes en el mismo módulo estaban involucrados en funciones biológicas como el metabolismo energético y la enfermedad hepática (NAFLD). Además, el análisis de la vía utilizando IPA mostró que la vía de disfunción mitocondrial era la vía enriquecida superior (Figura 5A y Tabla S10) y que 20 proteínas de la membrana interna mitocondrial estaban involucradas en esta vía, que mostró correlación con Vdac1 (Figura 5B y Tabla S11).

Término Descripción No. de genes PAG-valor FDR
GO: proceso biológico
IR: 0055114 Proceso de oxidación-reducción 54 4.89E-10 4.08E-06
IR: 0045333 Respiración celular 18 4.17E-09 1.74E-05
IR: 0006091 Generación de metabolitos precursores y energía. 24 6.68E-08 1.85E-04
IR: 0015980 Derivación energética por oxidación de compuestos orgánicos 20 2.06E-07 2.86E-04
IR: 0007005 Organización de la mitocondria 29 4.36E-06 2.45E-03
IR: 0008219 Muerte celular 67 4.42E-06 2.45E-03
IR: 0097190 Vía de señalización apoptótica 30 5.72E-06 2.75E-03
IR: 0006915 Proceso apoptótico 62 1.04E-05 3.61E-03
IR: 0012501 Muerte celular programada 62 1.63E-05 4.84E-03
IR: 0006099 Ciclo del ácido tricarboxílico 6 3.27E-05 7.79E-03
Vías KEGG
mmu00190 Fosforilación oxidativa 22 2.17E-12 6.49E-10
mmu05012 Enfermedad de Parkinson 21 7.31E-11 1.09E-08
mmu05010 enfermedad de Alzheimer 21 2.91E-09 2.90E-07
mmu05016 enfermedad de Huntington 21 1.88E-08 1.40E-06
mmu01100 Vías metabólicas 61 8.03E-07 4.80E-05
mmu04932 Enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) 16 1.60E-06 7.98E-05
mmu01200 Metabolismo del carbono 13 8.85E-06 3.78E-04
mmu00020 Ciclo de citrato (ciclo de TCA) 6 1.34E-04 5.02E-03
mmu04142 Lisosoma 10 1.23E-03 4.09E-02
mmu00010 Glucólisis / Gluconeogénesis 7 1.39E-03 4.16E-02

3.5 VDAC1 se correlaciona con el cambio de perfil de cardiolipina (CL)

Para comprender mejor cómo VDAC1 se asoció con la disfunción mitocondrial, investigamos la asociación entre VDAC1 y los lípidos de la membrana mitocondrial. CL fue el fosfolípido característico del IMM, que desempeña un papel importante en el mantenimiento de la estructura y función de las mitocondrias. 26, 27 Se realizó un análisis de asociación gen-lipidoma entre VDAC1 y 22 especies de lípidos de la clase CL. Los niveles de expresión del transcrito de VDAC1 y los péptidos tenían una correlación negativa con las CL maduras, CL (LLLL) y su precursor MLCL (LLL) (Figura 5C y Tabla S3). Por el contrario, VDAC1 tenía una correlación positiva con el panel de CL nacientes (Figura 5C y Tabla S3), por lo que planteamos la hipótesis de que VDAC1 se asoció con el deterioro de la remodelación de CL. Por lo tanto, calculamos la proporción de CL nacientes / CL de especies maduras CL (LLLL) para cada especie de CL naciente que es el sello distintivo de la remodelación de CL. VDAC1 se correlacionó positivamente con 17 de las 18 relaciones nacientes / maduras (Tabla S12). Además, la correlación significativa entre VDAC1 y cardiolipina sintetasa PTPMT1 y TAZ se confirmó en la cohorte de ratones BXD con (R = 0.452, PAG = .003 R = 0.334, PAG = .033) (Figura 5D y Tabla S13). VDAC1 se correlacionó con la síntesis de CL y la remodelación de CL, lo que podría dañar la estabilidad de la estructura de la membrana interna mitocondrial al cambiar los componentes de CL y, finalmente, causar una disfunción mitocondrial.

3.6 Análisis de la función mitocondrial con o sin expresión de VDAC1 en Hep3B y HepG2

Para identificar aún más si la sobreexpresión de VDAC1 atenúa la función mitocondrial o no, realizamos experimentos patológicos y biológicos. Los resultados del análisis inmunohistoquímico sugirieron que la expresión de VDAC1 se elevó en los tejidos de CHC impulsados ​​por NAFLD en comparación con la de los tejidos adyacentes no tumorales (Figura 6E). Para ilustrar los efectos de VDAC1 sobre la función mitocondrial, se aplicaron células HCC (HepG2 y Hep3B) para derribar o sobreexpresar VDAC1. Mientras tanto, también aplicamos un inhibidor para reducir la función de VDAC1. La reducción y sobreexpresión de VDAC1 se determinaron mediante transferencia Western (Figura 6A). Después del agotamiento de VDAC1 en las células de HCC, la función respiratoria mitocondrial mejoró significativamente en comparación con el grupo de sobreexpresión de VDAC1 (Figura 6D). Además, la sobreexpresión de VDAC1 afectó significativamente la respiración mitocondrial, con inhibición de las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en la respiración basal (Figura 6D). La IMM con abundantes enzimas respiratorias jugó un papel importante en la respiración mitocondrial. Además, la membrana interna es rica en un fosfolípido inusual, la cardiolipina. Posteriormente, las cardiolipinas se cuantificaron mediante un kit de sonda fluorométrica y tinción con NAO. El contenido de cardiolipina disminuyó por la sobreexpresión de VDAC1 en las líneas celulares HepG2 y Hep3B. Por el contrario, la disminución de VDAC1 provocó un aumento en el contenido de cardiolipina (Figura 6B, C). Estos datos revelaron un papel importante de la sobreexpresión de VDAC1 en la disminución de la función mitocondrial.

3.7 Red de correlación de transcripción-lípidos-fenotipos centralizada de VDAC1

Para ilustrar mejor la asociación de VDAC1 con los fenotipos de NAFLD a través del perfil de CL, se generó una red de correlación de fenotipos de lípidos de transcripción centralizada de VDAC1 para proporcionar una referencia para estudios futuros (Figura 7A y Tablas S2-S4). En resumen, nuestro estudio indicó que VADC1 se asoció con NAFLD y la desregulación de VDAC1 en HCC impulsado por NAFLD a través de la disfunción mitocondrial y regulando las proteínas de la membrana mitocondrial y el cambio de composición de la cadena de acilo CL (Figura 7B).


INTRODUCCIÓN

Las GTPasas de la superfamilia de dinamina catalizan múltiples eventos de remodelación de la membrana en la célula eucariota, incluidos los de división y fusión de orgánulos (Praefcke y McMahon, 2004 Heymann y Hinshaw, 2009). La proteína 1 relacionada con la dinamina (Drp1), un miembro citosólico de esta extensa superfamilia, establece el equilibrio crítico de la división y fusión mitocondrial al catalizar la fisión de la membrana mitocondrial (Chan, 2012). En respuesta a una variedad de señales fisiológicas, Drp1 se transloca a la superficie de la membrana externa mitocondrial (MOM) para iniciar los eventos de remodelación de la membrana que culminan en la división mitocondrial. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos apenas comienzan a comprenderse.

A diferencia de la dinamina prototípica, Drp1 carece de un dominio de unión a lípidos aparente y requiere proteínas adaptadoras integradas en la membrana como Fis1, Mff y MiD49 / 51 para su reclutamiento en la MOM (Bui y Shaw, 2013 Labbe et al., 2014 Richter et al., 2015). Sin embargo, nosotros y otros hemos identificado recientemente la cardiolipina lipídica (CL) específica de la mitocondria como un socio de unión específico para Drp1 (Bustillo-Zabalbeitia et al., 2014 Macdonald et al., 2014 Ugarte-Uribe et al., 2014). CL facilita el autoensamblaje de Drp1 en polímeros helicoidales que tubulan membranas y también estimula de manera robusta la actividad de Drp1 GTPasa, dos características consideradas características funcionales de estas GTPasas atípicas (Heymann y Hinshaw, 2009). Sin embargo, la naturaleza de las interacciones Drp1-CL y el papel de CL, si lo hay, en el proceso de remodelación de la membrana mitocondrial siguen sin estar claros.

CL es un fosfolípido dimérico inusual con propiedades bioquímicas y biofísicas únicas (Schlame et al., 2005 Huang y Ramamurthi, 2010). El CL nativo, que contiene cuatro cadenas de acilo predominantemente linoleoílo (C18: 2) en eucariotas superiores, tiene un área y un volumen de sección transversal del grupo de cabeza pequeños en relación con sus cadenas de acilo, lo que le otorga una forma cónica eficaz. En consecuencia, CL exhibe un comportamiento de fase compleja en las membranas, con una propensión a estabilizar la curvatura negativa de la membrana tras el secuestro y a la transición de una fase lamelar, bicapa a la no laminar, hexagonal invertida (HII) configuración tras un mayor enriquecimiento (de Kruijff y Cullis, 1980 Seddon, 1990 Tarahovsky et al., 2000 Trusova et al., 2010 Renner y Weibel, 2011). Esta propiedad de CL puede ser relevante para eventos de reordenamiento de lípidos que precipitan la fisión o fusión de la membrana, especialmente cuando se considera en el contexto de la dinámica de la membrana mitocondrial (Chernomordik y Kozlov, 2008 Doan et al., 2013 Pan et al., 2014). De hecho, la GTPasa OPA1 relacionada con la dinamina de la membrana interna mitocondrial (MIM) depende fundamentalmente de la CL para promover la fusión de la membrana mitocondrial (DeVay et al., 2009 Prohibición et al., 2010). Además, los defectos en la remodelación de la cadena de acilo de CL y las variaciones resultantes en la composición de la cadena de acilo de CL conducen al síndrome de Barth de miopatía cardioesquelética, lo que subraya la importancia de este lípido atípico para la función mitocondrial adecuada (Schlame y Ren, 2006). Aún se desconoce cómo Drp1 y CL funcionan de manera cooperativa en la remodelación y fisión de la membrana mitocondrial.

En este estudio, demostramos que Drp1 se asocia de manera estable con CL localizado en una alta densidad espacial en la bicapa lipídica objetivo. Además, mostramos que Drp1 reorganiza preferentemente CL en fase fluida no restringida (es decir, no asociada a la balsa) para generar plataformas de membrana condensada para la remodelación posterior de la membrana. La hidrólisis de GTP estimulada tras el autoensamblaje helicoidal induce una mayor transposición de CL, que parece aumentar la propensión del lípido a sufrir una transición de fase lamelar a no lamelar localizada. Estos reordenamientos de CL, que dependen de las interacciones entre el inserto B y la membrana de Drp1, crean regiones de membrana estrechamente constreñidas que están predispuestas a la fisión. Por lo tanto, Drp1 y CL funcionan de manera cooperativa para facilitar la remodelación de la membrana y la fisión durante la división mitocondrial.


Formación y regulación de membranas mitocondriales

Los fosfolípidos de la membrana mitocondrial son esenciales para la arquitectura mitocondrial, la actividad de las proteínas respiratorias y el transporte de proteínas hacia las mitocondrias. La acumulación de fosfolípidos dentro de las mitocondrias depende de una síntesis, degradación y tráfico coordinados de fosfolípidos entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias, así como del tráfico de lípidos intramitocondriales. Varios estudios destacan la contribución de los ácidos grasos de la dieta a la remodelación de los fosfolípidos y la homeostasis de la membrana mitocondrial. Comprender el papel de los fosfolípidos en la membrana mitocondrial y su metabolismo arrojará luz sobre los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la función mitocondrial y en las enfermedades relacionadas con las mitocondrias.

1. Introducción

Las mitocondrias están involucradas en una amplia gama de procesos celulares de importancia para la supervivencia celular. La membrana mitocondrial interna es el sitio activo para la cadena de transporte de electrones y la producción de ATP. Su integridad es crucial para la función mitocondrial y depende del suministro de proteínas y fosfolípidos. Como una de las clases principales de lípidos en la bicapa lipídica de las membranas celulares y orgánulos, los fosfolípidos son responsables de mantener tanto la integridad estructural de una célula como la separación espacial de los compartimentos subcelulares. Las principales clases de fosfolípidos que se encuentran en la membrana mitocondrial son similares a otras membranas como la fosfatidilcolina (PC) y la fosfatidiletanolamina (PE), y algunas son exclusivamente componentes de la membrana mitocondrial como la cardiolipina (CL) [1].

La interacción entre fosfolípidos y proteínas es importante particularmente en la membrana mitocondrial interna. Una proporción significativa de proteínas asociadas a la membrana interna está compuesta por proteínas involucradas en la fosforilación oxidativa y su actividad depende de la composición de fosfolípidos de la membrana. Los cambios en la composición de los fosfolípidos pueden afectar la respiración mitocondrial [2], que se ha relacionado con una variedad de enfermedades humanas como el síndrome de Barth, la isquemia y la insuficiencia cardíaca [3, 4]. La diversidad de fosfolípidos en la membrana mitocondrial también está influenciada por la variación en la longitud y el grado de insaturación de la cadena de acilo graso presente dentro de cada clase de fosfolípido [5]. Sin embargo, el papel de la composición de la cadena de acilo de los fosfolípidos en la función mitocondrial aún se conoce poco.

El mantenimiento de la composición de fosfolípidos en las membranas mitocondriales es esencial para la función, estructura y biogénesis mitocondrial y depende del metabolismo de los fosfolípidos, el transporte a las mitocondrias y el suministro de lípidos de la dieta. En esta revisión, nos centramos en la biosíntesis, el tráfico y la degradación de fosfolípidos, y su regulación / remodelación por los lípidos de la dieta, así como su papel en la integridad y función de la membrana mitocondrial interna.

2. Composición lipídica de las membranas mitocondriales

Las mitocondrias tienen una estructura distinta a la de otros orgánulos, ya que contienen dos membranas: la membrana mitocondrial externa (OMM) y la membrana mitocondrial interna (IMM), que separa el espacio intermembrana (IMS) de la matriz. Sin embargo, la composición de las membranas mitocondriales es similar a la de otras membranas. Los principales fosfolípidos en las membranas mitocondriales son fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) y ácido fosfatídico (PA), en cuanto a la membrana plasmática y fosfatidilglicerolipina (CL) y cardiolipina (CL). son exclusivamente componentes de la membrana mitocondrial (Figura 1). El PC y el PE son los fosfolípidos más abundantes y comprenden el 40 y el 30% de los fosfolípidos mitocondriales totales, respectivamente. PA y PS comprenden el 5% del total de fosfolípidos mitocondriales [6, 7]. A diferencia de la membrana plasmática, las membranas mitocondriales contienen altos niveles de cardiolipina (

15% del total de fosfolípidos) y niveles bajos de esfingolípidos y colesterol [8, 9].


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(mi) Fórmulas estructurales de fosfolípidos mitocondriales clave. (a) Fosfatidilcolina — PC (b) fosfatidiletanolamina — PE (c) ácido fosfatídico — PA (d) fosfatidilserina — PS (e) cardiolipina — CL.

El fosfolípido CL no solo tiene un papel en el mantenimiento del potencial de membrana y la arquitectura de la membrana mitocondrial interna, sino que también proporciona un apoyo estructural y funcional esencial a varias proteínas involucradas en la respiración mitocondrial. La estructura única de CL (Figura 1), que contiene tres cadenas principales de glicerol y cuatro cadenas de acilo graso, lo hace muy importante para el funcionamiento óptimo de las mitocondrias [10]. La incorporación de cuatro cadenas laterales de ácido linoleico en la misma molécula de CL lo convierte en el principal objetivo del ataque de los radicales libres, provocando su peroxidación. La peroxidación de CL mitocondrial parece ser un evento temprano que precede a la muerte celular apoptótica intrínseca [11]. Debido a su papel en la apoptosis y la función mitocondrial, los niveles de CL y la peroxidación de CL se han relacionado con varias enfermedades humanas como la aterosclerosis [12], el cáncer [13], el síndrome de Barth [14] y los trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer [15] y la enfermedad de Parkinson. [dieciséis].

Otra peculiaridad de la IMM es que la cantidad de proteínas asociadas a la membrana es alta. Algunos estudios estiman que la relación proteína-lípido de la membrana interna es tan alta como 3: 1 [17]. Entre las proteínas IMM, una porción significativa de proteínas comprende el sistema de fosforilación oxidativa, que contiene cinco complejos multiproteicos. La importancia de este sistema se basa en su función de proporcionar las moléculas de ATP celular necesarias para la supervivencia celular. La actividad y estabilidad de las proteínas de fosforilación oxidativa se ven afectadas por su interacción con los fosfolípidos en la IMM. Por ejemplo, se encontró que la falta de cardiolipina en IMM desestabiliza los complejos III y IV del sistema de fosforilación oxidativa [18, 19], lo que ilustra la importancia de CL para la respiración mitocondrial. Además, CL también participa en la importación y ensamblaje de proteínas. La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas nuclearmente y requieren translocaciones de proteínas en las membranas mitocondriales para ser importadas [20]. Varios estudios han demostrado que la CL es esencial para el ensamblaje y la función de las translocasas, lo que permite la integridad de la maquinaria de importación mitocondrial [21-23].

Además de tener un papel en la regulación de la importación y la actividad de las proteínas, la CL, así como la PE, es importante para la morfología mitocondrial tubular y la fusión de membranas [24-28]. La morfología mitocondrial depende del equilibrio entre los eventos de fusión y fisión. La fusión mitocondrial requiere un PA lipídico fusogénico que se genera por hidrólisis de CL por la fosfolipasa D [26]. El PE es otro fosfolípido necesario para la fusión mitocondrial. La interrupción de la síntesis de PE a través de la vía de descarboxilación de PS provoca defectos de fusión de las mitocondrias [25]. La acumulación de CL y PE dentro de las mitocondrias está regulada por las proteínas Ups1 y Ups2, respectivamente, que participan en el tráfico intramitocondrial de fosfolípidos (ver Sección 6). Ups1 y Ups2 afectan el procesamiento de OPA1 (o Mgm1 en levadura), una GTPasa similar a la dinamina de la membrana interna que regula la fusión de la membrana [8]. Se sugirió que el procesamiento deficiente de Mgm1 podría explicar los defectos en la morfología mitocondrial con una composición de fosfolípidos de membrana alterada [8]. Se encontró que una disminución en el contenido mitocondrial de PE altera la morfología mitocondrial en levaduras [27] y células de mamíferos [25]. Joshi y sus colegas han demostrado que CL y PE tienen funciones superpuestas en la fusión mitocondrial y que la interrupción tanto de PE como de CL provoca la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial y la fragmentación de las mitocondrias de levadura [27]. Las mitocondrias fragmentadas se asocian con miocardiopatía y síndrome de Barth, lo que demuestra la relevancia del papel de CL y PE en la fusión mitocondrial. En esta línea, una levadura crd1 El mutante que no sintetiza CL presenta múltiples defectos mitocondriales y celulares, incluida la pérdida de ADN mitocondrial, disminución de la función respiratoria y del potencial de membrana y reducción de la viabilidad celular a temperaturas elevadas como consecuencia de la falta de CL [29]. Se encontraron fenotipos similares en psd1 mutante de levadura, que ha reducido la PE mitocondrial [30]. En conjunto, los fosfolípidos mitocondriales CL y PE regulan la fusión / fisión mitocondrial y la biogénesis, que a su vez están vinculadas a la homeostasis celular.

El PA fosfolípido tiene funciones importantes como un ancla lipídica para reclutar proteínas implicadas en el tráfico [31], la señalización lipídica [32] y la fusión [33] a las superficies de las membranas. Se descubrió que la regulación de la fusión y fisión de las mitocondrias por PA permite que las mitocondrias alteren su morfología, aumenten la eficiencia de la producción de energía y marquen las mitocondrias no saludables para la autofagia [34]. Además, el PA puede servir como sustrato para la producción de lípidos de señalización diacilglicerol (DAG) y ácido lisofosfatídico. Las mutaciones en el gen Lipin-1, la PA fosfatasa que genera DAG a partir de PA, se han asociado con enfermedades metabólicas y neurológicas [35].

Estas evidencias demuestran la importancia de los fosfolípidos de la membrana mitocondrial para la arquitectura IMM, la apoptosis, la actividad de las proteínas respiratorias y el transporte de proteínas al interior de las mitocondrias. Debido a su amplio papel en la función mitocondrial, las alteraciones de los fosfolípidos se han asociado con varias enfermedades [36]. Por ejemplo, las células cancerosas, que se caracterizan por alteraciones en la bioenergética y la apoptosis, han alterado la composición de fosfolípidos mitocondriales [37]. Las patologías cardíacas dan como resultado una reducción de tetralinoleil-CL, con el consiguiente aumento de peróxido de hidrógeno por la cadena respiratoria y apoptosis [38, 39]. Las enfermedades metabólicas, como la diabetes y la enfermedad de las grasas vivas no alcohólicas, también se han asociado con la disminución de la CL mitocondrial y la alteración de la remodelación de la cadena de acilo CL [40, 41]. Otro aspecto importante relacionado con la composición de los fosfolípidos es su cambio con el envejecimiento. Los estudios han informado de que el envejecimiento está inversamente relacionado con el contenido de fosfolípidos insaturados [42]. La pérdida de la fluidez de la membrana resultante de la peroxidación de lípidos, así como la disminución del contenido de CL mitocondrial y la actividad alterada de la cadena respiratoria también son características del envejecimiento [43]. Por lo tanto, la regulación de la homeostasis de los fosfolípidos en las membranas mitocondriales a través de su síntesis / degradación y transporte dentro y fuera de la membrana mitocondrial juega un papel crucial en el mantenimiento de la viabilidad y salud celular.

3. La biosíntesis de los principales fosfolípidos de membrana ocurre en la sala de emergencias

Los dos principales fosfolípidos de membrana bicapa PC y PE se producen a partir de colina y etanolamina y el intermediario lipídico común diacilglicerol en el proceso conocido como de novo Vía Kennedy de CDP-colina y CDP-etanolamina [44, 45] (Figura 2). Ambos ramos de la vía dependen de la disponibilidad de los sustratos extracelulares, colina y etanolamina, y de su entrada en las células. Esos sustratos son moléculas polares y deben transportarse activamente al interior de las células. El sistema de transporte de etanolamina no se ha estudiado ampliamente y sigue siendo poco conocido. Se sabe que el transporte de colina para la síntesis de PC está mediado por un grupo de transportadores de solutos ubicuos de la familia SLC44A, principalmente por el miembro A1, también conocido como proteína 1 similar al transportador de colina (CTL1) y como antígeno de superficie celular CDw92 [46 ]. Inmediatamente después de entrar en las células, la colina y la etanolamina son fosforiladas por la colina y la etanolamina quinasas, de las cuales

y - se identificaron y caracterizaron completamente en sistemas de mamíferos [47]. Los productos de la quinasa, fosfocolina y fosfoetanolamina, se acoplan luego con CTP por las enzimas reguladoras específicas y de la vía CDP-fosfocolina y CDP fosfoetanolamina citidililtransferasas (CCT / Pcyt1 y ECT / Pcyt2) para producir CDP-colina y CDP-etano, respectivamente. para liberar pirofosfato inorgánico. En los pasos finales, los derivados de CDP-colina y CDP-etanolamina se condensan con diacilglicerol, catalizados por múltiples fosfotransferasas de DAG-colina y DAG-etanolamina (CPT, EPT, CEPT), para liberar CDP y producir la bicapa formando fosfolípidos PC y PE en el retículo endoplásmico (RE).


Vías de síntesis de fosfolípidos y su interconexión. Las dos ramas de la vía Kennedy están representadas en gris. Se indican los metabolitos y enzimas clave que catalizan las reacciones respectivas. Las abreviaturas son las que se indican en el texto principal.

Los principales puntos reguladores para la síntesis de PC y PE a través de la vía de Kennedy son las reacciones más lentas (que limitan la velocidad) gobernadas por Pcyt1 y Pcyt2, respectivamente. Además, como en otras vías metabólicas, la vía de Kennedy está regulada por las disponibilidades de sustrato (colina / etanolamina y DAG). La regulación de Pcyt1 y Pcyt2 se ha estudiado extensamente e históricamente se ha considerado similar, pero están surgiendo pruebas de que son completamente distintas y están reguladas de manera diferente [48-53].

La tasa de síntesis de PC está regulada predominantemente por la actividad de Pcyt1 [54]. Pcyt1 se activa por asociación con membranas y se regula a la baja por fosforilación [55]. La translocación de Pcyt1 en las membranas celulares es estimulada por ácidos grasos y fosfolípidos aniónicos [56-59]. Inducen la unión de Pcyt1 a las membranas, debido a sus grupos de cabeza cargados negativamente [59].Por tanto, los cambios en la composición de lípidos de las membranas pueden modificar la actividad de Pcyt1, que normalmente conduce a la estimulación de la síntesis de PC.

Otro paso regulador más para la síntesis de PC es la disponibilidad de colina que está regulada por el transporte mediado por proteínas a nivel de la membrana plasmática. El transportador universal CTL1 transporta colina en varios tejidos [60-62] y se considera transportador de colina predominante en células no neuronales [46, 60, 62, 63]. Recientemente, se ha descubierto que la expresión de CTL1, la captación de colina y la síntesis de PC podrían estar reguladas directamente por la deficiencia de colina [64] y los ácidos grasos saturados e insaturados (AG) en las células del músculo esquelético [65]. La disponibilidad de colina y el tipo de FA regulan la síntesis de PC junto con la modificación diferente del transporte de colina, la síntesis de PC y la homeostasis de DAG / TAG. En las células deficientes en colina, la síntesis de PC a partir de colina se redujo, lo que condujo a una mayor disponibilidad de DAG y FA para la síntesis de TAG [64]. Similar a la deficiencia de colina, la exposición crónica de las células musculares al ácido palmítico redujo CTL1, la captación de colina y la síntesis de PC y aumentó el DAG y TAG [65]. Por el contrario, el ácido oleico no mostró ningún efecto sobre la captación de CTL1 y colina; sin embargo, aumentó la síntesis de PC al nivel de Pcyt1 y aumentó el contenido de TAG [65]. El ácido oleico es un estimulador bien conocido de la unión y actividad de la membrana de Pcyt1 [56-59].

los de novo La síntesis de PE podría estar limitada por la disponibilidad de sustratos etanolamina [66, 67] y DAG [68] o las enzimas EK [69] y Pcyt2 [53]. Según los numerosos estudios de radiomarcaje y modelos animales, Pcyt2 es la principal enzima reguladora de la vía CDP-etanolamina. Ratones heterocigotos para el gen Pcyt2 (

) han reducido la formación de CDP-etanolamina, lo que limita la síntesis de PE y aumenta la disponibilidad de DAG para la síntesis de TAG [70]. Por otro lado, la sobreexpresión de Pcyt2 no pudo acelerar la síntesis de PE cuando la disponibilidad de DAG para el último paso de la vía limitaba la formación de PE [68], mientras que la sobreexpresión de EK aceleraba la síntesis de PE en las células Cos-7 [69]. A niveles bajos de etanolamina, Pcyt2 limita la velocidad de reacción, mientras que a niveles altos de etanolamina, EK limita la velocidad [71]. En medios deficientes en etanolamina, las células adaptan la vía de descarboxilación de la PS mitocondrial para producir PE adicional a partir de serina (véase la sección 4) [72]. Sin embargo, este no es el caso del metabolismo normal. Los estudios en animales indican que la vía de la CDP-etanolamina es la vía principal que contribuye a la síntesis de PE [53].

En el hígado, una vía alternativa utiliza PE para producir más PC y colina en una metilación de PE en tres pasos por S-adenosilmetionina (SAM) catalizada por fosfatidiletanolamina-N-metiltransferasa (PEMT). La vía PEMT explica

30% de la síntesis hepática de PC y está corregulado con la vía CDP-colina Kennedy [73]. No se sabe cómo la vía Kennedy de CDP-etanolamina, que solo produce EP de novo, está relacionado con el PE utilizado en la vía PEMT para la formación de PC. Sin embargo, en los ratones knockout para PEMT, la vía CDP-colina está regulada al alza, mientras que durante la sobreexpresión de PEMT en células de hepatoma, está regulada a la baja, lo que muestra un fuerte vínculo de la vía PEMT con el metabolismo hepático de la PC [74, 75]. Como vía de respaldo, PEMT suministra PC para el ensamblaje de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y para la producción de bilis y es una fuente de colina para la síntesis de betaína en las mitocondrias [76]. La metilación hepática de PE también proporciona PC para la síntesis de PS mediante la reacción de intercambio de bases catalizada por la PS sintasa 1 (PSS1). La PS recién formada podría luego transformarse en PE mitocondrial por la PS descarboxilasa (PSD), formando un ciclo de PE hepático específico [77] (Figura 2). El ciclo hepático PE-PC-PS puede estar involucrado en el mantenimiento de los niveles de fosfolípidos cuando de novo Las vías de CDP-colina y CDP-etanolamina están alteradas.

En los mamíferos, la PS solo se podría producir a partir de los fosfolípidos preexistentes (PC y PE) y L-serina, catalizada por las PS sintasas 1 y 2 (PSS1 y PSS2) en las membranas asociadas a las mitocondrias (MAM), una subfracción del RE. Se ha propuesto que MAM es un dominio distinto del RE que entra en contacto cercano con OMM y, por lo tanto, media la importación de PS recién sintetizado en las mitocondrias para descarboxilarlo en PE. La descarboxilación de PS por PSD para formar PE mitocondrial es una función clave de PS en las mitocondrias (ver Sección 4).

La síntesis de PS está regulada por la fosforilación de la PS sintasa en células de levadura y de mamíferos [78, 79]. El principal mecanismo para regular la síntesis de PS en células de mamíferos es un mecanismo de retroalimentación mediante el cual la actividad de las PS sintasas 1 y 2 está regulada por el producto final, PS [77, 80, 81]. Además, PSS1 y PSS2 modulan diferencialmente el metabolismo de los fosfolípidos. La sobreexpresión de PSS1 en células de hepatoma disminuye la tasa de síntesis de PE a través de la vía CDP-etanolamina [82], mientras que la sobreexpresión de PSS2 no lo hace [83].

4. La biosíntesis de fosfolípidos mitocondriales

El mantenimiento de la bicapa mitocondrial y de una composición definida de fosfolípidos mitocondriales depende de la capacidad del orgánulo para sintetizar CL, PE, PG y PA en el lugar y sobre el suministro externo de PC y PS, que se sintetizan exclusivamente en el ER y MAM y deben ser importados a la mitocondria [8].

El PE se produce en las mitocondrias por descarboxilación del PS. Esta reacción es catalizada por la enzima interna mitocondrial fosfatidilserina descarboxilasa (PSD). Aunque la PE producida por la vía de la CDP-etanolamina puede importarse a IMM, la descarboxilación de la PS proporciona la mayor parte de la PE mitocondrial [84]. Los ratones knockout para PSD tienen disfunción mitocondrial y mueren en la fase embrionaria [25]. Además, la deficiencia de PE mitocondrial resultante del silenciamiento de ARNip de PSD en células CHO altera la morfología mitocondrial y afecta la producción de ATP, el consumo de oxígeno y la actividad de los componentes de transporte de electrones [85].

La cardiolipina, un fosfolípido importante en las membranas mitocondriales, se sintetiza mediante la condensación de fosfatidilglicerol (PG) y CDP-diacilglicerol catalizados por cardiolipina sintasa (CLS) en el lado de la matriz de la membrana mitocondrial interna (Figura 2). El PG se produce mediante una reacción de dos pasos: el glicerol-3-fosfato y el CDP-diacilglicerol se condensan en fosfatidilglicerol fosfato, que luego se desfosforila en PG. La falta de CLS reduce la actividad del sistema de fosforilación oxidativa y la importación de proteínas en las mitocondrias de la levadura [86], pero, curiosamente, las funciones fundamentales de las mitocondrias permanecen intactas [87]. Se descubrió que la regulación de la síntesis de CL implica múltiples mecanismos, como los factores que afectan la biogénesis mitocondrial, el pH de la matriz y la respiración [88]. Recientemente, se descubrió que Tam41 (proteína translocadora y de mantenimiento 41), un componente del sistema translocador mitocondrial, regula la síntesis de CL [23]. Tam41 las células mutantes muestran una ausencia casi completa de CL y PG, lo que sugiere que la regulación puede ocurrir al nivel de CDP-diacilglicerol (CDP-DAG) sintasa. Este estudio demuestra que Tam41 se requiere principalmente para la biosíntesis de PG y CL y que los defectos en la importación de proteínas en células deficientes en Tam41 son una consecuencia de la pérdida de PG y CL [23].

Finalmente, el ácido fosfolípido fosfatídico (PA) representa un punto de ramificación para la síntesis de todos los fosfolípidos [89] (Figura 2). El PA puede convertirse en CDP-DAG por la CDP-DAG sintasa para la síntesis de PG, PS y CL en una reacción catalizada por CTP: PA citidililtransferasa [90]. Alternativamente, PA puede convertirse en DAG, que es un sustrato para la síntesis de PE y PC, en una reacción catalizada por PA fosfatasas como Lipin-1 [35, 91]. Las PA fosfatasas son una de las enzimas más reguladas en el metabolismo de los lípidos. Su actividad se rige por la fosforilación, la asociación con membranas y la modulación por componentes del metabolismo de los lípidos, como CL y CDP-DAG [92, 93].

La síntesis de PA se produce mediante dos pasos de acilación, primero el glicerol-3-fosfato se convierte en 1-acilglicerol-3-fosfato (ácido lisofosfatídico) mediante la glicerol-3-fosfato aciltransferasa. El producto de 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato se acila luego a 1,2-diacil-sn-glicerol-3-fosfato (ácido fosfatídico) mediante 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferasa [94] . Los estudios han indicado que tanto el ácido lisofosfatídico como el ácido fosfatídico se sintetizan en la superficie externa de la membrana externa mitocondrial y luego el ácido fosfatídico se mueve hacia la membrana mitocondrial interna donde sirve como precursor de la biosíntesis de cardiolipina [95]. El PA también se puede generar mediante la fosforilación de DAG mediante la acción de una gran familia de quinasas DAG (DAGK) o mediante la hidrólisis de los fosfolípidos PC y CL por la fosfolipasa D (ver Sección 8). A su vez, el PA puede ser metabolizado a ácido lisofosfatídico por la fosfolipasa A2 o desfosforilado a DAG por Lipin-1.

5. Tráfico de fosfolípidos hacia y desde las mitocondrias

El tráfico intracelular de fosfolípidos juega un papel crucial en la homeostasis de los fosfolípidos y proporciona fosfolípidos para las membranas celulares y orgánulos, incluidos el OMM y el IMM. Dado que la mayoría de los fosfolípidos, como PE, PS y PC, se sintetizan en el ER, deben importarse a las mitocondrias. Se descubrió que la importación de PE producida por la vía CDP-etanolamina en IMM es eficaz en células CHO, células HeLa y levaduras [96-98]. Sin embargo, la mayor parte de la PE en las mitocondrias se deriva de la descarboxilación de la PS [85]. La síntesis de PE a partir de PS en el IMM requiere la translocación de PS de sus sitios de síntesis en el RE. Además, varios estudios han demostrado que el PE formado a partir de PS en las mitocondrias podría exportarse fuera de este orgánulo [85, 97]. Se descubrió que el transporte de PE derivado de PS fuera de las mitocondrias se ve afectado por la velocidad de síntesis de PE a través de la vía CDP-etanolamina y está impulsado por un gradiente de concentración [97].

Se ha propuesto que el mecanismo para el transporte de fosfolípidos dentro y fuera de las membranas mitocondriales implica sitios transitorios de contacto con la membrana. Estos sitios de contacto ocurren en varios orgánulos, incluido el RE y las mitocondrias, y pueden estar involucrados en el tráfico de PS hacia y de PE de las mitocondrias [99, 100]. Estudios recientes han encontrado que la membrana del RE está unida físicamente al OMM por la estructura de encuentro entre el RE y las mitocondrias (ERMES) [101]. El ERMES está compuesto por un complejo de cinco proteínas que reside tanto en el RE como en las mitocondrias [101]. La función principal de ERMES es actuar como enlace mecánico entre el RE y las mitocondrias y proporcionar intercambio de fosfolípidos entre estos orgánulos [102, 103]. Un complejo ERMES defectuoso altera los niveles de fosfolípidos en las membranas mitocondriales y causa defectos morfológicos mitocondriales [103, 104]. Sin embargo, el flujo de fosfolípidos entre el RE y las mitocondrias no se elimina por completo en las células deficientes en ERMES, lo que sugiere que también deben existir vías adicionales independientes de ERMES para el transporte de fosfolípidos [102].

Se ha demostrado que las proteínas de transferencia de lípidos, como la proteína de transferencia de PC y la proteína de transferencia de lípidos inespecífica, transfieren fosfolípidos a la membrana plasmática y también pueden participar en el intercambio de fosfolípidos entre las membranas de los orgánulos [105]. Sin embargo, hasta la fecha no se ha establecido ninguna transferencia de proteína que medie el tráfico de PC, PS y PE dentro o fuera de las mitocondrias.

La tasa de importación de PS y de exportación de PE desde las mitocondrias está regulada por la composición de la cadena de acilo y por la tasa metabólica [97]. Los estudios de etiquetado mostraron que las especies de PS poliinsaturadas se descarboxilan preferentemente, es decir, se importan a IMM [97]. A su vez, la PE derivada de la descarboxilación de PS contiene las principales especies poliinsaturadas, así como monoinsaturadas 36: 1, mientras que la PE producida a través de la vía CDP-etanolamina contiene varias especies monoinsaturadas y diinsaturadas. La composición de especies de PE de IMM y ER muestra que la mayor parte de PE en IMM se deriva de PS importado, mientras que la mayor parte de PE en ER se sintetiza a través de la vía CDP-etanolamina [97]. Además, Kainu y sus colegas encontraron que el aumento de la síntesis de PE mediante la vía CDP-etanolamina reduce la exportación de PE derivada de PS desde IMM. De manera similar, la translocación de PS a las mitocondrias está acoplada a su síntesis en el RE. Sin embargo, la velocidad de transporte de la PS recién sintetizada a las mitocondrias no se correlaciona directamente con su velocidad de síntesis, sino que depende de su hidrofobicidad [97].

6. Tráfico intramitocondrial de fosfolípidos

Los movimientos transbicapa entre las valvas mitocondriales deben existir para permitir el tráfico y la acumulación de fosfolípidos, ya sea cuando se importan de ER o cuando se sintetizan en la IMM. Varios estudios han demostrado que la importación de PS en las mitocondrias está mediada por el contacto de la membrana entre MAM, una subfracción del ER, y OMM [84, 85, 97, 106, 107]. El PS debe luego translocarse a través del OMM y, posteriormente, ser entregado desde la valva interior del OMM, a través del espacio intermembrana, hasta el prospecto exterior del IMM, que es el sitio activo para la descarboxilación del PS a PE [108]. También se ha sugerido que los mecanismos subyacentes al movimiento de lípidos intramitocondriales se producen a través de los sitios de contacto con la membrana [99, 109]. El modelo que mejor describe el transporte intramitocondrial de PS involucra poros en el OMM que conducen a su movimiento desde la valva exterior de la OMM a la valva interior de la OMM. A continuación, la PS se difunde más a la IMM a lo largo de los puentes lipídicos, que son análogos a los sitios de contacto de la membrana, uniendo las dos membranas [110]. Una vez en el IMM, PS se puede convertir a PE. El PE producido en el IMM puede luego difundirse de nuevo a la monocapa exterior de OMM a lo largo de una ruta inversa.

Las scramblasas de fosfolípidos (PLS), miembros de la familia de transportadores de lípidos transmembrana conocidos como flippases, son enzimas responsables del movimiento bidireccional de fosfolípidos entre dos compartimentos. De esta familia, PLS3 se identificó en las mitocondrias y modula la translocación de CL del IMM al OMM, afectando la estructura mitocondrial, la respiración y la apoptosis [111]. No se sabe si PLS3 regula el transporte de otros fosfolípidos. Las proteínas del espacio intermembrana Ups1 y Ups2 son responsables del tráfico de CL y PE entre las membranas mitocondriales externa e interna [112]. La pérdida del tráfico de CL intramitocondrial en células deficientes en Ups1 altera la composición y morfología de los fosfolípidos mitocondriales, similar a las células deficientes en ERMES [112]. Mdm35, un socio de unión común de Ups1 y Ups2 en el espacio intermembrana, también proporciona una regulación coordinada del tráfico de PE y CL por estas proteínas reguladoras conservadas [113].

Por lo tanto, el tráfico de fosfolípidos hacia las mitocondrias y el espacio intramitocondrial proporciona a este orgánulo fosfolípidos recién sintetizados, que son esenciales para la composición de la membrana mitocondrial o precursores para la síntesis de fosfolípidos mitocondriales específicos. El equilibrio en el tráfico de fosfolípidos, junto con su síntesis y degradación, es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis de los fosfolípidos. Sin embargo, no solo la clase de fosfolípidos acumulados en la membrana mitocondrial, sino también la cadena de acilo graso presente en los fosfolípidos es importante para la estructura y función mitocondrial, que se describirá en la siguiente sección.

7. Remodelación de fosfolípidos mitocondriales y función de los lípidos en la dieta

Después de la de novo síntesis de fosfolípidos, muchos de ellos experimentan una remodelación de la cadena de acilo, conocida como ciclo de Lands. La variación en la longitud de la cadena y el grado de insaturación de los ácidos grasos presentes en los fosfolípidos contribuye a la diversidad de los fosfolípidos de la membrana mitocondrial, que es importante para las propiedades biofísicas de la membrana [114, 115]. Además, la activación de enzimas en la membrana mitocondrial interna requiere remodelación de la cadena de acilo. Por ejemplo, el deterioro de la remodelación de CL puede interferir con el ensamblaje y la estabilidad de las proteínas de la cadena respiratoria [115]. Convencionalmente, la remodelación de la cadena de acilo implica la familia de las fosfolipasas A (PLA), que catalizan la eliminación de una cadena de acilo del resto de glicerol, y las transacilasas, que median la reacilación con diferentes AG [114, 116].

La remodelación de la cardiolipina se ha estudiado ampliamente debido a su papel en la funcionalidad de las mitocondrias. La remodelación de CL implica tafazzin, una transacilasa que genera patrones específicos de especies de CL [117]. La deficiencia de tafazzin altera la composición de CL y está relacionada con cambios drásticos en la morfología mitocondrial y con el síndrome de Barth [118]. El síndrome de Barth es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X que se caracteriza por niveles reducidos de CL debido a una mutación en el gen tafazzin [119]. En los pacientes de Barth, falta una única especie molecular, a saber, tetralinoleoil-cardiolipina, mientras que otras cardiolipinas no se ven afectadas o incluso aumentan. Esto es causado por una incorporación reducida de ácido linoleico (C18: 2) en CL debido a la remodelación de FA alterada por tafazzin [118, 120]. Los cambios en la composición de cardiolipina FA en el síndrome de Barth también pueden interferir con el ensamblaje y la estabilidad de los complejos de fosforilación oxidativa.

Otra enzima involucrada en la remodelación de la cardiolipina es la acil coenzima A tioesterasa (Them5). Los ratones que carecen de Them5 tienen una morfología mitocondrial alterada y su función en los hepatocitos [121]. De manera similar, la deficiencia de lipocalina-2, una proteína de transferencia de lípidos, altera la composición de ácidos grasos de PE, PC y PS, así como la cantidad de cardiolipina mitocondrial en el corazón del ratón [122]. Se descubrió que la lipocalina reduce el contenido de ácido linoleico (C18: 2) en los fosfolípidos y afecta negativamente la función mitocondrial y la producción de energía [122]. De hecho, la cardiolipina enriquecida con ácido linoleico simétrico permite una función óptima de las mitocondrias [123].

La composición de ácidos grasos de la dieta puede modificar adicionalmente la remodelación de la cadena de acilo de los fosfolípidos y la función mitocondrial. En un estudio, la exposición de ratones a una dieta rica en aceite de colza mostró una composición de fosfolípidos de la membrana mitocondrial alterada en términos tanto del tipo de cadenas de acilo dentro de los fosfolípidos como de las proporciones de clases de fosfolípidos. Como resultado de la composición alterada de la membrana mitocondrial, estos ratones mostraron bioenergética mitocondrial hepática alterada [124]. Guderley y colaboradores demostraron que en las mitocondrias de la trucha los cambios en las características de los fosfolípidos de la membrana, incluida la composición de la cadena de acilo, siguen los patrones de los ácidos grasos presentes en la dieta. En este mismo estudio, la capacidad respiratoria de las mitocondrias del músculo rojo fue alterada por las diferentes dietas y se encontró que era más alta en la dieta rica en lípidos poliinsaturados [125]. Varios otros estudios en mamíferos también han demostrado que los cambios en la dieta modifican la composición de AG de los principales fosfolípidos mitocondriales [126-128] y, en particular, las especies moleculares asociadas con el CL mitocondrial [57]. Después de una dieta deficiente en ácido linoleico (C18: 2), un ácido graso esencial, el corazón de rata mostró una disminución significativa en el CL de tetralinoleoilo, que afectó el consumo de oxígeno mitocondrial [127, 129]. Por el contrario, la suplementación dietética con ácido linoleico restauró el CL de tetralinoleoílo en los fibroblastos cultivados de pacientes con síndrome de Barth y los niveles elevados de CL [130].

Se descubrió que la composición del CL mitocondrial se ve alterada tanto por la cantidad como por la calidad de la grasa de la dieta [131]. En los hepatocitos, la composición del CL mitocondrial se alteró en ratas alimentadas con dietas con un 30% de grasas en comparación con las ratas alimentadas con dietas con un 5% de grasas. Además, el contenido de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y ácidos grasos poliinsaturados n-3 (PUFA) aumentó con la dieta rica en aceite de pescado en comparación con la dieta basal, tanto al 5% como al 30% de grasa en la dieta. Tanto el contenido de CL total como su contenido de C18: 2 aumentaron con la esteatosis hepática y se correlacionaron con la actividad de la ATP sintasa [131]. Recientemente, un análisis lipidómico mitocondrial mostró que la composición de AG del grupo de CL no está directamente relacionada con la presencia de un AG determinado en la dieta, pero hay una selección de cadenas de AG individuales que se incorporarán al grupo de LC [132]. Por ejemplo, se encontró que la incorporación de 18: 2 era similar, a pesar de que las dietas variaban

4 veces en este FA esencial.

El contenido de PUFA n-3 de la membrana plasmática en diferentes tejidos de ratón tuvo la mayor sensibilidad a los cambios en los ácidos grasos de la dieta [133]. El hecho de que las clases de PUFA n-6 y n-3 no se pueden sintetizar de novo por mamíferos sugiere que la composición de los fosfolípidos de membrana puede estar fuertemente influenciada por la proporción y abundancia de PUFA n-6 y n-3 en la dieta. Varios estudios han demostrado que el aumento del contenido de PUFA en la dieta aumenta la tasa metabólica [134-136]. Por ejemplo, el tratamiento de ratas con n-3 PUFA disminuyó la fuga de protones de la cadena respiratoria y esto se relacionó con la incorporación de PUFA en el PC, el PE y el CL mitocondriales [137]. El tratamiento con ácido docosahexaenoico (DHA), pero no con ácido eicosapentaenoico (EPA), altera profundamente la composición de ácidos grasos de los fosfolípidos mitocondriales en el corazón de rata, disminuyendo el ácido araquidónico y aumentando el contenido de DHA. El aumento del contenido de DHA retrasó la apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (MPTP), que se asocia con apoptosis y daño miocárdico durante la isquemia [127]. También se encontró que la incorporación de DHA en CL regula la agrupación de lípidos-proteínas mitocondriales, que altera varios aspectos de la función mitocondrial [17]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el aumento del nivel de PUFA en la dieta cambia la composición de los fosfolípidos de la membrana mitocondrial y, en consecuencia, puede alterar la función y la capacidad mitocondrial.

La respuesta a los ácidos grasos de la dieta también varía según la clase de fosfolípidos. Se encontró que el PC responde mejor a la variación en el contenido de MUFA en la dieta que las otras clases de fosfolípidos, mientras que el PE responde más que el PC tanto a los PUFA n-6 de la dieta como a los PUFA n-3 [133]. Curiosamente, los ratones deficientes en Pcyt2, que tienen una tasa disminuida de síntesis de PE, son deficientes en PUFA y tienen una composición de FA modificada específicamente en PE y en TAG [70]. Por lo tanto, el cambio en la composición de la cadena de acilo graso de fosfolípidos se basa no solo en el perfil de ácidos grasos de la dieta sino también en las clases de fosfolípidos afectados.

En conjunto, estos estudios demostraron que la alteración de las enzimas implicadas en la remodelación de los fosfolípidos, así como los cambios en los ácidos grasos de la dieta, pueden alterar la composición de fosfolípidos de la membrana mitocondrial. Las intervenciones dietéticas que pueden influir en los fosfolípidos de la membrana mitocondrial, modificando así sus propiedades físicas, la respiración y otros procesos como el MPTP, están emergiendo como nuevas estrategias terapéuticas [124]. Se ha sugerido que las terapias dirigidas a los fosfolípidos mitocondriales son potencialmente útiles para tratar patologías como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, la obesidad y los trastornos metabólicos [124].

8. Degradación de fosfolípidos mitocondriales

Muchos fosfolípidos tienen un recambio rápido, lo que indica que su degradación juega un papel importante en la homeostasis de la membrana. La degradación de los fosfolípidos está catalizada principalmente por fosfolipasas no lisosomales. Estas fosfolipasas se dividen en tres clases según el enlace que escinden: fosfolipasas A (PLA), fosfolipasas C (PLC) y fosfolipasas D (PLD).

Los PLA liberan el ácido graso en el sn-1 y sn-2 posición del resto de glicerol que genera lisofosfolípido y FA libre. El lisofosfolípido se reacila para generar un nuevo fosfolípido, el mecanismo conocido como remodelación de FA, o es degradado por una lisofosfolipasa. Varios estudios sugieren que los PLA median gran parte del recambio de fosfolípidos [138, 139]. La familia PLA2, que hidroliza FA unido en el sn-2 de los fosfolípidos, se ha relacionado con el recambio y remodelado de los fosfolípidos, así como con la homeostasis de la membrana [140, 141]. iPLA2

-familia PLA2 independiente, se distribuye preferentemente en las mitocondrias. Debido a la asociación de iPLA2 con las membranas mitocondriales, esta enzima puede estar involucrada en la integración del metabolismo de los fosfolípidos y la energía. Los ratones nulos para iPLA2 muestran una función mitocondrial anormal con una disminución drástica del consumo de oxígeno [142]. Por lo tanto, iPLA2 es esencial para mantener la función mitocondrial bioenergética a través de la regulación de la homeostasis de los fosfolípidos de la membrana mitocondrial. Debido a su papel en la remodelación de la cardiolipina, el hipocampo de ratones nulos para iPLA2 muestra un contenido elevado de cardiolipina mitocondrial con una composición de longitud de cadena alterada [142].

Las fosfolipasas C (PLC) hidrolizan el enlace entre el esqueleto de glicerol y el fosfato para producir DAG y un grupo de cabeza fosforilado. Los PLC generalmente están involucrados en la generación de segundos mensajeros para señalizar eventos [143], pero también juegan un papel en la rotación de PC y PE [144, 145].

Las fosfolipasas D hidrolizan el enlace entre el fosfato y el grupo de cabeza para producir PA y grupo de cabeza libre. Tanto los miembros de la familia clásica de la fosfolipasa D (PLD) que se encuentran en muchas superficies de la membrana citoplasmática como MitoPLD, el miembro de la familia PLD que se encuentra en la superficie mitocondrial, pueden generar PA mediante la hidrólisis de los fosfolípidos PC y CL [26]. El PA generado por MitoPLD regula la forma mitocondrial facilitando la fusión mitocondrial [146]. La fusión y fisión mitocondrial son muy importantes para mantener la función mitocondrial y celular, y los cambios morfológicos de las mitocondrias están relacionados con la apoptosis celular y la enfermedad neurodegenerativa [146]. Por ejemplo, en los cerebros de los pacientes con enfermedad de Alzheimer, la PLD1 se regula al alza en la membrana mitocondrial, lo que afecta la composición de los fosfolípidos de la membrana mitocondrial [147].

La participación de las fosfolipasas en la homeostasis de los fosfolípidos también se demuestra mediante enzimas similares a PLD que catalizan la síntesis de PS mediante reacciones de intercambio de bases. Las PS sintasas 1 y 2 (PSS1 / 2), las enzimas similares a PLD, catalizan principalmente el intercambio del grupo principal de PE o PC por serina en lugar del intercambio del grupo principal de serina de PS por colina o etanolamina. Por tanto, PLD y enzimas similares a PLD podrían desempeñar un papel importante en diferentes homeostasis de fosfolípidos [84].

9. Conclusión

La identificación de un vínculo entre los fosfolípidos y las proteínas en la membrana mitocondrial ha mejorado nuestra comprensión de la morfología y función de las mitocondrias. La regulación de la síntesis, el tráfico y la degradación de los fosfolípidos es esencial para mantener la homeostasis de los fosfolípidos en las mitocondrias. Los ácidos grasos de la dieta pueden modificar la remodelación de los fosfolípidos en las mitocondrias, que contribuyen a la integridad de la membrana mitocondrial. Sin embargo, el mecanismo molecular para la coordinación de la síntesis, degradación, tráfico y remodelación de fosfolípidos sigue siendo un área de investigación activa. Por ejemplo, ¿cómo se interconectan la síntesis y la degradación? ¿Cuáles son las señales para el transporte de fosfolípidos dentro y fuera de las mitocondrias? ¿Cómo se puede utilizar la dieta para modular la homeostasis de los fosfolípidos en estados de salud y enfermedad? Sin duda, se lograrán muchos descubrimientos en unos años.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Expresiones de gratitud

Este trabajo en el laboratorio de Marica Bakovic fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud y el Consejo Nacional de Investigación en Ciencias e Ingeniería de Canadá.

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Derechos de autor

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Discusión

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Investigamos el papel de CL en la formación de una plataforma de reacción de activación de apoptosis, generando un mínimo in vitro sistema de reconstitución con membranas biomiméticas (LUV y GUV). Western blot y citometría de flujo ( Figura 1 ) se utilizaron para distinguir entre la vinculación específica y no específica de Bid y caspasa-8. De hecho, mientras que Bid no interactuó ni con liposomas DOPC ni con liposomas CL +, se encontró que la caspasa-8 interactúa con LUV que contienen CL, dando lugar a la forma activada por CL de p43 kDa ( Figura 1b, c ).

Luego usamos Laurdan como un trazador de fluidez, para estudiar los efectos de caspasa-8, Bid y el complejo caspasa-8 + Bid en un modelo de membrana relevante. Las diferencias en los espectros de excitación y emisión de fluorescencia de Laurdan en la fase de gel y líquido-cristalino permiten utilizar el parámetro de polarización general (GP) para informar sobre los cambios locales en el contenido de agua de la membrana relacionados con los cambios en la fluidez de la membrana debido a la unión a proteínas. . Bid solo no se unió a los liposomas ( Figura 4 ). Por el contrario, caspasa-8 y caspasa-8 más Bid disminuyeron la fluidez de las membranas que contienen CL ( Figura 2 ), como, en menor medida, tBid. Este resultado concuerda con los datos anteriores que indican que la presencia de tBid puede promover la formación de fases no laminares muy curvadas [57]. Un hallazgo sorprendente fue el marcado efecto de la propia procaspasa-8 sobre la membrana y la posterior unión de Bid. El efecto aditivo de la procaspasa-8 y la oferta puede resultar de la adquisición de una actividad funcional completa al vincularse a CL. La interacción de CL con caspasa-8 en la membrana es importante para la progresión de la apoptosis, con la formación de una plataforma de reacción de proteína CL local evidente por el cambio en el valor de GP. Estos resultados arrojan luz sobre el papel de las membranas mitocondriales en la regulación de la actividad de la familia de proteínas Bcl-2 [33].

Los resultados de los experimentos de ruptura-tensión y los de la fluorescencia de Laurdan son complementarios. El enfoque de ruptura-tensión, desarrollado originalmente por Evans y colaboradores [ver [43] y las citas en el mismo], se puede utilizar para cuantificar las propiedades micromecánicas de una película delgada, como una membrana lipídica, mediante el estudio de su deformación. Aquí, el módulo de expansión (Ks) y la tensión de ruptura (& # x003c4r) se evaluaron expandiendo grandes vesículas unilaminares (GUV), cuyas membranas constituían un sistema modelo que imitaba los sitios de contacto mitocondrial. Encontramos que la adición de CL resultó en una marcada disminución en los módulos elásticos de las bicapas lipídicas DOPC, tanto con Ks y & # x003c4r fuertemente afectado Fig. 3b y 3c ). La disminución de Ks después de la adición de CL indica que la membrana se vuelve más fácil de expandir en presencia de este lípido ( Figura 3b ). La molécula de CL tiene una forma cónica inherente en un sistema de fase pura, por lo que se encontraría preferentemente en la fase hexagonal invertida. En el sistema modelo utilizado aquí (CL / DOPC & # x0200a = & # x0200a5 / 95 mol / mol), evitamos intencionalmente establecer tal condición: cada molécula de CL estaba rodeada por moléculas de DOPC. En teoría, el sistema mostró una mezcla casi ideal, ya que las cadenas de los dos lípidos (oleoil-CL y DOPC) eran idénticas. El predominio de las especies que prefieren una fase laminar aseguró el mantenimiento de un estado laminar. El CL se vio, por tanto, estructuralmente frustrado ya que estaba incrustado como un componente menor dentro de la membrana del huésped. Sin embargo, su presencia modifica localmente la curvatura espontánea. Debido a sus cuatro cadenas de hidrocarburos, las moléculas de CL sometidas a fuerzas externas actúan como resortes integrados que se pueden expandir más fácilmente que las moléculas de DOPC, lo que resulta en un menor Ks. Sin embargo, no es posible que el sistema asuma una fase hexagonal y pronto se alcanzan los límites de expansión de la fase laminar. La tensión de ruptura es, por tanto, menor que la del sistema puro. Los datos para el sistema de control puro son consistentes con los datos publicados para vesículas DOPC [58], dando una Ks valor de aproximadamente 200 mN / m.

Luego evaluamos las consecuencias mecánicas de las proteínas en el sistema de control puro y en el modelo de sitio de contacto PC / CL ( Fig. 3 ). Ninguna de las proteínas probadas interactuó fácilmente con la membrana de control de DOPC pura. Las propiedades de las GUV que contienen CL no se modificaron por la unión de Bid, mientras que la unión de caspasa-8, tBid y caspasa-8 más Bid modificó claramente las propiedades mecánicas de estas vesículas ( Fig. 3b y 3c ). La unión de caspasa-8 sola revirtió parcialmente los efectos de CL, lo que indica un papel de CL en la unión. La frustración estructural observada cuando se agrega CL solo se redujo, de modo que el valor del módulo de expansión estaba entre los del sistema de control y el modelo DOPC / CL. La resistencia a la rotura por tracción fue esencialmente la misma que la del sistema puro, estando limitada únicamente por la propia membrana lipídica. Lo más probable es que la caspasa-8 detecte la frustración de la curvatura cerca de las ubicaciones de CL dentro de la membrana y su inserción la compensa parcialmente. tBid solo también se unió a las vesículas modelo (DOPC / CL). En este caso, la respuesta elástica expansiva de la membrana, evaluada mediante el cálculo del módulo Ks, se restauró completamente a la del sistema de control DOPC puro: la adsorción de esta proteína liberó completamente la frustración estructural causada por la presencia de CL. Es probable que todos los sitios de interacción estuvieran saturados. Sin embargo, la presencia de la proteína claramente provocó defectos que debilitaron la membrana a la tensión mecánica. Esto es evidente por el valor muy bajo de la tensión de rotura. Aunque la membrana respondió inicialmente a una fuerza de deformación con un aumento de área similar al del sistema puro, el rango total de capacidad de expansión fue mucho menor y la membrana se rompió cuando la tensión aumentó en & # x0223c 4,2 mN / m, correspondiente a un cambio de & # x0223c 70% con respecto a los sistemas de control (DOPC puro o DOPC / caspasa-8). Evidentemente, se formaron dos dominios con diferentes propiedades elásticas. La mayor parte de la membrana consiste en DOPC esencialmente puro y no participa en la interacción o establecimiento de una plataforma de reacción. Por tanto, sus propiedades elásticas no se modifican, de modo que la K observadas era & # x0223c200 mN / m. La otra parte de la membrana, que contiene CL como iniciador de una plataforma de reacción, es más rígida. No contribuye de manera perceptible a la capacidad de expansión de la membrana, pero limita la resistencia general, como lo demuestra el bajo valor de & # x003c4r. Se observó un comportamiento similar para caspasa-8 más Bid, dentro de los límites de resolución experimental y en línea con los resultados de GP obtenidos con LUV. Todos estos hallazgos son consistentes con las interacciones descritas recientemente entre Bcl-XL [59] y tBid. Confirmamos que CL juega un papel esencial en la asociación entre caspasa-8 y membranas biomiméticas ( Figura 6 ), y muy probablemente también membranas biológicas [25]. Sugerimos que CL es un componente de la plataforma de reacción formada posteriormente (que también contiene caspasa-8 y Bid), en la que actúa como cofactor para la activación de caspasa-8. A medida que se forma la plataforma, adquiere inmediatamente su función enzimática, pero solo si CL está presente ( Figura 4 y Figura 5 ). La producción de tBid en presencia de caspasa-8, cuando interactúa con qué CL, promueve la degradación de vesículas, este efecto se inhibe si se agregan inhibidores de caspasa-8 al sistema [41]. Estos resultados indican que la presencia de caspasa-8 unida a CL es esencial para la formación del llamado & # x0201cmitosoma & # x0201d [25], [41]. Además de las interacciones entre CL y caspasa-8, también puede haber interacciones proteína-proteína en vivo. No está claro si otras proteínas, como Rab5 [60], [61], que requiere la activación de la caspasa-8, o BAR [54] y FLASH, que median la translocación de la caspasa-8 a las mitocondrias [62], [63], [ 64], juegan un papel auxiliar en la relación funcional entre caspasa-8 y CL. Posiblemente, MTCH2 / MIMP [65] y su papel en el reclutamiento de tBid puede actuar en sinergia con la formación de mitosomas inducida por CL para facilitar la MOMP. El trabajo que informamos aquí amplía nuestro conocimiento de la señalización proapoptótica inducida por Bid y proporciona una descripción del papel de CL en el reclutamiento y activación de capsasa-8 en la superficie de la membrana externa mitocondrial. Sin embargo, estamos lejos de comprender todas las intrincadas y complejas alteraciones e interacciones moleculares que conducen a la activación de Bid, la permeabilización de la membrana mitocondrial y la apoptosis a través de la vía mitocondrial después de la estimulación de los receptores de muerte.

(a) El diagrama muestra la secuencia de eventos en células de tipo II según Gonzalvez et al. [25]. La plataforma CL (cabezas rojas) / caspasa-8 en los sitios de contacto entre las membranas mitocondriales internas y externas (enriquecidas en CL) se une a BID dando como resultado la producción de la parte C-termimal truncada activa de BID (tcBID). Esto a su vez provoca perturbaciones inducidas por CL de la curvatura de la membrana, oligomerización de BAK / BAX y citocromo. C liberación. (b) Representación esquemática de la plataforma funcional reconstituida en vesículas unilaminares gigantes que contienen CL con la p18/pag10. DD, dominio de muerte DED, dominio efector de muerte p10 y p18 forman el núcleo catalítico de la caspasa. La isoforma p43 / p10 caspasa-8 comprende dos DED, un dominio p10 y un dominio p18. IMM, membrana mitocondrial interna IMS, espacio entre membranas OM, membrana mitocondrial externa. Puntos rojos en el espacio intermembrana, citocromo C y la cabeza violeta corresponde a la cardiolipina en los sitios de contacto entre la membrana externa e interna.

Los resultados que presentamos demuestran y describen los roles esenciales que juegan los lípidos en los procesos biológicos. En particular, proporcionan nuevos conocimientos sobre cómo los lípidos específicos de las mitocondrias como el CL pueden tener funciones activas que van mucho más allá de simplemente constituir una matriz para las actividades de las proteínas. De hecho, los lípidos funcionales parecen contribuir no solo a modular las interacciones entre los miembros de la familia Bcl-2, sino también como actores clave en los procesos de reconocimiento, como lo demuestra el ejemplo de cardiolipina que desencadena la activación de caspasa-8 en el proceso apoptótico.


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