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Reglas de diseño para enlazadores de ADN


Quiero usar enlazadores de ADN de doble hebra para unir físicamente dos "cosas"juntos, injertando ADNss en cada uno de ellos y utilizando la hibridación del ADN como mecanismo de bloqueo.

No espero que la naturaleza de las dos cosas sea importante para esta pregunta, pero si lo es, digamos que quiero unir una superficie sólida y una proteína.

Digamos que mi única restricción es que quiero que esta reticulación sea estable a 37 ° C.

Hay un trillón formas en las que podría diseñar las secuencias, y prácticamente cualquier cosa por encima de 20 pb sin autocomplementariedades masivas debería funcionar, en teoría. Pero no me gusta elegir bases al azar. Entonces, mi pregunta es la siguiente: ¿hay algo que pueda buscar, excepto las dos restricciones anteriores, para diseñar una buena secuencia de enlazadores?

Por ejemplo, si la temperatura de fusión es 50 ° C frente a 65 ° C, esperaría que la estructura fuera estable (constantes de disociación infinitesimales en ambos casos). ¿Habría alguna razón para elegir uno sobre el otro, excepto tal vez por el precio de síntesis de oligo? Para una temperatura de fusión dada, ¿hay alguna diferencia entre una secuencia larga rica en AT y una secuencia corta rica en GC?


Es posible que desee elegir algo que tenga poca o ninguna homología con cualquier cosa que exista en cualquier organismo en las bases de datos, por si acaso.

La intuición dice que se debe optar por oligos equilibrados en el medio entre ricos en AT y ricos en GC, y no tener repeticiones u homopolímeros. Si opta por los ricos en AT, su complemento será rico en GC y viceversa. Estoy bastante seguro de que entonces habría una diferencia en las propiedades mecánicas de los dos oligos; sin embargo, tal vez esto sea algo útil por otras razones.

Parece que la mayoría de los principios de diseño pueden ser restricciones (no hacer) en lugar de objetivos (dos), por lo que podría hacerlo peor que tener un generador que produzca secuencias aleatorias y califique cada una de ellas en función de las diversas restricciones. Aleatorio parece estar bien, si luego está comprobando cada par elegido al azar con algunas reglas estrictas. Luego, elija diez pares que tengan una buena puntuación, hágalos sintetizar y vea si funciona ...


Los ingenieros utilizan 'origami de ADN' para identificar las reglas de diseño de vacunas

Al plegar el ADN en una estructura similar a un virus, los investigadores del MIT han diseñado partículas similares al VIH que provocan una fuerte respuesta inmune de las células inmunitarias humanas cultivadas en una placa de laboratorio. Estas partículas podrían eventualmente usarse como vacuna contra el VIH.

Las partículas de ADN, que imitan de cerca el tamaño y la forma de los virus, están recubiertas con proteínas o antígenos del VIH, dispuestos en patrones precisos diseñados para provocar una fuerte respuesta inmune. Los investigadores ahora están trabajando en la adaptación de este enfoque para desarrollar una vacuna potencial para el SARS-CoV-2, y anticipan que podría funcionar para una amplia variedad de enfermedades virales.

"Las reglas de diseño aproximadas que están comenzando a surgir de este trabajo deberían ser genéricamente aplicables a todos los antígenos y enfermedades", dice Darrell Irvine, profesor de Underwood-Prescott con nombramientos en los departamentos de Ingeniería Biológica y Ciencia e Ingeniería de Materiales y director asociado del Instituto Koch de Investigación Integrativa del Cáncer del MIT y miembro del Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard.

Irvine y Mark Bathe, profesor de ingeniería biológica del MIT y miembro asociado del Broad Institute of MIT y Harvard, son los autores principales del estudio, que aparece hoy en Nanotecnología de la naturaleza. Los autores principales del artículo son los ex postdoctorados del MIT R & eacutemi Veneziano y Tyson Moyer.

Debido a que las moléculas de ADN son altamente programables, los científicos han estado trabajando desde la década de 1980 en métodos para diseñar moléculas de ADN que podrían usarse para la administración de medicamentos y muchas otras aplicaciones, más recientemente utilizando una técnica llamada origami de ADN que fue inventada en 2006 por Paul Rothemund de Caltech. .

En 2016, el laboratorio de Bathe desarrolló un algoritmo que puede diseñar y construir automáticamente formas tridimensionales arbitrarias similares a virus utilizando origami de ADN. Este método ofrece un control preciso sobre la estructura del ADN sintético, lo que permite a los investigadores unir una variedad de moléculas, como antígenos virales, en ubicaciones específicas.

"La estructura del ADN es como un tablero de clavijas donde los antígenos se pueden unir en cualquier posición", dice Bathe. "Estas partículas similares a virus ahora nos han permitido revelar los principios moleculares fundamentales del reconocimiento de células inmunes por primera vez".

Los virus naturales son nanopartículas con antígenos dispuestos en la superficie de la partícula, y se cree que el sistema inmunológico (especialmente las células B) ha evolucionado para reconocer de manera eficiente tales antígenos particulados. Ahora se están desarrollando vacunas para imitar las estructuras virales naturales, y se cree que tales vacunas de nanopartículas son muy efectivas para producir una respuesta inmune de células B porque tienen el tamaño adecuado para ser transportadas a los vasos linfáticos, que las envían directamente a las células B en espera. en los ganglios linfáticos. Las partículas también tienen el tamaño adecuado para interactuar con las células B y pueden presentar una densa matriz de partículas virales.

Sin embargo, determinar el tamaño de partícula correcto, el espaciamiento entre antígenos y el número de antígenos por partícula para estimular de manera óptima las células B (que se unen a los antígenos diana a través de sus receptores de células B) ha sido un desafío. Bathe e Irvine se propusieron usar estos andamios de ADN para imitar tales estructuras de partículas virales y de vacunas, con la esperanza de descubrir los mejores diseños de partículas para la activación de células B.

"Existe mucho interés en el uso de estructuras de partículas similares a virus, en las que se toma un antígeno de vacuna y lo coloca en la superficie de una partícula, para generar respuestas óptimas de las células B", dice Irvine. "Sin embargo, las reglas sobre cómo diseñar esa pantalla realmente no se comprenden bien".

Otros investigadores han intentado crear vacunas de subunidades utilizando otros tipos de partículas sintéticas, como polímeros, liposomas o proteínas autoensambladas, pero con esos materiales no es posible controlar la ubicación de las proteínas virales con tanta precisión como con el origami de ADN.

Para este estudio, los investigadores diseñaron partículas icosaédricas con un tamaño y forma similares a los de un virus típico. Unieron un antígeno del VIH modificado por ingeniería relacionado con la proteína gp120 al andamio a una variedad de distancias y densidades. Para su sorpresa, encontraron que las vacunas que producían la respuesta más fuerte de las células B no eran necesariamente las que empaquetaban los antígenos lo más cerca posible de la superficie del andamio.

"A menudo se asume que cuanto mayor sea la densidad del antígeno, mejor, con la idea de que acercar los receptores de las células B lo más cerca posible es lo que impulsa la señalización. Sin embargo, el resultado experimental, que fue muy claro, fue que en realidad lo más cercano posible el espaciamiento que pudimos hacer no fue el mejor. Y, a medida que se amplía la distancia entre dos antígenos, la señalización aumentó ", dice Irvine.

Los hallazgos de este estudio tienen el potencial de guiar el desarrollo de la vacuna contra el VIH, ya que el antígeno del VIH utilizado en estos estudios se está probando actualmente en un ensayo clínico en humanos, utilizando un andamio de nanopartículas de proteínas.

Basándose en sus datos, los investigadores del MIT trabajaron con Jayajit Das, profesor de inmunología y microbiología en la Universidad Estatal de Ohio, para desarrollar un modelo que explique por qué mayores distancias entre antígenos producen mejores resultados. Cuando los antígenos se unen a receptores en la superficie de las células B, los receptores activados se entrecruzan entre sí dentro de la célula, mejorando su respuesta. Sin embargo, el modelo sugiere que si los antígenos están demasiado juntos, esta respuesta disminuye.

En los últimos meses, el laboratorio de Bathe ha creado una variante de esta vacuna con los laboratorios de Aaron Schmidt y Daniel Lingwood en el Instituto Ragon, en el que intercambiaron los antígenos del VIH por una proteína que se encuentra en la superficie del virus SARS-CoV-2. Ahora están probando si esta vacuna producirá una respuesta eficaz contra el coronavirus SARS-CoV-2 en células B aisladas y en ratones.

"La tecnología de nuestra plataforma le permite intercambiar fácilmente diferentes subunidades de antígenos y péptidos de diferentes tipos de virus para probar si pueden ser potencialmente funcionales como vacunas", dice Bathe.

Debido a que este enfoque permite que los antígenos de diferentes virus se transporten en el mismo andamio de ADN, podría ser posible diseñar variantes que se dirijan a múltiples tipos de coronavirus, incluidas las variantes pasadas y potencialmente futuras que puedan surgir, dicen los investigadores.


Abstracto

El recubrimiento de partículas coloidales con ADN es una estrategia prometedora para fabricar materiales funcionales a nanoescala porque las partículas pueden programarse para autoensamblarse espontáneamente en estructuras complejas y ordenadas. En este artículo, exploramos el comportamiento de fase y los tipos de estructuras que se pueden formar cuando las interacciones entre coloides recubiertos de ADN se especifican mediante cadenas de ADN enlazador dispersas en solución. Mostramos que las interacciones mediadas por enlazadores dirigen el autoensamblaje de coloides en estructuras cristalinas en equilibrio. Además, demostramos cómo diferentes secuencias y concentraciones de enlazadores producen diferentes redes cristalinas, cuya simetría y orden de composición están codificados exclusivamente por las interacciones mediadas por enlazadores. Estos resultados ilustran cómo se pueden utilizar enlazadores para separar las instrucciones de ensamblaje, codificadas en los enlazadores, de los propios coloides. También examinamos el comportamiento de fase de los enlazadores asimétricos, que se unen con más fuerza a una especie coloidal que a la otra. Encontramos que la asimetría influye fuertemente en la dependencia de la concentración de las interacciones coloidales, que explicamos usando un modelo de campo medio. También encontramos evidencia de que los enlazadores asimétricos podrían ayudar a reducir los cuellos de botella cinéticos a la cristalización coloidal. Juntos, nuestros hallazgos amplían las reglas de diseño del autoensamblaje mediado por enlazadores y establecen conexiones entre los diversos esquemas para programar el ensamblaje de coloides recubiertos de ADN que se informa en la literatura.


Rompiendo las reglas de la biología para vencer las enfermedades genéticas raras

Como un registro que se salta, nuestro código genético tiene miles de regiones conocidas como microsatélites donde se repiten combinaciones cortas de pares de bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). En su mayor parte, estas repeticiones son inofensivas. Pero en los últimos años, los científicos han logrado conocimientos importantes sobre cómo a veces pueden expandirse demasiado y causar enfermedades genéticas, como la enfermedad de Huntington (EH) y una forma de esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En conjunto, unas 40 condiciones en total son causadas por expansiones patológicas de estas repeticiones.

A medida que los investigadores profundizan en su comprensión de los trastornos de expansión repetidos, se sorprenden continuamente de cuánto de la ciencia rompe las reglas comunes de la biología. "Hay tanto en esta área que es extraño o inesperado", dice Christine Bulawa, directora senior de la Unidad de Investigación de Enfermedades Raras de Pfizer, con sede en el sitio de investigación de Kendall Square en Cambridge, Massachusetts. "Parte de la moraleja de la historia es prestar realmente atención a los datos, y cuando los datos son sólidos pero no lo esperamos, es ahí donde tenemos más que aprender".

En un esfuerzo por acelerar el descubrimiento en los trastornos de expansión repetida, la Innovative Target Exploration Network (RIED) de Pfizer está trabajando con investigadores académicos de todo el mundo para adaptar la biología emergente para crear nuevas terapias. “Las expansiones repetidas indudablemente causan un montón de enfermedades”, dice Stefan McDonough, Director Ejecutivo de Genética de Pfizer, también con sede en Kendall Square. “Y lo que está demostrando la genética es que existe una posible estrategia terapéutica para modificar este ADN expandido directamente para prevenir o detener muchas enfermedades que en este momento son probablemente algunas de las peores que tenemos”.

Siga leyendo para obtener más información sobre la ciencia de "romper las reglas" detrás de los trastornos de expansión repetidos.

Regla 1: Nuestro ADN se establece desde el nacimiento y no cambia.

Algunos de los primeros conocimientos sobre los trastornos de expansión repetida se realizaron en pacientes con la enfermedad de Huntington (EH), una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada por la acumulación de placas de proteínas en el cerebro. Los científicos descubrieron que los pacientes con EH compartían un rasgo común: dentro de su gen HTT, tenían una sección del código de nucleótidos del ADN, CAG, que se repetía entre 41 y 60 veces, lo que conducía a la creación de proteínas potencialmente tóxicas. En personas sanas, CAG solo se repite de 10 a 35 veces. Pero en los pacientes con EH, a medida que avanzaba la enfermedad, las expansiones continuaron creciendo en ciertos tipos de células, como las neuronas. “Los datos indicaron que su ADN estaba cambiando en las neuronas que habían dado lugar a los síntomas, y no solo un poquito. Pasó de un segmento de genes expandido de 41 a miles de repeticiones ”, dice Bulawa. En otras palabras, aunque el ADN de las células cerebrales afectadas no se replica (porque esas células no se dividen), puede ocurrir este fenómeno de expansión somática, que rompe las reglas.

Regla 2: las mutaciones en regiones de ADN no codificantes no se pueden vincular a enfermedades.

Según el dogma central clásico de la biología, el ADN codifica el ARN, que luego codifica las proteínas que son un medio principal de la función celular. Además del hecho de que eso solo puede ser cierto para el 1 al 1,5% de los pares de bases de ADN dentro del genoma, hay mucho más cuando observa más de cerca la composición del ADN: hay "regiones" específicas que codifican proteínas, y aquellos están separados por diferentes regiones que no lo hacen. A medida que los científicos comenzaron a descubrir expansiones repetidas en esas regiones no codificantes de nuestro ADN, comenzaron a explorar cómo las mutaciones en estas regiones también pueden conducir a proteínas y enfermedades disfuncionales. “De acuerdo con la biología clásica, las repeticiones en estas regiones no codificantes deberían simplemente salirse en bucle”, dice McDonough. "Lo que estamos encontrando es que las enfermedades son causadas por estructuras que no están incluidas en la proteína".

Regla 3: cuanto más prolongada sea la expansión repetida, antes desarrollará la enfermedad.

Para la mayoría de las enfermedades de expansión repetida, cuanto mayor sea la duración de la expansión repetida, más temprano será el inicio de la enfermedad. Pero estudios recientes han examinado a pacientes que se desvían de esta regla: desarrollaron la enfermedad mucho antes o después de lo que habían predicho sus longitudes de expansión repetidas. Al observar de cerca a estos pacientes, los científicos descubrieron que tenían ciertos modificadores o mecanismos de reparación del ADN que ayudaron a protegerlos del desarrollo de la enfermedad o hicieron que comenzara antes. “Algunos de estos modificadores están ayudando a las personas a vivir más tiempo”, dice Bulawa. "Queremos poder imitar el modificador protector y aplicarlo a una variedad de enfermedades de expansión repetida".


Diseño inteligente de ADN y amplificador

Un ex geofísico y profesor universitario, Stephen C. Meyer defendió la existencia de un diseño inteligente (DI) basado en el ADN y la evidencia científica de campos como la biología, la física, la química y la cosmología. Estos nuevos descubrimientos han superado el enfoque darwiniano, que nunca abordó de dónde vino la primera vida, dijo. La vida celular más temprana que surgió hace 3.800 millones de años, como las algas verdiazules, no fue sencilla en absoluto según la investigación de biología molecular. Más bien, tal vida celular era una "fábrica" ​​altamente compleja que se ejecutaba en un código de ADN que era similar a la tecnología avanzada, detalló, y este ADN refleja el diseño deliberado de una fuerza inteligente.

No necesariamente necesitamos la religión en la imagen para concluir que el DI está en efecto, dijo, pero de las dos teorías sobre quién es el diseñador: extraterrestres o un ser Dios, Meyer favorece la última explicación. La evidencia del diseño está en el tejido mismo del universo mismo, comentó.

El materialismo es la opinión de que todo en el universo puede explicarse en última instancia en términos físicos, pero la materia es un mal candidato para ser la realidad primordial, afirmó Meyer. Los sistemas biológicos contienen intrincadas estructuras de información y su origen no puede explicarse solo por fuerzas físicas, dijo.


El conocimiento del ADN es nanopoder

El ADN no solo ha ayudado a diseñar cristales, sino que ha llevado a la creación de intrincadas nanomáquinas. Uno de los principales beneficios de la nanotecnología del ADN es que es una molécula tan bien estudiada. Debido a que lo entendemos tan bien, las estructuras se pueden ensamblar de maneras muy exactas. Si pensamos en el ADN como ladrillos de Lego muy pequeños, entonces estos ladrillos se pueden ensamblar automáticamente en una amplia variedad de formas y estructuras a nanoescala. Esto permite lo que parece un montaje automático, como ocurre con el nano-Voltron. Además, debido a la naturaleza altamente programable del ADN, se puede utilizar para construir estructuras más grandes y complejas.

Con los pares de bases de ADN, la adenina (A) siempre se empareja con la timina (T) y la guanina (G) siempre se empareja con la citosina (C). Estas "reglas" ayudan a diseñar estructuras complejas. Imagen de Madprime a través de Wikimedia Commons.

¿Qué significa programable aquí? Bueno, significa que el ADN sigue reglas de emparejamiento de bases muy específicas. Estas reglas establecen que cada base de un nucleótido tiene un compañero al que siempre se unirá. La adenina (A) se une a la timina (T) y la guanina (G) se une a la citosina (C). Podemos pensar en los As y Ts como los bloques de Lego de dos tachuelas, y los Ts y Gs como los bloques de Lego de tres tachuelas. Los bloques de dos tachuelas encajan perfectamente, pero no combinan bien con los demás. Lo mismo ocurre con los bloques Lego de tres tachuelas. Estas reglas permiten a los científicos diseñar estructuras muy detalladas. Los científicos han desarrollado poliedros (formas 3D con más de 6 lados), nanot pinzas, un Voltron a nanoescala y más.

Debido a que la gama de nanoestructuras de ADN que se pueden crear es tan amplia, las formas en que se pueden usar también parecen ilimitadas. Se están utilizando muchas nanoestructuras en el campo de la medicina, a menudo como vehículos de administración de fármacos. La carga de la droga ha variado desde pequeñas moléculas hasta proteínas más grandes.

Una ventaja de la nanotecnología de ADN es que puede programar en herramientas que pueden controlar la liberación de la carga. Sabemos cómo el ADN se ve afectado por su entorno, por lo que los cambios se pueden utilizar como herramientas para alterar la forma de la estructura y liberar la carga. De esta manera, un medicamento de interés podría entregarse en un lugar específico en el momento deseado.

Un gran revés del uso de ADN en nanomáquinas es la facilidad con que el ADN se descompone. Puede ser difícil para una estructura llegar a un tejido objetivo antes de que se descomponga el ADN. Sin embargo, estos problemas son el foco de la investigación actual. Con el tiempo, los investigadores esperan poder construir estructuras de la misma complejidad que la naturaleza ha construido a lo largo de millones de años.


MODELO DE IMPLEMENTACIÓN Y DATOS

El sitio web de GenoCAD está escrito en una combinación de PHP y JavaScript y se ejecuta en un servidor Apache. La base de datos MySQL está en un servidor diferente y ambos servidores usan el sistema operativo Linux. La página de validación se basa en un analizador personalizado desarrollado en C ++.

El modelo de datos para GenoCAD se resume en la Figura 6. Cada diseño está asociado con una biblioteca de partes específica que, a su vez, está vinculada a una gramática específica. Se pueden asociar múltiples bibliotecas públicas y definidas por el usuario con cada gramática y se pueden asociar múltiples diseños con una biblioteca específica. Las partes definidas por los usuarios deben asociarse con una de las bibliotecas de partes del usuario.

Modelo de datos de GenoCAD. Cada gramática abarca un conjunto de reglas mediante las cuales se pueden diseñar construcciones. La gramática también define las categorías de partes que están disponibles para diseñar las construcciones. Para cada gramática hay una colección de partes públicas (rectángulo azul sólido), que constituyen una biblioteca de partes disponible públicamente (rectángulo azul discontinuo). Se pueden crear "Bibliotecas de usuario" a partir de cualquier subconjunto de las partes públicas, y esta biblioteca se puede complementar con partes creadas por el usuario (rectángulo rojo sólido). Aquí se muestran dos bibliotecas de usuario (rectángulos de línea discontinua, roja y discontinua, verde) que contienen diferentes subconjuntos de partes públicas y creadas por el usuario. La biblioteca de usuario 2 contiene todas las piezas creadas por el usuario. Cuando se crea un diseño, todas las partes para completar el diseño deben estar contenidas en una sola biblioteca.

Modelo de datos de GenoCAD. Cada gramática abarca un conjunto de reglas mediante las cuales se pueden diseñar construcciones. La gramática también define las categorías de partes que están disponibles para diseñar las construcciones. Para cada gramática hay una colección de partes públicas (rectángulo azul sólido), que constituyen una biblioteca de partes disponible públicamente (rectángulo azul discontinuo). Se pueden crear "Bibliotecas de usuario" a partir de cualquier subconjunto de las partes públicas, y esta biblioteca se puede complementar con partes creadas por el usuario (rectángulo rojo sólido). Aquí se muestran dos bibliotecas de usuario (rectángulos de línea discontinua, roja y discontinua, verde) que contienen diferentes subconjuntos de partes públicas y creadas por el usuario. La biblioteca de usuario 2 contiene todas las piezas creadas por el usuario. Cuando se crea un diseño, todas las partes para completar el diseño deben estar contenidas en una sola biblioteca.

Este modelo de datos simple tiene varias limitaciones. Dado que muchas partes, como las secuencias de codificación, se pueden usar en diferentes organismos, sería deseable reemplazar el modelo de datos jerárquico actual por un modelo más refinado que permita usar la misma parte en múltiples bibliotecas y gramáticas. También sería deseable definir partes correspondientes a regiones codificantes por sus secuencias de aminoácidos en lugar de limitarse a una secuencia de ADN con codones que sean óptimos para la expresión en un organismo específico.

Se definirán gramáticas adicionales para el uso de aplicaciones específicas o para aplicaciones relevantes para organismos específicos en colaboración con expertos en organismos o dominios. La definición de categorías de piezas y estrategias de diseño adecuadas para una aplicación en particular requerirá un diálogo entre biólogos e informáticos que tengan experiencia en el desarrollo gramatical. Una vez acordadas, las gramáticas se pueden registrar fácilmente en la base de datos MySQL. Aunque sería atractivo orientar al usuario en la definición de nuevas gramáticas, la complejidad de este proceso hace que sea poco probable que sea posible desarrollar un asistente de construcción gramatical en un futuro previsible.


El ADN impulsa los principios de diseño para pantallas ópticas más ligeras y delgadas

Crédito: CC0 Public Domain

El ADN es sin duda la base de la vida. Pronto también podría ser la base de sus dispositivos electrónicos.

Un equipo de la Universidad de Northwestern ha desarrollado un nuevo conjunto de principios de diseño para hacer cristales fotónicos similares a los que se usan normalmente en pantallas de computadoras, televisores y teléfonos inteligentes. Al utilizar ADN sintético para ensamblar partículas en celosías cristalinas, los investigadores han abierto la puerta a pantallas mucho más ligeras y delgadas en comparación con lo que está disponible actualmente.

"La mayoría de la gente mira la pantalla de una computadora portátil todos los días, pero pocas personas comprenden de qué están hechas y por qué", dijo George Schatz, profesor de química Charles E. y Emma H. ​​Morrison en la Facultad de Artes y Ciencias Weinberg de Northwestern. "Un componente de la pantalla es el reflector trasero, un dispositivo similar a un espejo que dirige la luz emitida por la pantalla LCD al espectador. Estos reflectores están hechos con polímeros en capas que son mucho más gruesos y pesados ​​que nuestros cristales".

El enfoque de Northwestern no solo reemplaza estos polímeros con nanocristales de oro, sino que también los separa para dejar aire entre ellos. El resultado es una estructura más ligera, más compacta, diseñada con precisión y reconfigurable que sigue siendo altamente reflectante.

La investigación se publicó ayer en línea en el procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias (PNAS). Schatz y Chad Mirkin, director del Instituto Internacional de Nanotecnología de Northwestern y profesor de química George B. Rathmann, fueron los coautores correspondientes del artículo.

Aunque el ADN casi siempre se asocia con organismos vivos, desde bacterias simples hasta humanos complejos, el ADN utilizado en el estudio se sintetiza y manipula químicamente en lugar de derivarse de células vivas. En 1996, Mirkin inventó formas de vincular el ADN sintético con nanopartículas de oro para producir nuevos materiales que no se encuentran en la naturaleza, para utilizar esencialmente el "modelo de la vida" para programar su formación. Estas estructuras se han convertido en la base de más de 1.800 productos utilizados en todo el mundo, principalmente en las ciencias de la vida.

Luego, en 2008, Mirkin y Schatz colaboraron para hacer cristales a partir de partículas unidas por ADN. Al unir hebras de ADN sintético a diminutas esferas de oro, el dúo descubrió que podían construir estructuras cristalinas tridimensionales. Cambiar la secuencia de Gs, As, Ts y Cs de la cadena de ADN cambia la forma de la estructura cristalina, lo que permite a los investigadores organizar las partículas de manera diferente en el espacio. Se han creado más de 500 tipos de cristales, que abarcan más de 30 simetrías de cristal diferentes utilizando este enfoque, lo que lo convierte en una forma poderosa y fundamentalmente nueva de programar la formación de materia cristalina.

A pesar de haber realizado avances sofisticados con este trabajo desde 2008, Mirkin y Schatz inicialmente no se dieron cuenta de que las celosías de cristal que fabricaban en el laboratorio tenían propiedades ópticas similares a las capas de polímero que se encuentran en las pantallas de los dispositivos.

"A través del modelado por computadora, nos dimos cuenta por accidente de que los materiales cristalinos con nanopartículas de oro tenían propiedades que pasamos por alto anteriormente en el trabajo", dijo Schatz. "Luego optimizamos las propiedades ópticas mediante cálculos, y estos demostraron que las esferas metálicas que no se tocan podrían, en algunos casos, ser mejores que las esferas de polímero que se tocan".

Después de hacer los cristales en el laboratorio, los equipos de Mirkin y Schatz midieron las propiedades ópticas de los cristales para encontrar que su modelado computacional era realmente correcto. Aunque solo probaron la naturaleza reflectante de la red cristalina en el documento PNAS actual, el método podría conducir a muchos tipos de materiales de "diseñador" funcionales que utilizan el autoensamblaje impulsado por ADN.

"La generalidad del enfoque y las reglas de diseño son bastante extraordinarias e independientes de la composición de las partículas", dijo Mirkin. "Esto lleva lo que concebimos inicialmente en la década de 1990 a alturas completamente nuevas".


La información de la secuencia de plásmidos se puede obtener de la base de datos de GenBank:

Pureza

Contiene & gt70% de forma circular cerrada covalentemente de doble hebra I (RF I)

Almacenamiento

Concentración

Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM

Información adicional del producto

Consulte el Certificado de análisis del producto para obtener información sobre las condiciones de almacenamiento, los componentes del producto y las especificaciones técnicas. Consulte la Lista de componentes del kit para determinar los componentes del kit. Los certificados de análisis y las listas de componentes del kit se encuentran en la pestaña Documentos.

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Materiales y métodos

MethMarker está implementado en Java (se requiere la versión 1.5 o posterior). Es independiente de la plataforma y se puede iniciar directamente desde un navegador web. El software viene con un tutorial de estudio de caso que demuestra el diseño, optimización y validación de un biomarcador de metilación de ADN basado en MGMT gene. La interfaz de usuario de MethMarker refleja el flujo de trabajo para el diseño, la optimización y la validación de biomarcadores que se describe en la Figura 1.

Paso 1: importación de datos

Como primer paso, se importa el DMR de interés. MethMarker admite varios formatos de secuencia, incluidos FASTA, GenBank y EMBL. Las regiones típicas de interés incluyen los promotores de genes supresores de tumores e islas CpG que exhiben hipermetilación específica del cáncer. Sin embargo, MethMarker no impone restricciones sobre el tipo de región a analizar. Por tanto, MethMarker se puede aplicar no solo a cánceres humanos, sino más generalmente a epigenotipado en todo tipo de organismos que exhiben metilación de dinucleótidos CpG.

Los perfiles de metilación de ADN de alta resolución para un subconjunto de casos y controles son cruciales para el proceso de optimización de MethMarker, ya que proporcionan el conjunto de entrenamiento en el que todos los biomarcadores candidatos se optimizan y validan computacionalmente. Estos perfiles suelen derivarse mediante secuenciación de bisulfito clonal [33] o espectrometría de masas y preprocesados ​​con las herramientas adecuadas. MethMarker puede importar directamente perfiles de metilación de ADN de archivos generados con BiQ Analyzer [20], QUMA [21] y EpiTYPER [22], y es fácil convertir datos de metilación de ADN de una fuente diferente a un formato que MethMarker puede leer.

Una vez completada la importación de datos, MethMarker muestra un perfil de metilación de ADN de alta resolución de la región de interés, visualizado como diagramas de paleta o como diagramas de propensión a la metilación. Internamente, MethMarker utiliza la alineación de secuencia de Needleman-Wunsch [34] para corregir el solapamiento incompleto entre la región objetivo y los perfiles de metilación del ADN. Por tanto, es posible enlosar una gran región objetivo con varios amplicones de secuenciación de bisulfito.

Opcionalmente, MethMarker puede anotar la región con el sitio de inicio de la transcripción y las posiciones del exón recuperadas del UCSC Genome Browser [27]. Con ese fin, MethMarker realiza una búsqueda BLAT automática en el sitio web UCSC Genome Browser, obtiene las coordenadas genómicas de la región y recupera la información del exón para los genes RefGene superpuestos del UCSC Table Browser. Los datos sobre polimorfismos de un solo nucleótido se adquieren de la misma manera, lo que permite a MethMarker evitar los sitios polimórficos al diseñar ensayos de metilación del ADN. Todos los datos de las anotaciones se pueden revisar y modificar manualmente.

Paso 2: diseño de ensayos de metilación de ADN

MethMarker implementa el diseño de ensayo automático para seis métodos experimentales comúnmente utilizados para el análisis de metilación del ADN: COBRA, bisulfito SNuPE, pirosecuenciación de bisulfito, MethyLight, MSP y MeDIP-qPCR. Los primeros cinco métodos utilizan el tratamiento con bisulfito del ADN genómico para detectar indirectamente la metilación del ADN. Sin embargo, difieren en la forma en que interrogan la cantidad de metilación del ADN, lo que genera restricciones experimentales específicas que limitan la aplicación de cada método para analizar un subconjunto de posiciones CpG. El sexto método, MeDIP-qPCR, utiliza un enfoque basado en anticuerpos para enriquecer el ADN genómico metilado, lo que conduce a limitaciones experimentales bastante diferentes [35]. Para todos los métodos, se desarrollaron reglas de diseño de ensayo, revisadas por expertos en el dominio y se implementaron en MethMarker, como se describe con más detalle en el diálogo de diseño de ensayo de MethMarker. Sin embargo, se recomienda que todos los cebadores diseñados con MethMarker sean revisados ​​por el experimentador antes de realizar el pedido, para excluir problemas como horquillas, autodímeros y dímeros cruzados, que MethMarker no comprueba automáticamente.

Todos los ensayos de metilación de ADN diseñados automáticamente pueden ser visualizados, revisados ​​o excluidos por el usuario, por ejemplo, basándose en los resultados de experimentos anteriores. Además, MethMarker permite a los usuarios definir e incorporar ensayos personalizados, lo que permite que el software incluya métodos experimentales que no son compatibles directamente.

Paso 3: puntuación de los ensayos de metilación del ADN

Según las muestras para las que se encuentran disponibles perfiles de metilación de ADN de alta resolución (consulte el paso 1), MethMarker puntúa todos los ensayos de metilación de ADN en términos de su correlación con el nivel general de metilación de ADN en cada muestra. Los valores de medición de los ensayos de metilación del ADN se calculan directamente a partir de los perfiles de metilación del ADN de alta resolución, utilizando un conjunto de reglas específicas del método. Para COBRA, bisulfito SNuPE y pirosecuenciación de bisulfito, el valor de medición se calcula simplemente como el nivel medio de metilación del ADN de los sitios CpG analizados, basándose en los perfiles de metilación del ADN de alta resolución de la muestra respectiva. For MSP, MethyLight and MeDIP-qPCR, the measurement value is calculated as the percentage of individual clones in which all participating CpG sites are simultaneously methylated. To better resemble real PCR conditions, for MSP and MethyLight a single CpG position is allowed to have an incorrect methylation value. While simulated measurements cannot replace experimental validation of the resulting DNA methylation assays (see [36] for a discussion of the limitations of simulating DNA methylation measurements en silico), they provide a suitable indication for identifying the most predictive DNA methylation assays to be included in the optimization step.

Step 4: biomarker optimization

From the list of DNA methylation assays, ranked by their correlation with the overall DNA methylation levels of the training samples, the user can select a subset for biomarker optimization. MethMarker then scores all possible combinations of the selected DNA methylation assays and again assesses the correlation with the overall DNA methylation levels of the training samples. To allow for fair comparison between assay sets of different sizes, no weight fitting is performed at this stage. Rather, the score value of each combination is calculated as the mean measurement value of all contributing DNA methylation assays. The results of this comparison are listed in the order of decreasing correlation coefficients, and the user can select a subset of the most highly scoring combinations of DNA methylation assays for optimization and computational validation as candidate biomarkers, a procedure that is performed as follows.

First, the training samples are classified into cases and controls. This classification can be performed based on known sample information (for example, tumor samples versus normal tissue annotation) or based on the DNA methylation profiles themselves, using one of the following methods: a fixed threshold on the average DNA methylation level, hierarchical clustering, or K-means clustering with K = 2. In all cases, the DNA methylation profiles in the subset with the higher average methylation levels are labeled as methylated 'cases' and the remaining profiles are labeled as unmethylated 'controls'.

Second, logistic regression is used to optimize the weight with which the individual measurements contribute to the overall biomarker score, accounting for the fact that different CpGs vary in their predictiveness of the overall level of DNA methylation. Internally, MethMarker uses the WEKA package [37] to train a logistic regression model for each candidate biomarker, classifying the training samples into cases versus controls based on simulated methylation measurements for all contributing CpGs.

Third, the predictiveness of the logistic regression models is validated by leave-one-out cross-validation - that is, the logistic regression models are repeatedly trained on all but one training samples and their prediction performance is assessed on the remaining sample. The results of the optimization step, including a cross-validation-based estimate of the prediction performance on new data, are displayed in the biomarker summary window (Figure 4).

Step 5: validation of DNA methylation biomarkers

While the results of the leave-one-out cross-validation (step 4) already provide an important selection criterion for identifying the most suitable DNA methylation biomarkers, they do not account for potential errors and experimental problems that can occur during practical use. MethMarker therefore provides an additional validation step, which assesses the robustness of each candidate biomarker toward noisy data, sequencing errors and unknown single nucleotide polymorphisms. In this step, the optimal logistic regression model is re-applied to all samples for which high-resolution DNA methylation profiles are available (this can include samples that were not taken into account in the training phase - for example, because they constitute outliers or borderline cases), and the biomarker's prediction confidence for a given sample is plotted against its mean DNA methylation level, as calculated from the DNA methylation profiles. It is thus possible to visually assess how well each candidate biomarker separates between the (methylated) cases and (unmethylated) controls. Furthermore, MethMarker assesses the robustness toward erroneous data - such as sequencing errors or unknown single nucleotide polymorphisms - by randomly changing the DNA methylation measurement of a subset of CpGs. The error rate is varied over a wide range, and the impact on the prediction accuracy is visualized in the biomarker summary window (Figure 4), enabling the user to assess whether or not a specific candidate biomarker is sufficiently robust for clinical use.

Step 6: application of DNA methylation biomarkers

Based on the results of the computational assessment, the user selects a few of the most promising biomarkers for experimental validation, performs the necessary DNA methylation assays on DNA from the training samples and uploads the results into MethMarker. By comparison between the simulated and actual measurements, MethMarker can evaluate the reliability of each candidate biomarker under routine experimental conditions and re-train its logistic regression models accordingly (for example, down-weighting the contribution of a CpG whose DNA methylation assay exhibits a high level of experimental noise). This experimental validation step is important because it corrects for any deviations from the theoretically optimal measurement conditions that underlie the computational simulation of measurement values.

When the optimization and validation steps are completed and the user is satisfied with the overall performance, one or more candidate biomarkers are typically selected for further development. MethMarker provides two ways of facilitating the steps toward comprehensive clinical testing and widespread practical use. First, MethMarker can generate a comprehensive PDF report describing the key properties of a selected biomarker. This report includes the final sample classification formula as well as a summary of the accuracy and robustness assessment. Based on this file, it is straightforward to apply the biomarker assay to new data, requiring no statistical or bioinformatic tools beyond a pocket calculator. Second, a selected biomarker can be exported in a standardized data format, PMML, which is supported by several statistics packages and can be imported into diagnostics software. PMML has been developed by the Data Mining Group [23] to facilitate data exchange between developers and users of classification and regression models. All classifiers created with MethMarker fulfill the PMML 3.2 standard (see Additional data file 2 for illustration). Third, MethMarker supports multi-center biomarker validation studies. To that end, the PDF and PMML documentation files of the selected biomarker are distributed to all participating centers each center then performs the necessary DNA methylation assays for all local samples, loads the PMML file and the measurement values into MethMarker and obtains the biomarker result for each of their samples finally, the measurement values from all centers as well as the corresponding clinical data are combined, loaded into MethMarker and a global assessment of biomarker performance is obtained. If the performance is not satisfactory, the entire process can be reiterated and the biomarker re-optimized based on the data obtained in the previous round of validations.


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