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C5. Complejo I - NADH-quinona oxidorreductasa - Biología


Exploremos ahora el transporte de electrones con mayor detalle observando los mecanismos de dos complejos específicos, I y IV. Antes de eso, observe una vista detallada de la vía de entrada del transporte de electrones y la fosforilación oxidativa.

Figura: Vista detallada de la fosforilación oxidativa (reimpresa con permiso de Kanehisa Laboratories y el proyecto KEGG: www.kegg.org)

El número en recuadro representa el número de comisión de enzimas. Mapa original de KEGG con enlaces incrustados.

Complejo I - NADH-quinona oxidorreductasa

El complejo I se encuentra en la membrana mitocondrial interna de los eucariotas y en la membrana plasmática de las bacterias. El complejo de mamíferos 1 consta de 45 subunidades, 7 de las cuales están codificadas por el gen mitocondrial. Las bacterias tienen solo 13-14 subunidades. La importancia de las subunidades de mamíferos adicionales aún no está clara. A continuación se muestra un modelo de caricatura y la estructura cristalina real del complejo Thermus thermophilus (bacteriano). El dominio hidrófilo o periférico cataliza la transferencia de electrones, mientras que el dominio de la membrana (codificado por el ADN mitocondrial) participa en el transporte activo de protones.

Figura: Vista detallada del Complejo I de Thermus Thermophilus

Verano de 2017: los siguientes enlaces de Jmol contienen vistas múltiples de partes del complejo, así como de todo el complejo. Se repite varias veces a continuación.

Jmol: Complejo 1 Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Transporte de electrones

El flujo de electrones ocurre de NADH a UQ a ​​través de una serie de portadores de un electrón en el dominio hidrófilo o periférico del complejo 1. La transferencia inicial de electrones ocurre a un cofactor de flavina, FMN, y luego a través de una serie de grupos de Fe / S. En la figura de la izquierda a continuación, estos aceptores de electrones incluyen un grupo tetranuclear Fe / S (SF4 mostrado relleno espacial amarillo / rojo, un grupo binuclear Fe / S (FE2 / S2) mostrado en azul, un mononucleótido de flavina FMN mostrado en rojo y un MN El ion (II), mostrado en púrpura N1a y N1b son grupos binucleares y N2, N3, N4, N5 y N6 son grupos tetranucleares.

Figura: Flujo de electrones en el complejo I de T. Thermophilus

El grupo tetranuclear de Fe / S se basa en la estructura de cubano con Fe y S ocupando esquinas alternas de un cuadrado en una geometría tetraédrica. Cada Fe también está coordinado para tiolar aniones. La estructura real es un cubo distorsionado como se muestra a continuación, junto con el del grupo binuclear, cuyo ángulo de enlace también se desvía de los de un tetraedro.

Figura: Clústeres de Fe / S en el Complejo I

Muchos estados micro-redox posibles con diferentes potenciales de reducción estándar son posibles para las agrupaciones tetranucleares de Fe / S, tanto como un ácido poliprótico tiene múltiples valores de pKa. Los dos relevantes para el Complejo I y otros grupos tetranucleares se muestran a continuación:

una. FeIIFe3IIIS4 (CysS) 41- + e- ↔ Fe2IIFe2IIIS4 (CysS) 42- (potenciales de reducción estándar más bajos)

B. Fe2IIFe2IIIS4 (CysS) 42- + e- ↔ Fe3IIFeIIIS4 (CysS) 43- (potenciales de reducción estándar más altos)

Los electrones se pasan individualmente al UQ oxidado en pasos de un electrón para formar UQH2.

Los grupos de Fe-S se sintetizan predominantemente en las mitocondrias, donde sirven como cofactores redox en el transporte de electrones, como se describió anteriormente. Son ubicuos en todas las formas de vida y cumplen funciones además de los cofactores redox per se, ya que cumplen funciones estructurales en proteínas y se utilizan en la señalización redox dentro de la célula a medida que cambian los estados de oxidación. Muchas proteínas que interactúan con el ADN (enzimas reparadoras, polimerasas y helicasas) contienen un grupo de Fe-S.

La evidencia sugiere que colocaron papeles críticos en la evolución abiótica de la vida en ausencia de oxígeno como aceptor de electrones terminal en las reacciones de oxidación exergónica. Cuando la oxidación estuvo disponible, se volvieron potencialmente tóxicos para la célula, ya que el Fe2 + podría participar en reacciones (como la reacción de Fenton) que conducen a la generación de especies reactivas de oxígeno nocivas (como el superóxido). Para prevenir la toxicidad, cuando se administran al citoplasma y al núcleo, deben ser transportados y administrados por proteínas citoplasmáticas de ensamblaje hierro-azufre (CIA).

Jmol: Complejo 1 Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

El transporte de protones ocurre en el dominio de la membrana..

La evidencia disponible sugiere que 4 protones se mueven desde el citoplasma al espacio periplásmico contra un gradiente de concentración durante un ciclo catalítico del Complejo I en bacterias. Uno parece estar asociado con la reducción de UQ en el grupo N2 tetranuclear terminal de Fe / S. Los otros tres protones se mueven a través del dominio de la membrana.

Los residuos de Nqo4 (proximal al dominio de membrana como se ve en el diagrama KEGG) en la cadena D se han implicado en el flujo de H + al grupo de N2. Estos incluyen, a partir del grupo N2, H169, H170, D86, R350, D401, H129, R279, H89, R125, E122, R249, Y257, Y254, Y260, R296 (los residuos conservados están en negrita). El grupo de N2 terminal está coordinado por dos cadenas laterales de Cys en tándem (C45 y C46) que en su tiolato (forma desprotonada) se ligan al Fe en el grupo. ¿Qué propiedades tienen estos aminoácidos que los hacen candidatos para este flujo de H +?

A continuación se muestra un modelo de flujo de electrones y H + (según Berrisford y Sazanov, JBC, 284, 29773, 2009). Los grupos de hierro-azufre N2 y N6b se representan como O (para oxidado) o R (para reducido). C46 y C45 indican las cisteínas en tándem de la subunidad Nqo6 (más cercana al dominio de membrana). Q / QH2 indican quinona / quinol. Tyr 87 (Y-O) y Glu 49 (D-O) son aceptores de protones. La ruta H indica la ruta de suministro de protones desde el citosol hasta las cisteínas en tándem. Un protón de este ciclo parece transportarse a través de la membrana. ¿Qué sucede con los otros dos protones que se muestran en el diagrama?

Figura: Transferencia acoplada de protones y electrones en el centro de FeS en el Complejo I

El dominio de membrana transporta protones adicionales. Los dominios transmembrana NuoL, M, N, A / J / K y H se muestran a continuación. Los dominios L, M y N tienen estructuras similares a las proteínas involucradas en el movimiento acoplado de K + / H + en direcciones opuestas a través de una membrana (antiportador). Hay hélices discontinuas en cada subunidad. Los posibles residuos en la discontinuidad enterrados en las hélices de la membrana son Glu 144 y Lys 234. ¿Esperaría encontrarlos enterrados en la membrana? Si son parte de un canal sin abrir que está expuesto a un cambio conformacional concertado a través de 3 dominios de proteínas de membrana similares, ¿cómo participarían en la transferencia de protones?

Figura: Dominio transmembrana del complejo I de T. Thermophilus

Al mirar las tres subunidades antiportadoras L, M y N de la izquierda, observe una gran hélice que se extiende horizontalmente a través de todas ellas. ¿Cómo podría funcionar esa hélice para acoplar el movimiento de protones a través de todas las subunidades antiporter (L, M y N)? (Pista: piensa mecánicamente)

Jmol: Complejo 1 Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Inhibición del complejo I

El complejo I es inhibido por más de 60 familias diferentes de compuestos. Incluyen el clásico inhibidor del Complejo I rotenona y muchos otros insecticidas / acaricidas sintéticos. Las clases incluyen: Clase I / A (cuyo prototipo es Piericidina A), Clase II / B (cuyo prototipo es Rotenona) y Clase C (cuyo prototipo es Capsaicina). Parecen unirse en el mismo sitio. De la estructura de los 3 prototipos, ¿cuáles son las características del farmacóforo, el “ligando de unión ideal”? ¿Dónde se unen probablemente? ¿Qué tan "promiscuo" es el sitio de unión?

Figura: Inhibidores del complejo I

Muchas enfermedades neurológicas devastadoras están asociadas con defectos en el Complejo I. Además de los principales problemas con la producción de ATP oxidativo, aumentan las especies reactivas de oxígeno (ROS). Los sitios principales para la generación de ROS son el Complejo 1 y el Complejo III. Dadas las ubicaciones de los portadores de electrones en la periferia y en el interior del complejo proteico, ¿qué portadores de electrones podrían filtrar más fácilmente electrones al dioxígeno? ¿Qué ROS es probable que se forme en el proceso?

Los inhibidores pueden bloquear el acceso de UQ o cambios conformacionales necesarios para la reducción final del radical libre ubiqinona. Los inhibidores de clase A aumentan drásticamente la producción de ROS. El sitio real de producción de ROS en Complex es un poco controvertido. Un posible donante de electrones a dioxígeno es FMN. ¿Por qué es este un candidato probable? Los mutantes que carecen del grupo de hierro-azufre N2 mostraron producción de ROS. ¿Es esto consistente con la participación del sitio FMN en la producción de ROS?

En las preparaciones submitocondriales, se produce una actividad normal del Complejo I (que conduce a la formación de un gradiente de protones sostenido). También puede ocurrir el transporte inverso de electrones, impulsado por un gradiente de protones artificial, lo que conduce a la reducción de NAD + (ver diagrama a continuación).

Figura: Complejo de transporte de electrones normal e inverso I

A continuación se ofrece un resumen de los hallazgos sobre la producción de superóxido por el Complejo I:

  • La producción de superóxido es inhibidores del sitio de flavina pero no inhibidores del sitio Q.
  • El transporte inverso de electrones conduce a la reducción de NAD + y O2
  • Tanto la flavina como los inhibidores del sitio Q inhiben la producción de superóxido por transporte de electrones inverso

Con base en estos hallazgos, ¿qué sitio, el sitio de flavina o Q, está involucrado en la producción de superóxido?


Caracterización de la proteína de unión a ubiquinona de 9,5 kDa de NADH: ubiquinona oxidorreductasa (complejo I) de Neurospora crassa

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Introducción

NADH de tipo II: la quinona oxidorreductasa (NADH deshidrogenasa-2, NDH-2) es una deshidrogenasa unida a la membrana que oxida el NADH y reduce las quinonas y es una característica central de la cadena respiratoria en muchas especies diversas, pero no en los animales 1. A diferencia del NDH-1 (complejo respiratorio I, que cataliza la misma reacción en animales y muchas otras especies), la catálisis por NDH-2 no se usa para apoyar la fuerza motriz del protón que impulsa la síntesis de ATP, por lo que su catálisis es altamente exergónica y esencialmente irreversible. . El NDH-2 también es mucho más pequeño y de estructura más simple que el complejo I: comprende solo una subunidad única y un cofactor redox de flavina 1,2. En consecuencia, se ha explorado como una terapia génica para los trastornos del complejo I humano, para aliviar la acumulación de NADH y disminuir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) 3,4,5,6. En microorganismos patógenos notables, el NDH-2 es esencial para el crecimiento, incluso en algunos organismos que contienen tanto el complejo I como el NDH-2, como Tuberculosis micobacteriana 7. Junto con la presencia de NDH-1 en especies de mamíferos, esto ha convertido al NDH-2 en un objetivo farmacológico atractivo 8,9,10,11.

Se han caracterizado estructuralmente tres homólogos de NDH-2, desde Saccharomyces cerevisiae 12,13 , Caldalkalibacillus thermarum 14, y Staphylococcus aureus 15 . Todos ellos son homodímeros, y cada monómero contiene dos pliegues de Rossmann que forman sitios de unión de nucleótidos para un dinucleótido de flavina y adenina (FAD) unido no covalentemente y el sustrato NADH. Para el S. cerevisiae enzima (conocida como Ndi1), las dos publicaciones sobre la estructura describían sitios de unión de sustrato contradictorios. Iwata et al. generaron cocristales de Ndi1 con unión a NAD + o ubiquinona-2 (pero no a ambas) y encontraron que sus sitios de unión coincidían 12, lo que impedía la formación de un complejo ternario (en el que ambos sustratos están unidos entre sí). Alternativamente, Feng et al. aplicaron NADH y ubiquinona-4 a cristales de NDH-2 juntos y observaron densidades separadas para el nucleótido y la quinona, por lo que concluyeron que los sitios de unión son distintos, lo que permite la formación de un complejo ternario 13. De hecho, Feng et al. observaron dos sitios de unión a quinonas (uno en ambos NDH-2: ubiquinona-4 y NADH: NDH-2: cocristales de ubiquinona-4, el otro solo en ausencia de nucleótidos), pero el segundo sitio es probablemente un artefacto de la concentración alta (0,5 mM) de ubiquinona-4 utilizada.

El mecanismo catalítico de NDH-2 no está claro actualmente. Análisis cinético del S. cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Toxoplasma gondii y M. tuberculosis enzimas utilizando gráficos recíprocos de Hanes-Woolf, Lineweaver-Burk y Cook-Cleland 9,16,17,18,19,20 concluyeron que siguen un mecanismo de ping-pong en el que los sustratos se unen, reaccionan y disocian secuencialmente, ya sea en el mismo sitio de unión (un mecanismo de ping-pong de un sitio) o en sitios de unión discretos (un mecanismo de ping-pong de dos sitios). En un mecanismo de ping-pong, los dos sustratos nunca se unen (Fig. 1A). Alternativamente, otros han observado complejos de transferencia de carga (CTC, complejos en un estado intermedio entre NADH / flavina oxidada y NAD + / flavina reducida) 15,21 y sugirieron que la CTC es la especie oxidada por la quinona 15 en un paso en el que ambos sustratos se unen a la enzima al mismo tiempo. En un mecanismo de complejo ternario clásico, ambos sustratos se unen y ambos productos se liberan simultáneamente (figura 1B), mientras que en el NDH-2 la formación de una CTC estable sugiere que la oxidación del NADH ya se ha producido hasta cierto punto, antes de que reaccione la quinona. En consecuencia, el complejo ternario que se propone formar durante la catálisis de NDH-2 es atípico porque el complejo ternario tiene el carácter de un complejo sustrato-producto (Fig. 1C). Las estructuras de Feng et al. 13 demostraron que la formación de complejos ternarios es posible, pero no definen el mecanismo porque el complejo ternario observado puede no ser necesario, o incluso catalíticamente relevante.

Los sitios de unión para NADH / NAD + y Q / QH2 se muestran sombreados en rojo y azul, respectivamente. (A) Mecanismo de ping-pong en el que NADH y Q (quinona) reaccionan secuencialmente y nunca se unen a la enzima al mismo tiempo. (B) Mecanismo ternario clásico en el que ambos sustratos se unen para formar un complejo ternario, se produce la reacción y ambos productos se disocian. (C) Mecanismo ternario atípico que refleja mejor los mecanismos propuestos para NDH-2, en el que NADH se une y reacciona pero NAD + no se disocia, luego Q se une y reacciona en un complejo ternario con el complejo enzima-producto.

A continuación, presentamos un análisis exhaustivo del mecanismo catalítico de NDH-2 de C. thermarum utilizando métodos cinéticos, espectroscópicos y estructurales tanto en la enzima de tipo salvaje (WT) como en mutantes dirigidos al sitio en los que los sitios de unión al sustrato se han eliminado individualmente. Encontramos que las dos reacciones del sustrato son independientes entre sí, y que la ruta seguida está determinada por las relaciones entre las concentraciones de sustrato y producto y las constantes de disociación enzimática. Esta versatilidad mecanicista proporciona una explicación unificada para todos los datos existentes y, al caracterizar los estados específicos y los sitios de unión al sustrato necesarios para la catálisis, proporciona una base para el diseño y la evaluación futuros de los inhibidores candidatos.


RESULTADOS

Transfección de células deficientes en complejo I con el NDI1 Gene.

Para investigar si la levadura NDI1 gen puede expresarse funcionalmente en células de mamíferos, usamos células deficientes en I complejo. Scheffler et al. (Células de hámster chino) (18-21) y Attardi et al. (Células humanas) (32, 33) han informado de este tipo de células de mamíferos (32, 33). Intentamos transfectar la línea celular CCL16-B2 deficiente en complejo I de hámster chino con una longitud completa NDI1 gen (1539 pb) insertado en el vector pHook-2. Un experimento inicial con transfección transitoria fue solo parcialmente exitoso. Sin embargo, los resultados no fueron claros debido a una población mixta de células transfectadas y no transfectadas. Por lo tanto, el establecimiento de líneas celulares estables fue esencial para realizar ensayos de actividad enzimática confiables y también para nuestro objetivo final de las terapias génicas. Varios estables NDI1Se establecieron líneas celulares transfectadas a partir de colonias individuales después de la selección con el antibiótico G418. En la actualidad, todas las líneas celulares aisladas han exhibido las mismas propiedades que se describen a continuación.

los NDI1Las células CCL16-B2 transfectadas se examinaron mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal utilizando anticuerpo anti-Ndi1 y anticuerpo anti-mitocondrias humanas (Fig. 1). Está claro que el Ndi1 expresado se localiza predominantemente en las mitocondrias. Además, el anticuerpo anti-mitocondrias humanas se reconoció en la misma ubicación en las células que el anticuerpo contra la subunidad β de la ATP sintasa de corazón bovino (datos no mostrados). Para proporcionar evidencia adicional de la localización mitocondrial de la enzima Ndi1, realizamos análisis Western (inmunotransferencia) de fracciones mitocondriales crudas de no transfectadas y NDI1-células CCL16-B2 transfectadas, utilizando los anticuerpos purificados por afinidad para S. cerevisiae Ndi1 y la subunidad β de la ATP sintasa mitocondrial de corazón bovino (Fig. 2). Los anticuerpos de la subunidad β reaccionaron con una sola banda (METROr = 55.000) de fracciones mitocondriales brutas de ambas células CCL16-B2. El anticuerpo contra el S. cerevisiae Ndi1 reaccionó con una banda (METROr = 56.000) en la fracción mitocondrial del NDI1-células transfectadas, pero esta banda estaba ausente en las células no transfectadas. Estos resultados sugieren fuertemente que el S. cerevisiae NDI1 El gen fue transcrito y traducido en células CCL16-B2 de hámster chino. Además, el precursor Ndi1 se importa a las mitocondrias de mamíferos, muy probablemente por su secuencia líder.

Localización mitocondrial de la enzima Ndi1 expresada en células CCL16-B2 de hámster chino como se demuestra por microscopía de inmunofluorescencia confocal. NDI1-transfectado (A, B, y C) y no transfectados (D, mi, y F) Las células CCL16-B2 se marcaron doblemente con anticuerpo de conejo purificado por afinidad para S. cerevisiae Ndi1 y anticuerpo antimitocondrial humano. Los reactivos de detección secundarios fueron IgG de cabra anti-conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (A y D) y anti-IgG humana de cabra conjugada con rodamina (B y mi). (C y F) Imágenes superpuestas de A/B y D/mi, respectivamente.

Inmunotransferencias de fracciones mitocondriales de células CCL16-B2 de hámster chino mediante el uso de anticuerpos contra la proteína Ndi1 de S. cerevisiae (Derecha) y la subunidad β de la ATP sintasa bovina (Izquierda). En ambas transferencias, el carril 1 son células no transfectadas (100 μg) y el carril 2 es NDI1-células transfectadas (100 μg). Carril 3 (Izquierda) son mitocondrias bovinas (1,5 μg). Carril 3 (Derecha) es la proteína Ndi1 (33 ng) que contiene la secuencia líder, que se expresó y aisló de E. coli. Las fracciones mitocondriales brutas se prepararon como sigue. los NDI1-Las células transfectadas y no transfectadas (aproximadamente 2 x 108 células) se lavaron dos veces con PBS y se recogieron mediante tripsinización. El sedimento se suspendió en 2 ml de tampón de aislamiento que contenía manitol 210 mM / sacarosa 70 mM / EGTA 1 mM / Hepes 5 mM, pH 7,2 / fluoruro de fenilmetanosulfonilo 0,2 mM / BSA sin ácidos grasos al 0,5%. Las suspensiones celulares se trataron con 0,1 mg / ml de digitonina durante 1 minuto en hielo y se homogeneizaron en un homogeneizador Dounce con una mano de mortero apretada (70-100 golpes arriba / abajo). El homogeneizado se centrifugó a 3000 × gramo durante 5 min a 4 ° C para eliminar las células y los núcleos intactos. El sobrenadante se centrifugó a 10.000 × gramo durante 20 min a 4ºC. El sedimento se suspendió en 0,1 ml del tampón de aislamiento. Esta fracción se designa como la fracción mitocondrial bruta. La inmunotransferencia se realizó mediante el uso del sistema de quimioluminiscencia mejorado (Amersham).

Actividades de transferencia de electrones de las células transfectadas.

Para evaluar si la levadura NDI1 El gen puede ser útil para reparar defectos del complejo I en células de mamíferos, es necesario investigar si el Ndi1 expresado en estas células es funcionalmente activo. Por lo tanto, no transfectados y NDI1Se ensayaron las células CCL16-B2 transfectadas para determinar la actividad de la cadena respiratoria. La respiración se puede medir con células intactas (27). La digitonina, al unirse al colesterol en la membrana plasmática eucariota, crea poros a través de los cuales se pueden liberar los componentes solubles de la célula (34). Debido a que las membranas intracelulares tienen un contenido de colesterol sustancialmente más bajo que la membrana plasmática, las mitocondrias, otros orgánulos celulares y el citoesqueleto quedan intactos (27). Así, la permeabilización con digitonina permite un fácil acceso de los sustratos respiratorios e inhibidores (glutamato, succinato, etc.) a ensayar. Sin embargo, cabe señalar que en este sistema de ensayo el NADH añadido no entra en contacto con el complejo I porque el NADH / NAD del lado citoplásmico no puede penetrar en la matriz. Con malato o glutamato como sustrato permeable, la deshidrogenasa correspondiente genera NADH a partir de NAD en el compartimento de la matriz, que se oxida por el complejo I. Este procedimiento de ensayo es fiable y no se ve afectado por diversas diaforasas. Además, el número de células necesarias para este ensayo no es excesivo. Por tanto, este tipo de experimento se ha llevado a cabo utilizando no transfectados y NDI1-células CCL16-B2 transfectadas y células CCL16 parentales.

Como se muestra en la Fig. 3, las células mutantes CCL16-B2 permeabilizadas con digitonina no mostraron ningún consumo de oxígeno apreciable en presencia de malato / glutamato añadido. Rotenone no afectó la respiración. Cuando se añadió succinato, la respiración se estimuló notablemente. Esta estimulación fue completamente inhibida por antimicina A y KCN (datos no mostrados). Estos resultados son consistentes con los resultados previamente reportados usando mitocondrias aisladas de células CCL16-B2 (20). Por el contrario, la respiración en el permeabilizado por digitonina NDI1Las células CCL16-B2 transfectadas aumentaron significativamente con malato y glutamato, hasta un nivel comparable a las actividades de las células CCL16 parentales (datos no mostrados). Esta actividad era insensible a la rotenona pero sensible a la flavona, un inhibidor específico de la levadura Ndi1 (13), mientras que las actividades de las células CCL16 parentales son completamente inhibidas por la rotenona como se describió previamente (20). Además, la antimicina A y KCN también inhibieron completamente esta respiración. Estos resultados indicaron que el Ndi1 expresado en las mitocondrias de las células CCL16-B2 actúa como un miembro corriente arriba de su cadena respiratoria. Además, NADH no aumentó la respiración de los permeabilizados con digitonina. NDI1-Células CCL16-B2 transfectadas, lo que sugiere que el sitio de unión a NADH del Ndi1 expresado se enfrenta al compartimento de la matriz como en las mitocondrias de levadura. Por tanto, es probable que la secuencia señal de la levadura Ndi1 funcione correctamente en células de mamíferos. Sin embargo, esto no es sorprendente porque se ha informado que algunas secuencias señal de mamíferos funcionan en la importación de polipéptidos en la fase de la matriz mitocondrial de la levadura y viceversa (35, 36).

Recuperación de la actividad oxidasa NADH en las células CCL16-B2 transfectadas con el S. cerevisiae NDI1 gene. (Cima) Células CCL16-B2 no transfectadas (1 x 107 células). (Medio) NDI1-células CCL16-B2 transfectadas (1 x 107 células). (Fondo) NDI1-células CCL16-B2 transfectadas (3 x 107 células). Cuando se indique, se añadieron glutamato (Glu) 5 mM, malato (Mal) 5 mM, NADH 0,5 mM, rotenona (Rot) 5 mM, succinato (Succ) 5 mM, antimicina A (AntA) 5 mM y flavona 0,5 mM. Las células se recolectaron mediante tripsinización y se resuspendieron en 1 ml de un medio que contenía Hepes 20 mM, pH 7,1 / sacarosa 250 mM / MgCl 10 mM.2. Las células se trataron con 50-150 μg de digitonina hasta que más del 90% de las células se tiñeron con azul tripán. Las células tratadas con digitonina se lavaron con el mismo medio. El consumo de oxígeno se midió polarográficamente en 0,6 ml del tampón que contenía Hepes 20 mM, pH 7,1 / sacarosa 250 mM / MgCl 10 mM2 utilizando un electrodo Clark en una cámara con camisa de agua mantenida a 37 ° C.

Efecto de la glucosa / galactosa sobre el crecimiento celular.

Las células mutantes CCL16-B2 no pueden crecer si se omite la glucosa del medio, porque las células son totalmente dependientes de la glucólisis debido a la deficiencia del complejo I. Cuando se cultivan células CCL16-B2 deficientes en complejo I en presencia de galactosa en lugar de glucosa, estas células mueren y se desprenden de la placa de cultivo durante la noche, porque la galactosa no se puede utilizar eficazmente para la glucólisis. Las células madre CCL16 pueden satisfacer sus necesidades energéticas de la respiración y la fosforilación oxidativa. Si la deficiencia del complejo I se complementa con la levadura NADH deshidrogenasa, el fenotipo de las células CCL16-B2 debería volverse similar al de las células CCL16 originales y deberían poder utilizar la energía derivada de la fosforilación oxidativa para el crecimiento. La figura 4 muestra los efectos de limitar la fuente de carbono para la glucólisis pero no para la respiración sobre el crecimiento celular de NDI1-CCL16-B2 transfectado. En el medio de cultivo que contiene glucosa 5 mM (Fig.4A), NDI1Las células CCL16-B2 transfectadas pueden proliferar a velocidades similares a las de las células CCL16 originales, mientras que el número de células CCL16-B2 aumentó durante 1 día, pero luego disminuyó drásticamente debido a la muerte celular. Se ha demostrado que las células mutantes utilizan toda la glucosa disponible durante el primer día y luego se quedan sin energía (21). La galactosa también es un sustrato fermentable, pero la entrada en la glucólisis a través de la vía de Leloir es demasiado lenta para sostener las células mediante la glucólisis sola, y el ATP debe producirse mediante fosforilación oxidativa. Como se anticipó, el NDI1Las células transfectadas ahora pueden crecer a niveles bajos de glucosa (0,6 mM), así como las células CCL16 originales. Su crecimiento se estimula significativamente mediante la adición de galactosa 5 mM (Fig.4B). Esta estimulación por la galactosa se debe probablemente a que las células necesitan una hexosa como fuente de carbono para producir ribosa y desoxirribosa. Por el contrario, las células no transfectadas no podrían sobrevivir en ninguna de las condiciones (Fig.4B). Tomados en conjunto, es evidente que la Ndi1 expresada puede cambiar las propiedades fisiológicas de las células CCL16-B2 de la dependencia total de la glucólisis a la utilización de la respiración y la glucólisis. Además, las actividades respiratorias ligadas a NADH de las células CCL16-B2 parecen ser restauradas por la levadura. NDI1 expresión al nivel de las células CCL16 parentales.

Efectos de la glucosa (A) y galactosa (B) sobre el crecimiento celular de no transfectados y NDI1-CCL16-B2 transfectado y CCL16 parental. (A) Se inocularon células CCL16 parentales (105) (□), células CCL16-B2 no transfectadas (▵) y células CCL16-B2 transfectadas con NDI1 (○) en un medio de cultivo de glucosa 5 mM. (B) No transfectados (triángulos) y NDI1-Las células transfectadas (105) (círculos) se inocularon en un medio de cultivo de glucosa 0,6 mM en presencia (símbolos cerrados) y ausencia (símbolos abiertos) de galactosa 5 mM. En el caso de NDI1-cultivo de células CCL16-B2 transfectadas, también estaba presente 0,5 mg / ml de antibiótico G418. Las células se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO2 atmósfera. La viabilidad celular se evaluó mediante exclusión con azul tripán y el número de células se determinó cada 24 horas usando un hemocitómetro.


& ltp> Esta sección proporciona información útil sobre la proteína, principalmente conocimientos biológicos. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> Función i

NDH-1 transporta electrones desde NADH, a través de FMN y centros de hierro-azufre (Fe-S), a quinonas en la cadena respiratoria. El aceptor de electrones inmediato de la enzima en esta especie es la menaquinona. Acopla la reacción redox con la translocación de protones (por cada dos electrones transferidos, se translocan cuatro iones de hidrógeno a través de la membrana citoplasmática) y, por lo tanto, conserva la energía redox en un gradiente de protones requerido para la síntesis de ATP. La subunidad Nqo5 puede estar involucrada en la estabilización del complejo.

& # xd & ltp> Información seleccionada manualmente para la que hay evidencia experimental publicada. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / evidences # ECO: 0000269"> Más. & lt / a> & lt / p> & # xd Aserción manual basada en un experimento en i


NADH de tipo II: quinona oxidorreductasa de Staphylococcus aureus tiene dos sitios de unión distintos y la tasa está limitada por la reducción de quinonas

Un requisito previo para cualquier estrategia racional de diseño de fármacos es comprender el modo de interacción proteína-ligando. Esto nos motivó a explorar la interacción proteína-sustrato en NADH de tipo II: quinona oxidorreductasa (NDH-2) de Staphylococcus aureus, un problema mundial en la medicina clínica debido a sus múltiples formas farmacorresistentes. Los NDH-2 están implicados en las cadenas respiratorias y se reconocen como dianas adecuadas para nuevas terapias antimicrobianas, ya que son las únicas enzimas con actividad NADH: quinona oxidorreductasa expresada en muchos organismos patógenos.

Obtuvimos estructuras cristalinas y en solución de NDH-2 de S. aureus, mostrando que es un dímero en solución. Divulgamos análisis cinéticos rápidos de la proteína y detectamos un complejo de transferencia de carga formado entre NAD + y la flavina reducida, que es disociada por la quinona. Observamos que la reducción de quinonas es el paso limitante de la velocidad y también la única semirreacción afectada por la presencia de HQNO, un inhibidor. Analizamos las interacciones proteína-sustrato mediante espectroscopias de fluorescencia y STD-NMR, que indican que NADH y la quinona se unen a diferentes sitios.

En resumen, nuestros resultados combinados muestran la presencia de distintos sitios de unión para los dos sustratos, identificaron la reducción de quinonas como el paso limitante de la velocidad e indican el establecimiento de un complejo de proteína NAD +, que es liberado por la quinona.


Obituario

Andrei Vinogradov (1942-2021)

A través de elegantes experimentos en enzimas aisladas, mitocondrias intactas y bacterias, Andrei Vinogradov demostró cómo las enzimas de la cadena de transporte de electrones están finamente ajustadas y reguladas. Sus conocimientos fundamentales han allanado el camino para avances funcionales y estructurales innovadores en el campo.

Vinogradov, que nació en Samarcanda (ex URSS) en 1942, murió el 16 de marzo de 2021 en Moscú, Rusia, a la edad de 78 años. Se graduó en la Facultad de Biología de la Universidad Estatal de Moscú en 1964 y continuó sus estudios de posgrado en el campo de las enfermedades mitocondriales. metabolismo energético en Moscú. Fascinado por los descubrimientos emergentes en el área de la bioenergética, Andrei realizó su investigación postdoctoral en el laboratorio Britton Chance de la Universidad de Pensilvania. Al regresar a Rusia, instaló un laboratorio en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Moscú. A lo largo de muchos años, este laboratorio llevó a cabo un análisis sistemático de las propiedades enzimáticas de la succinato deshidrogenasa mitocondrial, la ATP-sintasa y el Complejo I.A Andrei le gustaba considerar que las reacciones directas e inversas de estas enzimas de la cadena respiratoria son proporcionadas por distintos mecanismos que son diferentes. regulado. Fue el primero en describir la transición activa / desactivada del complejo mitocondrial I y en enfatizar su importancia en fisiología. Si bien era un excelente violinista, también fue un presentador deslumbrante cuyas conferencias de bioquímica en la Universidad Estatal de Moscú fueron los eventos más memorables para muchas generaciones de estudiantes.

Andrei será muy extrañado por familiares, amigos, colegas y muchos científicos que lo apreciaron como un brillante facilitador de la ciencia. El mundo será mucho más pequeño sin él.

Sobre el complejo I
Por que la investigación sobre el complejo I es importante
Complejo de mamíferos I
NADH deshidrogenasas bacterianas


Una sola enzima externa confiere NADH alternativo: actividad ubiquinona oxidorreductasa en Yarrowia lipolytica

S.J. Kerscher, J.G. Okun, U. Brandt Una sola enzima externa confiere NADH alternativo: actividad de ubiquinona oxidorreductasa en Yarrowia lipolytica. J Cell Sci 15 de julio de 1999 112 (14): 2347–2354. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.112.14.2347

NADH: las ubiquinona oxidorreductasas catalizan el primer paso dentro de las diversas vías de oxidación mitocondrial del NADH. Además de la forma conservadora de energía comúnmente llamada complejo I, los hongos y las plantas contienen NADH alternativo mucho más simple: ubiquinona oxido-reductasas que catalizan la misma reacción pero no traslocan protones a través de la membrana mitocondrial interna. Se sabe poco sobre la distribución y función de estas enzimas. We have identified YLNDH2 as the only gene encoding an alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2) in the obligate aerobic yeast Yarrowia lipolytica. Cells carrying a deletion of YLNDH2 were fully viable full inhibition by piericidin A indicated that complex I activity was the sole NADH:ubiquinone oxidoreductase activity left in the deletion strains. Studies with intact mitochondria revealed that NDH2 in Y. lipolytica is oriented towards the external face of the mitochondrial inner membrane. This is in contrast to the situation seen in Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa and in green plants, where internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductases have been reported. Phylogenetic analysis of known NADH:ubiquinone oxidoreductases suggests that during evolution conversion of an ancestral external alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase to an internal enzyme may have paved the way for the loss of complex I in fermenting yeasts like S. cerevisiae.


Abstracto

Photosynthetic complex I enables cyclic electron flow around photosystem I, a regulatory mechanism for photosynthetic energy conversion. We report a 3.3-angstrom-resolution cryo–electron microscopy structure of photosynthetic complex I from the cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus. The model reveals structural adaptations that facilitate binding and electron transfer from the photosynthetic electron carrier ferredoxin. By mimicking cyclic electron flow with isolated components in vitro, we demonstrate that ferredoxin directly mediates electron transfer between photosystem I and complex I, instead of using intermediates such as NADPH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate). A large rate constant for association of ferredoxin to complex I indicates efficient recognition, with the protein subunit NdhS being the key component in this process.

Two light-driven electron transport pathways operate in all organisms that perform oxygenic photosynthesis: linear and cyclic electron flow. In linear electron flow (LEF), two photochemical reaction centers (photosystems I and II) act in series to drive the synthesis of adenosine triphosphate (ATP) and the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), whereas cyclic electron flow (CEF), powered by only photosystem I (PSI), leads solely to the formation of ATP. The contribution of each pathway varies in response to the environment (e.g., light quality), and organisms in which CEF is inactivated are functionally impaired (1).

Photosynthetic complex I of plant chloroplasts and cyanobacteria (2, 3) has been implicated in CEF, taking electrons from and indirectly reinjecting them into PSI. It is structurally and functionally related to respiratory complex I from mitochondria and bacteria (46), but it lacks the peripheral dehydrogenase module (N-module), comprising subunits NuoE, NuoF, and NuoG (see table S1 for nomenclature in different organisms). This module catalyzes NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide) oxidation and contains five out of eight iron-sulfur (Fe-S) clusters. Biochemical and proteomic analyses of photosynthetic complexes have discovered at least eight distinct subunits required to assemble fully functional photosynthetic complex I (713). There is evidence that ferredoxin (Fd) likely mediates electron transfer between photosynthetic complex I and PSI (14), probably within a large supercomplex (15), but this process has not been directly observed. Furthermore, the structural adaptions that enable the photosynthetic complex to perform its distinct role remain uncharacterized.

We purified photosynthetic complex I from the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus (fig. S1 and tables S2 and S3) and determined the structure by cryo–electron microscopy (cryo-EM) single-particle analysis to an overall resolution of 3.3 Å (Fig. 1 figs. S2 and S3 and table S4). We constructed models from homologous subunits or de novo where no model was available (fig. S4), except for NdhV, which binds transiently (7) and was not observed.

Eighteen subunits are colored and named accordingly (photosynthesis-specific subunits NdhL, NdhM, NdhN, NdhO, NdhP, NdhQ, and NdhS other nonmembrane subunits NdhH, NdhI, NdhJ, and NdhK and other membrane subunits NdhA, NdhB, NdhC, NdhD, NdhE, NdhF, and NdhG).

Photosynthetic complex I transfers electrons to the terminal acceptor plastoquinone. The quinone-binding site is coupled to the proton-pumping machinery in the membrane by a highly conserved charge-redistribution cascade (figs. S5 and S6), but the exact coupling mechanism remains elusive (1619).

The photosynthesis-specific single-spanning membrane proteins NdhQ and NdhP (8) bind to either side of the NdhD protein, with NdhQ fixing the very long horizontal helix of NdhF (fig. S7). NdhP forms a small hydrophobic cavity to which a molecule of β-carotene is bound. A lipid molecule (monogalactosyldiacylglycerol) binds between the NdhD and NdhF proton channels and appears to be stabilized by the β-carotene molecule. Both molecules probably serve as “molecular glue,” similar to lipids found in complex I of other species (18, 20), to help assemble the proton-pumping membrane arm of the complex and to stabilize the NdhF binding interface. A third photosynthesis-specific membrane subunit, NdhL, binds to the N terminus of NdhA to form an extended heel under the peripheral arm (fig. S5).

The N-module subunits responsible for NADH oxidation are not present in photosynthetic complex I. Instead, the peripheral arm of the cyanobacterial complex (Q-module) contains photosynthesis-specific subunits (NdhM, NdhN, NdhO, and NdhS) (figs. S8 and S9), which bind to the conserved, nonmembrane subunits of complex I (NdhH, NdhI, NdhJ, and NdhK). The latter four subunits harbor three [4Fe-4S] clusters in addition to the quinone-binding site and have elongated termini that are conserved within the green linage (figs. S10 to S12). NdhM and NdhN are located at one side of the peripheral arm and form multiple interactions with the conserved [4Fe-4S]-carrying complex I subunits by binding to their elongated termini and covering otherwise solvent-exposed hydrophobic patches. NdhO has a globular fold and packs tightly to the side of NdhJ via a hydrophobic binding interface, covering the same space that is occupied by the species-specific protein TTHA1528 in T. thermophilus respiratory complex I (21). Furthermore, the photosynthesis-specific NdhS subunit, previously implicated in Fd binding (22), is located in a V-shaped groove formed by the NdhI protein, at a similar location to subunit Nqo15 within the N-module.

Our cryo-EM structure resolves the positions and conserved coordination of three [4Fe-4S] clusters, corresponding to the previously identified clusters N6a, N6b, and N2 in respiratory complex I (Fig. 2A). Electron paramagnetic resonance (EPR) measurements on chemically reduced samples quantitatively identify all three clusters (components 1, 2, and 3 in Fig. 2B). Components 1 and 2 are similar to the respiratory complex I signals of N2 and N6b (23, 24), whereas component 3 bears little resemblance to N6a, in terms of width and structure (tables S6 and S13). The difference is due to either the proximity of N6a to N6b or the fact that N6a is surface exposed in photosynthetic complex I, as opposed to being buried in the protein, allowing it to act as the site of electron injection (see supplementary text).

(A) [4Fe-4S] clusters N6a, N6b, and N2 with coordinating subunits NdhI (dark salmon) and NdhK (ruby) compared with the corresponding T. thermophilus subunits Nqo9 and Nqo6 [gray, Protein Data Bank (PDB) 4HEA (21)]. (B) An EPR spectral simulation (red dashed line) of the spectrum at 10 K (black line), along with simulated spectra for the individual components (green, blue, and pink lines) and their associated gramo-valores. (C) Changes in flash-induced absorption at 580 nm (ΔA580 nm), attributed to Fd reduction by PSI (left) and complex I reduction by Fdrojo (right). These changes correspond to differences between signals 1, 2, and 3, recorded in three different cuvettes containing PSI, PSI-Fd, and PSI-Fd-complex I, respectively (see individual measurements in fig. S14). The left graph shows the difference between signals 2 and 1. The slow component after 0.2 ms was fitted by a single rising exponential function (black curve rate, 1379 s −1 ). The difference is due to oxidized Fd (Fdbuey) binding to PSI (which follows Fdrojo dissociation) with a second-order rate constant of 2.8 × 10 8 M −1 s −1 (see materials and methods). The downward arrow corresponds to the reduction of Fd by the PSI terminal acceptor. The right graph shows the difference between signals 3 and 2. To account for the lag preceding the signal rise due to complex I reduction by Fdrojo, the kinetics were fitted by a biexponential function with rates of 245 and 1280 s −1 (black curve). The upward arrow corresponds to the reduction of a [4Fe-4S] cluster in photosynthetic complex I by Fd. The PSI, Fd, and complex I concentrations were 0.08, 5.0, and 0.24 μM, respectively. (D) Superposition of photosynthetic complex I (green) with the T. thermophilus complex I [gray, PDB 4HEA (21)]. The N-module—which contains the NADH binding site, the flavin mononucleotide (FMN) cofactor, and the six Fe-S clusters N1a, N1b, N3, N4, N5, and N7 that transfer electrons from NADH (light blue arrows)—is missing from photosynthetic complex I. In vitro, electrons are transferred after light-induced charge separation from PSI [PDB 5ZF0 (31)] via Fd [PDB 5AUI (32)] toward the Q-module of photosynthetic complex I, as indicated by the red and dark blue arrows. The lightning bolt indicates application of a laser flash to excite PSI. PQ, plastoquinone.

To test the hypothesis that reduced Fd can inject electrons into photosynthetic complex I to enable CEF, we used absorption kinetics in the submillisecond time range. Electron transfer reactions were monitored in vitro with samples containing purified PSI, Fd, and photosynthetic complex I (Fig. 2, C and D). Single PSI turnover was triggered with a short laser flash (Fig. 2C), and subsequent electron transfer was monitored by ultraviolet-visible light absorption (see supplementary text). Submicrosecond PSI charge separation and stabilization (fig. S14) was followed by Fd reduction by the terminal [4Fe-4S] cluster of PSI, dissociation of reduced Fd (Fdrojo) from PSI, and reduction of a [4Fe-4S] cluster in photosynthetic complex I by Fdrojo (Fig. 2C). The kinetics of the latter reaction were fitted to a biexponential function with rates of 245 and 1280 s −1 (Fig. 2C). With the conservative assumption that the slowest component (245 s −1 ) corresponds to the association of Fdrojo to the photosynthetic complex I, we calculated a lower limit of k2FdComplexI = 1.0 × 10 9 M −1 s −1 for binding. This association constant is clearly larger than values previously measured for other Fd partner proteins (2527). We conclude that Fd participates in CEF via photosynthetic complex I and that Fd recruitment to complex I is very efficient.

The above analyses converge upon the hypothesis that the surface of the peripheral arm near the N6a cluster of photosynthetic complex I is responsible for Fd binding (Fig. 3A). We identified a putative Fd binding site in this region, guided by the surface charge at a tripartite interface formed by NdhK, NdhI, and NdhS (Fig. 3B). This surface area faces toward the missing [4Fe-4S] cluster N5 of the N-module of respiratory complex I (Fig. 2D).

(A) Top view of the complex I surface with colored subunits. The potential Fd binding area is indicated by the yellow dashed circle. (B) Electrostatic potential surfaces on complex I (red for negative, white for neutral, and blue for positive) were calculated with the Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS) plug-in in PyMOL. (C) The C-terminal segment of NdhS (green ribbon structure) that was not resolved in the x-ray and cryo-EM structures is drawn as a dotted line in an arbitrary position. K, Lys. (D) Weighted 1 H/ 15 N chemical shift perturbations observed in [ 15 N]-NdhS upon binding to nonlabeled Fd. ppm, parts per million.

Recent functional studies suggested that the photosynthesis-specific subunit NdhS plays an important role in CEF of Arabidopsis thaliana (22, 28) y Synechocystis sp. PCC 6803 (13). However, because NdhS has no prosthetic group such as an Fe-S cluster or flavin, it is still elusive how it is involved in electron transfer of photosynthetic complex I. We confirmed that unbound NdhS adopts the same overall structure as in the full complex I by solving the x-ray crystal structure of recombinant NdhS at 1.90-Å resolution (table S5 and figs. S15 and S16). To assess the sites and mode of interaction between Fd and NdhS, we performed nuclear magnetic resonance (NMR) chemical shift perturbation experiments using 15 N-labeled Fd or NdhS with the nonlabeled counterpart, and vice versa (Fig. 3D and figs. S16 to S18). The NMR chemical shift perturbation indicated that the interaction site on NdhS was primarily located in its C-terminal region, from Glu 104 (E104) to the C terminus, a domain that was not resolved in either the x-ray or cryo-EM structure owing to its high flexibility (Fig. 3, C and D). A similar “fly-casting” mechanism leads to fast electron transfer between Fd and ferredoxin:NADP + reductase (25, 29), and it might be also responsible for the fast association between Fd and photosynthetic complex I. The C-terminal segment of NdhS contains five positively charged Lys residues, which likely “catch” the negatively charged patch of Fd through an electrostatic interaction. We propose that NdhS serves as a foothold for Fd binding by tuning the binding angle of Fd toward NdhI, the catalytic subunit with a redox center next to NdhS (Fig. 3C and fig. S19), as is the case for the variable subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase and for the PsaE subunit of PSI.

Our structure of photosynthetic complex I suggests that adaptation of modular domains and interfaces contributes to functional differences between it and homologous complexes. The minimal functional unit of the Q-module for Fd-dependent electron transfer is shared with membrane-bound hydrogenase from Archaea (30), thus suggesting that they also share the minimal required interaction site for Fd binding. In respiratory complex I, the N-module is attached to the Q-module to enable NADH oxidation (21), whereas in photosynthetic complex I, extensions and accessory subunits (including NdhS) facilitate highly efficient electron transfer from Fd. The photosynthesis-specific structural elements may also mediate supercomplex formation with PSI, which is proposed to further optimize CEF in cyanobacteria and plants (15).


Phylogenomic analysis of type 1 NADH:Quinone oxidoreductase

We performed phylogenomic analysis of the catalytic core of NADH:quinone oxidoreductases of type 1 (NDH-1). Analysis of phylogenetic trees, as constructed for the core subunits of NDH-1, revealed fundamental differences in their topologies. In the case of four putatively homologous ion-carrying membrane subunits, the trees for the NuoH and NuoN subunits contained separate archaeal clades, whereas subunits NuoL and NuoM were characterized by multiple archaeal clades spread among bacterial branches. Large, separate clades, which united sequences belonging to different archaeal subdomains, were also found for cytoplasmic subunits NuoD and NuoB, homologous to the large and small subunits of nickel-iron hydrogenases. A smaller such clade was also shown for subunit NuoC. Based on these data, we suggest that the ancestral NDH-1 complex could be present already at the stage of the Last Universal Cellular Ancestor (LUCA). Ancestral forms of membrane subunits NuoN and NuoH and cytoplasmic subunits NuoD, NuoB, and, perhaps NuoC, may have formed a membrane complex that operated as an ion-translocating membrane hydrogenase. After the complex attained the ability to reduce membrane quinones, gene duplications could yield the subunits NuoL and NuoM, which enabled translocation of additional ions.


Ver el vídeo: Estructura y función de la mitocondria (Diciembre 2021).