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¿Qué sucede cuando reiniciamos una reacción de PCR?


Recientemente, cuando mi reacción de PCR se estaba ejecutando, hubo una fluctuación de energía y todo el laboratorio se apagó durante unos minutos y, desafortunadamente, la PCR que estaba ejecutando se apagó. Entonces, ¿estaría bien reiniciar el PCR? ¿Qué pasaría si se volviera a ejecutar el mismo programa de PCR?


La polimerasa utilizada en la PCR es extremadamente estable a temperatura ambiente. Espero que pueda continuar su reacción de PCR desde el ciclo en el que se detuvo sin demasiados problemas. Sin embargo, es importante no hacer un ciclo excesivo de su producto. Esto producirá productos no específicos. Si es imperativo obtener un resultado limpio, tome una muestra de 1 a 5 ul de su reacción original para usarla como plantilla en una nueva reacción.


En este caso, puede ejecutar su PCR durante otros 18 ciclos (si su número total de ciclos fue 30). Sin embargo, realice la desnaturalización inicial durante 1-2 minutos. Puede ejecutar el mismo programa nuevamente (30 ciclos completos) pero terminará perdiendo tiempo porque después de un momento todos los dNTP y cebadores se agotarán y los ciclos posteriores no tendrán ningún efecto en la concentración del amplicón.


Pregúntele a un experto: Una pregunta estúpida sobre PCR.

Entiendo cómo funciona la PCR. El ADN se desnaturaliza y se convierte en dos ADNss. El cebador directo se adhiere a una hebra y el cebador inverso se adhiere a otra.

Mi pregunta es ¿cómo sabe la cartilla cuándo dejar de sintetizar?

Por ejemplo, digamos que nuestra secuencia de ADN de doble hebra es la siguiente:

5 'GTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAG3'
3 'CAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTC5'

Entonces, la cartilla directa diría esto: 5'GTTTTTTT3 '
El cebador inverso es: 5'GAAAAAA3 '

Ahora, cuando el dsDNA se desnaturalice y se convierta en dos ssDNA, los cebadores se unirán. Sin embargo, ¿no seguiría sintetizándose la cartilla para siempre? Además de la expiración del tiempo de recocido, ¿cómo sabe la imprimación cuándo detenerse?

Al principio, mi respuesta a esta pregunta fue el uso de codones de terminación. pero los codones se utilizan realmente durante la traducción y no son importantes en la PCR real?

Post por Genotipo & raquo Vie 25 de noviembre de 2005 1:07 a. m.

Lo siento, solo quería agregar algo a la publicación original.

Mi pregunta se refiere a qué sucede si tiene cebadores que se supone que son específicos para un gen dentro de la plantilla de ADN.

Sé que si el objetivo fuera simplemente amplificar la mayor parte de la plantilla de ADN original, entonces el cebador continuaría sintetizándose hasta que llegara al final del ADN. Sin embargo, si intentamos realizar una PCR de un gen específico dentro de una plantilla de ADN enorme, ¿cómo sabe el cebador cuándo detenerse?

Respuesta a preguntas sobre PCR

Post por donnahardy2 & raquo Lun 28 de noviembre de 2005 2:30 pm

La polimerasa no sabe cuándo detenerse. Puede sintetizar cientos o miles de bases adicionales antes de que: 1) la polimerasa caiga de forma natural, lo que sucede con frecuencia, lo que dificulta la síntesis de piezas muy largas de ADN mediante PCR o 2) el tiempo del ciclo en el termociclador termina y la temperatura sube hasta más de 90 grados y el calor adicional hace que la polimerasa se caiga.

Eso no importa. La síntesis de ADN extralarga solo ocurrirá con la plantilla de ADN original que recorre un largo camino en ambas direcciones. Pronto habrá muchas más piezas de ADN que se sintetizaron comenzando con un cebador, por lo que tiene un punto de parada definido (el ADN termina) cuando la síntesis comienza con el otro cebador y va en sentido contrario. Cuando eso suceda, el ADN tendrá un punto de parada definido en ambos extremos y todo el ADN nuevo que se haga tendrá una longitud fija. Una imagen lo muestra mejor. He puesto algunas regiones de imprimación (cortas).

SITUACIÓN INICIAL (después de desnaturalizar el ADN)

PRÓXIMA RONDA DE AMPLIFICACIÓN

OTRAS RONDAS DE AMPLIFICACIÓN

Por lo tanto, al final, casi todos los productos de PCR serán de corta duración. Habrá algunas piezas más largas (una en cada dirección para cada uno de los aproximadamente 40 ciclos de amplificación) pero será una cantidad tan pequeña en comparación con los miles de millones y miles de millones de piezas cortas que no podrá notarlas.


¿Qué sucede cuando reiniciamos una reacción de PCR? - biología

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Si eso no ayuda, háganoslo saber.

El objetivo de la PCR, reacción en cadena de la polimerasa, es amplificar una secuencia genética. En este ejemplo, se amplificará un gen de interés a partir de ADN purificado. Para realizar la amplificación, se requiere una polimerasa para sintetizar el nuevo ADN.

También se necesita un cebador, un fragmento corto de ADN monocatenario que comparte homología con el gen de interés. Finalmente, se utilizan nucleótidos simples llamados desoxinucleósidos trifosfatos o dNTP para fabricar la nueva hebra. El primer paso en la PCR es calentar la mezcla que desnaturaliza el ADN.

A continuación, la reacción se enfría y los cebadores se aparearán con su región homóloga. Una vez unida, la reacción se calienta a una temperatura óptima para la polimerasa. La polimerasa luego reconoce el complejo de ADN del cebador y comienza la síntesis de la nueva hebra utilizando los dNTP en la solución.

A continuación, la reacción se calienta y prosigue como se describe a lo largo de ciclos adicionales. Después del tercer ciclo, hay ocho copias totales del gen. Después del cuarto ciclo, 16 copias.

Y quinto ciclo, 32 copias. El número de ciclos seguirá creciendo exponencialmente. Después de 30 ciclos, hay poco más de mil millones de copias.

15.14: PCR

Visión general

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica ampliamente utilizada para copiar segmentos de ADN. Debido a la amplificación exponencial, la PCR puede producir millones o miles de millones de copias de ADN en unas pocas horas. En una reacción de PCR, una enzima polimerasa de ADN resistente al calor amplifica el ADN original a través de una serie de cambios de temperatura dentro de una máquina automatizada llamada termociclador.

La PCR es un método versátil que revolucionó la biología molecular

Kary Mullis desarrolló la PCR en 1983, por lo que fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1993. Al ser una forma relativamente rápida, económica y precisa de copiar una secuencia de ADN, la PCR se convirtió en una herramienta invaluable para numerosas aplicaciones, incluida la clonación molecular, mutagénesis genética, detección de patógenos, análisis de expresión genética, cuantificación y secuenciación de ADN y diagnóstico de enfermedades genéticas.

El ciclo de reacción de la PCR

La PCR imita el proceso natural de replicación del ADN que ocurre en las células. La mezcla de reacción incluye una secuencia de ADN molde que se copiará, un par de moléculas de ADN cortas llamadas cebadores, bloques de construcción de ADN libres llamados desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) y una enzima polimerasa de ADN especializada.

La PCR implica una serie de pasos a altas temperaturas, que requieren una enzima ADN polimerasa que sea funcional a tales temperaturas. La ADN polimerasa más utilizada es Taq polimerasa, que lleva el nombre de Thermus aquaticus, la bacteria de la que se aisló inicialmente la polimerasa. La ADN polimerasa es incapaz de sintetizar una molécula de ADN desde cero o de novo. En cambio, la ADN polimerasa se agrega a las moléculas de ADN cortas, llamadas cebadores, que se unen a la plantilla de ADN a través del emparejamiento de bases complementarias. Los cebadores proporcionan un grupo hidroxilo 3 & rsquo libre al que la ADN polimerasa puede unir nuevos dNTP. Hay cuatro tipos de dNTP en una PCR, uno para cada nucleótido de la molécula de ADN: dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

Cada ciclo de PCR consta de tres pasos: desnaturalización, recocido y síntesis de ADN.

  1. Desnaturalización. El ciclo de PCR se inicia calentando la mezcla de reacción a una temperatura alta, lo que provoca la separación de la doble hélice de ADN en dos hebras. Este proceso de & ldquomelting & rdquo ocurre generalmente a una temperatura de 90 & degC & tímido & tímido & ndash100 & degC.
  2. Recocido. La mezcla de reacción se enfría rápidamente (normalmente a 50 ° C y ndash65 ° C), permitiendo que los dos cebadores se unan a sus secuencias complementarias en las hebras de ADN molde.
  3. Síntesis de ADN (extensión del cebador). La mezcla de reacción se calienta nuevamente, esta vez a una temperatura (generalmente 60 ° C y ndash75 ° C) que permite que la ADN polimerasa extienda los cebadores agregando dNTP que se emparejan con las bases en la hebra molde.

Una PCR típica implica de 20 a 40 ciclos repetidos de estos tres pasos, que se producen en el termociclador. Dado que el número de moléculas de ADN se duplica en cada ciclo, el ADN se amplifica exponencialmente.

Limitaciones de la PCR

Si el científico quiere amplificar un tramo específico del genoma, el científico debe conocer al menos parte de la secuencia de ADN objetivo para diseñar cebadores apropiados. Otro problema potencial es el apareamiento inespecífico de cebadores con secuencias de ADN parcialmente similares, lo que conduce a la amplificación del ADN no objetivo. Este problema se puede controlar optimizando las condiciones de reacción. Al ser un método de detección altamente sensible, la PCR también es vulnerable a la contaminación, e incluso pequeñas cantidades de ADN contaminante pueden provocar resultados engañosos. Las ADN polimerasas utilizadas en la PCR pueden ser propensas a errores. Si ocurre una mutación dentro de los primeros ciclos, la mayor parte del ADN amplificado llevará la mutación.

Garibyan, Lilit y Nidhi Avashia. & ldquoTécnicas de investigación simplificadas: reacción en cadena de la polimerasa (PCR). & rdquo The Journal of Investigative Dermatology 133, no. 3 (marzo de 2013): e6. [Fuente]

Ore, Leslie A. & ldquoLa revolución de la biotecnología: PCR y el uso de la transcriptasa inversa para clonar genes expresados. & Rdquo Educación de la naturaleza 1, no. 1 (2008): 94. [Fuente]


¿Cuáles son las ventajas de la PCR sobre la clonación de genes para generar muchas copias de un fragmento de ADN?

ADN clonación implica aislar un fragmento específico de ADN y, por lo general, insertar ese fragmento en un plásmido para que una bacteria pueda replicar el ADN. PCR utiliza dos cebadores específicos para replicar y aislar una secuencia de ADN específica. Que es diferencia entre la clonación de genes y recombinación de ADN?

Además, ¿qué pasaría si utilizara una polimerasa humana en una serie de reacciones de PCR? ¡Lee esto! La tasa de una enzima catalizada la reacción puede También se verá afectado por la presencia de otras moléculas que pueden unirse a la enzima, cambiando su forma. En algunos reacciones es necesaria una coenzima.

También la pregunta es, ¿por qué necesita clonar los fragmentos de PCR para una posterior secuenciación?

Después secuenciación de clonación es necesario porque para confirmar que lo que sea secuencia que clonamos (que da expresión) si eso secuencia está presente en secuenciación datos entonces nosotros puedo decir que nuestro clonación los resultados son verdaderos.

¿Cómo se usa la PCR en la clonación de ADN?

Clonación por PCR Método. Permite el clonación de ADN fragmentos que no están disponibles en grandes cantidades. Normalmente, un PCR La reacción se lleva a cabo para amplificar la secuencia de interés, y luego se une al vector mediante una ligación de voladizo romo o de una sola base antes de la transformación.


PCR: ¿Puede obtener amplificación si solo se hibrida un cebador? - Producto de pcr del mismo tamaño con 2 juegos de imprimaciones diferentes (25 / Jul / 2007)

Hola a todos,
Me encantaría conocer su opinión sobre la siguiente situación:

He diseñado dos conjuntos de cebadores diferentes para amplificar el mismo gen. Ambos cebadores de sentido están en el exón 1 pero se aparean con diferentes partes del exón. Están uno al lado del otro, pero no se superponen. Un cebador antisentido está en el extremo 5 & # 39 del exón 6 y el otro está en el exón 7. El producto para el conjunto de cebadores del exón 1-6 es 671 pb y para el exón 1-7 es de 3,4 kb (el exón 6 es bastante grande). Cuando hago el pcr usando cada uno de los conjuntos de cebadores y el mismo ADNc, obtengo un amplicón que es del mismo tamaño para ambos conjuntos de cebadores. ¿Es posible que solo mi cebador sensorial esté recocido y la amplificación solo esté sucediendo en la dirección de avance y tenga algún producto alternativo? Se apreciaría cualquier sugerencia sobre esto.
Gracias

No estoy seguro de entender su pregunta exactamente, pero si solo un cebador está recocido (hacia adelante o hacia atrás), no obtendrá amplificación. La cantidad máxima de producto sería ADN monocatenario a la misma concentración que la plantilla.
Senté

Hola a todos,
Me encantaría conocer su opinión sobre la siguiente situación:

He diseñado dos conjuntos de cebadores diferentes para amplificar el mismo gen. Ambos cebadores de sentido están en el exón 1 pero se aparean con diferentes partes del exón. Están uno al lado del otro, pero no se superponen. Un cebador antisentido está en el extremo 5 & # 39 del exón 6 y el otro está en el exón 7. El producto para el conjunto de cebadores del exón 1-6 es de 671 pb y para el exón 1-7 es de 3,4 kb (el exón 6 es bastante grande). Cuando hago el pcr usando cada uno de los conjuntos de cebadores y el mismo ADNc, obtengo un amplicón que es del mismo tamaño para ambos conjuntos de cebadores. ¿Es posible que solo mi cebador sensorial se esté recociendo y la amplificación solo esté sucediendo en la dirección de avance y tenga algún producto alternativo? Se apreciaría cualquier sugerencia sobre esto.
Gracias

Me pregunto si obtengo solo un producto ssDNA. Sé que hay técnicas como la pcr asimétrica que dan como resultado que solo una de las cadenas se amplifique, así que pensé que eso podría estar sucediendo con mi reacción sin darme cuenta. Si no tengo un ADNc de longitud completa, entonces mi cebador inverso no se puede templar, por lo que amplifico solo con el cebador directo. Realmente no estoy lo suficientemente familiarizado con la técnica para saber si esto es posible. Solo estoy tratando de encontrar una explicación para obtener el mismo tamaño de producto con 2 juegos de imprimaciones diferentes.

es cierto, puede amplificar con un solo cebador, pero esta será una reacción lineal y el tamaño del producto depende de la velocidad de la polimerasa. Dudo que veas bandas en absoluto, ya que no obtienes una amplificación exponencial e, incluso si ves una banda, no sería claro.

Yo optaría por una encuadernación inespecífica. ¿Revisaste tus cebadores?

Son específicos para mi gen y también he secuenciado uno de los productos y es el producto correcto. Es todo un enigma. Nunca he podido amplificar el ADNc de longitud completa y, como es un babuino, no conozco la secuencia. Algunas partes son muy homólogas a las de los humanos, pero hay suficientes diferencias en el empalme alternativo que necesito conocer la secuencia específica del babuino.

es cierto, puede amplificar con un solo cebador, pero esta será una reacción lineal y el tamaño del producto depende de la velocidad de la polimerasa. Dudo que veas bandas en absoluto, ya que no obtienes una amplificación exponencial e, incluso si ves una banda, no sería claro.

Yo optaría por una encuadernación inespecífica. ¿Revisaste tus cebadores?

¿Podría secuenciar los productos para ambos juegos de imprimaciones?
Tal vez tengan la misma longitud por casualidad, pero representan diferentes transcripciones debido al empalme alternativo (por ejemplo, omisión de exones internos).
También puede probar su hipótesis configurando un pcr con solo su sentido o uno de sus cebadores antisentido. En el primer caso, debería obtener un producto de pcr de tamaño y cantidades similares a los anteriores. Configurar la reacción solo con sus cebadores antisentido no debería conducir a ningún producto si está en lo cierto.

¿Quizás uno de sus cebadores se une en ambas direcciones?
¿Ha destruido sus secuencias de cebadores y comprobado si son específicas para su gen de interés?

Intente secuenciar completamente su producto. Si se clona, ​​debería poder ver qué sucede en los extremos donde están los cebadores.

EXPLORA tus imprimaciones, pero no siempre confíes en ellas. A veces, BLAST no muestra ninguna coincidencia, pero de alguna manera los cebadores se aparean con regiones inespecíficas.

Puede purificar en gel su fragmento y (si hay sitios de restricción) intentar cortarlo con una enzima de corte poco común antes de secuenciarlo. O simplemente secuencialo si es más fácil.


ELI5: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para & # x27amplificar & # x27, o hacer mucho más ADN. Esto puede ser realmente útil en situaciones forenses, donde puede tener una cantidad muy pequeña de ADN para trabajar. Si puede hacer mucho más, puede hacer más pruebas y obtener un mejor resultado.

Es un ciclo de calentamiento y enfriamiento, que utiliza los mismos métodos de replicación del ADN que tiene una célula normal.

Digamos que, para empezar, tiene una longitud de ADN bicatenario (dsDNA). El primer ciclo calienta el sistema a 95 grados; esto es lo suficientemente caliente como para hacer que las hebras de ADN se dividan en 2 hebras individuales (ssDNA). La siguiente fase del ciclo enfría el sistema a 55 grados, lo que permite que las moléculas llamadas & # x27primers & # x27, que inician la replicación del ADN, se adhieran a las hebras simples. La siguiente fase se calienta a 80 grados, que es la mejor temperatura a la que trabaja la enzima polimerasa Taq. Esta enzima es responsable de agregar pares de bases (llamados nucleótidos, que están en la solución antes de que se agreguen a la máquina de PCR) a las bases vacías. Esta etapa se mantiene hasta que el ADN se haya alargado completamente a su tamaño original.

Entonces, al final de un ciclo completo de PCR, ahora tiene dos hebras de dsDNA. Si repetimos este ciclo nuevamente, sucede lo mismo, pero tanto con la nueva hebra como con la antigua hebra de ADN. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN que tiene y, por lo general, la PCR se ejecuta en aproximadamente 35 ciclos.

1, 2, 4, 8, 16, 32, etc., puede ver que será un número enorme al final de los 35 ciclos, suficiente para realizar otras pruebas para obtener un resultado bien visualizado.


¿Cómo se configura una reacción de PCR?

Los componentes básicos de un Reacción de PCR incluyen una plantilla de ADN, cebadores, nucleótidos, ADN polimerasa y un tampón. La plantilla de ADN suele ser su muestra de ADN, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. El diseño de la imprimación es fundamental para un éxito Reacción de PCR.

Asimismo, ¿por qué se necesita una plantilla de ADN para la PCR? Igual que ADN replicación en un organismo, PCR requiere un ADN enzima polimerasa que produce nuevas hebras de ADN, utilizando hebras existentes como plantillas. Esta estabilidad térmica hace que la polimerasa Taq sea ideal para PCR. Como veremos, la alta temperatura se usa repetidamente en PCR para desnaturalizar el plantilla de ADN, o separar sus hebras.

Además, ¿cuáles son los 4 pasos de la PCR?

  • Paso 1: Desnaturalización por calor: el calor es normalmente de más de 90 grados Celsius y separa el ADN de doble hebra en dos hebras simples.
  • Paso 2: Imprimación de recocido a la secuencia objetivo:
  • Paso 3: Extensión:
  • Paso 4: Fin del primer ciclo de PGR:

¿Cuáles son los 3 pasos de la PCR?

La PCR se basa en tres pasos simples necesarios para cualquier reacción de síntesis de ADN: (1) desnaturalización de la plantilla en hebras simples (2) recocido de cebadores a cada hebra original para la síntesis de nuevas hebras y (3) extensión de las nuevas hebras de ADN de los cebadores.


Módulo 1: Replicación del ADN

Hola a todos y bienvenidos. Hoy hablaremos de una reacción en cadena de la polimerasa en PCR corta. Entonces esta es la técnica que nos permitirá hacer más copias de ADN. En otras palabras, esta es una técnica de amplificación de ADN. Entonces, hemos visto cómo ocurre la replicación del ADN dentro de las células en las células eucariotas. Que involucra tantas enzimas. Y son las reacciones escalonadas bastante complicadas, muchas enzimas están involucradas. Junto con eso, también se necesitan algunos ingredientes. Entonces, una reacción en cadena de la polimerasa es un método que nos permitirá hacer la amplificación del ADN en el laboratorio in vitro. Entonces, cuando algo sucede dentro de los organismos vivos, las células vivas, lo llamamos in vivo. Fuera de las células vivas, por ejemplo, en el laboratorio que está haciendo se llama in vitro. Entonces, veremos hoy cómo puede hacer la amplificación de ADN, cómo puede hacer más copias de ADN en su laboratorio. Y esto es algo absolutamente esencial porque la cantidad de ADN que puede aislar de diferentes fuentes durante sus estudios, por ejemplo, células enfermas, por ejemplo, microorganismos, ha aislado ADN de los microorganismos de células enfermas y otras fuentes, glóbulos y así sucesivamente, y desea estudiar las diversas propiedades de esos genes, entonces lo crucial es que la cantidad que aísle sea realmente muy pequeña. Y con eso, no puede hacer sus pasos de laboratorio, no puede hacer muchos experimentos con ellos. Entonces, es absolutamente esencial que necesitemos más cantidad de esos genes o más cantidad de ese ADN. Digamos que alguien que ha visto, recolectamos a las personas, o los científicos o incluso para los equipos forenses, ellos recolectan muestras de cabello o muestras de sangre o muestras de piel de personas fallecidas, si hay muchas víctimas, muchos percances ocurren y hay muchas bajas que no se identifican esas personas. Entonces, muchas veces lo que la gente hace hoy en día el equipo forense es que recolectan hasta las muestras de cabello y luego aíslan el ADN y luego averiguan la identidad de la persona. Entonces, puedes imaginar que la cantidad de ADN que puedes aislar de una muestra de cabello es tan pequeña, tan pequeña que con eso no puedes realizar las investigaciones adecuadas en el laboratorio. Entonces, realmente necesitas una mayor cantidad de material, más cantidad de ADN para llevar a cabo tus necesidades para llevar a cabo tu experimento en el laboratorio. Por eso es absolutamente imprescindible incrementar la cantidad de ADN y esta es la técnica que te permitirá producir más cantidades del gen o del ADN que hayas aislado. Esa es la belleza de este método y de ahí la importancia de este método. Entonces, hasta la técnica de PCR, la bioquímica o las técnicas bioquímicas, incluso algunas herramientas de química estaban atascadas. Entonces, después de la invención de la PCR, ha dado un gran impulso a los bioquímicos, a los biotecnólogos e incluso al químico, lo que realmente ha aumentado el nivel de la investigación. Entonces, la persona clave que ha descubierto todos los pasos reales para la reacción en cadena de la polimerasa de PCR es Kary Mullis. Kary Mullis es la persona que ha desarrollado todos los sistemas de PCR. En realidad, la técnica de PCR se diseñó por completo o se desarrolló por completo en 1983, bastante recientemente, en realidad no por mucho tiempo. Y recibió el Premio Nobel en 1993 y este es uno de los inventos más grandes del mundo o en la investigación de bioquímica, biotecnología y química. Sabes, Kary Mullis ha recibido el premio Nobel de química, no de fisiología y medicina. Porque como veremos más adelante, muy pronto, todos los métodos que vas a utilizar en el laboratorio, involucran procesos químicos, reacciones químicas. Así que ese es el trasfondo de las reacciones en cadena de la polimerasa. Como sugiere el nombre, por supuesto, puede comprender que necesita la polimerasa. Y es un proceso o estimado que se basa en la enzima polimerasa. Entonces, la PCR es una técnica para amplificar el ADN genómico que hemos extraído de organismos. Es uno de los descubrimientos más importantes que ha revolucionado la investigación química o biológica. En realidad, es muy cierto. ¿Cuáles son las aplicaciones que identifican el ADNc, el ADN cromosómico o cualquier detección de ADN genómico de mutaciones genómicas? Esa es una de las razones clave por las que necesitamos estudiar los genes porque si aísla un gen de células enfermas, necesitamos saber si hay mutaciones dentro de él o si son el mismo gen que el normal o qué tipo de le ha ocurrido una anomalía a esos genes. Entonces, mutaciones genómicas, diagnóstico de enfermedades genéticas. Entonces, hay muchos cambios, alteraciones que ocurren en el genoma, debido a que ocurren enfermedades como la enfermedad de Parkinson, como la diabetes, como el cáncer. Así que esto es para el diagnóstico de enfermedades, esta es una herramienta absolutamente importante. El director verá en breve que es complementario a la replicación del ADN. Ahora, si recuerdan, el proceso de replicación del ADN que ha estado ocurriendo dentro de la célula, así que lo hemos visto pasa por múltiples pasos. Ahora la pregunta es si desea hacer los mismos pasos más cortos, ¿puede hacer el mismo proceso en su laboratorio? ¿Puedes hacer la amplificación del ADN o la replicación del ADN que hemos visto en un tubo de ensayo? Entonces, veamos eso y luego evaluemos si el mismo proceso se puede imitar en su laboratorio y, de no ser así, ¿cuáles son los problemas y cómo puede resolverlos? Entonces, primero, si recuerda el proceso de replicación del ADN, ¿cuáles son los ingredientes que se necesitaban? La replicación del ADN se encuentra en una célula de los organismos vivos. Ingredientes y aquí escribiré las enzimas. ¿Cuáles son los reactivos necesarios? ¿Y cuáles son las enzimas necesarias? ¿Cuáles son los reactivos o los ingredientes necesarios? Por supuesto, en el medio, necesitabas la muestra de ADN. El ADN que desea replicar o el ADN o gen de su padre, eso es lo que necesita primero porque eso es lo que desea para hacer más copias, en segundo lugar lo que necesita, necesitaba cebadores de ARN si no recuerdo mal. Entonces, primero, necesitaba en realidad múltiples números de cebadores de ARN, porque si recuerda que la cadena principal requería 1 cebador de ARN, la cadena rezagada requería muchos números de cebadores de ARN porque ha estado comenzando desde el medio de la cadena desde algún lugar intermedio de la región de las hebras. Entonces, cada vez que se abría la hebra, tenía que comenzar con un nuevo cebador de ARN. Se requirieron tantos cebadores de ARN. ¿Qué más necesitaba? Necesitaba los dNTP. Se requerían los ácidos nucleicos libres. Se requerían 4 dNTP. Por supuesto, por ejemplo, dATP, trifosfato de adenosina, necesitaba trifosfato de guanosina GTP, necesitaba dCTP citado en trifosfato y luego necesitaba trifosfato de timidina dTTP. Entonces, la fórmula general es esta, es la base A, T, G, C la estructura era este O libre de 3 hidroxilos primos y el fosfato, trifosfato en los 5 extremos primarios, esto es lo que necesitabas. ¿Necesitaba algo más o cebadores dNTP? La mayoría de esos ingredientes eran necesarios y necesitabas muchas enzimas. La primera enzima que requirió fue la helicasa. Luego, necesitabas proteína de unión de una sola hebra después de ese juego, las polimerasas, en realidad, necesitabas 2 polimerasas para 2 hebras si recuerdas antes que, por supuesto, necesitabas una primasa de ARN que sintetizara los cebadores de ARN, por lo que se necesitaba la primasa de ARN. Después de eso, necesitaba ARNasa para destruir todos los cebadores de ARN, luego necesitaba ADN ligasa para unir todo el ADN fragmentado que se ha formado. Entonces, al menos, esta es la cantidad de enzimas que requirió y estos son los ingredientes de las estructuras químicas que requirió para la replicación del ADN dentro de la célula. Ahora, la pregunta es, si se toman todos estos juntos en un tubo de ensayo, tendrá éxito, ¿funcionará en la replicación? Entonces, si vemos, digamos, este es su tubo de ensayo, y usted pone primero su ADN objetivo de ADN de doble hebra, este es su ADN de doble hebra, 5 primos a 3 primos, 3 primos a 5 primos todas las mañanas de hidrógeno están ahí ahora, lo primero fue que tenías que abrir la doble helicasa y necesitabas la helicasa. Entonces teníamos helicasa aquí que se abrirá para hacer una bifurcación de replicación y luego tuvo que ser estabilizada por la proteína SSB. Hasta aquí todo bien. Ahora lo que necesita, ahora necesita los cebadores de ARN, en los cebadores de ARN tal vez con la ayuda de la enzima primasa y eso iniciará la replicación. Entonces, este es su ARN que era 5 Prime, tiene 3 grupos hidroxilo primos libres. Aquí la imprimación sería esta con los 3 grupos hidroxilo primarios libres lo suficientemente bien. Ahora, lo que necesita para replicar, necesita la extensión que necesita para sintetizar la hebra complementaria que realiza la polimerasa. Entonces, agrega las 2 polimerasas para 2 hebras diferentes. Entonces, la polimerasa se unirá aquí y luego necesitará los 4 dNTP. Tan adecuadamente de acuerdo con lo que tenga en la hebra opuesta que el trifosfato complementario sería absorbido por la polimerasa y continuará la síntesis, lo mismo sucederá aquí. Entonces, obtendrá el ARN, y sintetizará el ADN en él. Entonces, este es tu ADN. Este es su ADN, así que su mitad de la porción está terminada y luego puede abrir más y puede regresar. Así es como obtendrás el hilo principal. Hemos visto 5 primos a 3 primos que es el hilo principal y puede sintetizar continuamente. La nueva hebra complementaria que es 5 prima a 3 prima, esto aquí constante más esta es su variante de hebra rezagada, 3 prima a 5 prima y sintetizará el ADN en fragmentos. Todos los huecos fueron ocupados originalmente por los cebadores de ARN que ha digerido y que debe dejar la enzima ARNasa. Y luego ha usado ligasa ADN ligasa para obtener la hebra complementaria completa, 3 cebado a 5 cebado, 5 cebado a 3 cebado para esto. Entonces, de un ADN que puede sintetizar en el primer ciclo a ADNasa bien. Ahora, esto debería seguir y seguir en un ciclo porque ha agregado todas las enzimas, no se detendrán allí. Y necesitas más cantidades de ADN. Así que ahora piense en el próximo ciclo, si va a funcionar, esto y esto se va a replicar aún más bajo su condición en su tubo de ensayo, no lo creo. No creo que vaya a funcionar más en el próximo ciclo. Una vez que haya agregado todos los ingredientes en el mismo tubo de ensayo, veamos si puede continuar. Lo primero es que ha agregado ARNasa allí en su tubo de ensayo. Entonces, para el segundo ciclo también, necesita cebadores de ARN para esta hebra y todas las hebras básicamente necesitan cebadores de ARN. Entonces, incluso si agrega el segundo ciclo. Entonces, 5 prime 3 prime, habías abierto la segunda bifurcación de replicación para una hebra, 3 prime, 5 prime, necesitas el ARN cebado aquí, necesitas ese ARN cebado allí. Este es su tubo de ensayo que ya los contiene todos. Pero tenías ARNasa allí. Entonces, la ARNasa en realidad ha cortado o destruido todo el ARN que ha usado antes. Entonces, incluso si agrega nuevos cebadores de ARN, ¿van a funcionar? No, debido a que ya tiene la ARNasa presente en su tubo de ensayo, en el momento en que agregue los cebadores de ARN, se destruirán. Entonces, todo el ARN que sería destruido. Y si la ARNasa no está ahí, las extensiones no pueden ocurrir. La polimerasa no puede reaccionar. Ese es el problema número 1. El segundo problema es que, como ve, ha sintetizado 1 hebra nueva, estas 2 hebras nuevas allí. Entonces, ya tiene algunas copias de ADN en su solución. Puede escribirlo de esta manera que tiene un ADN de doble hebra, 5 primos a 3 primos, 3 primos a 5 primos, y aquí nuevamente algunas copias pueden ser iguales. Entonces, 5 primos, 3 primos, 3 primos, 5 primos, algunas copias están flotando en su solución y tiene ADN ligasa allí, así que lo primero que sucederá es que el ADN ligasa unirá todo el ADN que tenga en el tubo de ensayo. . Entonces, estos 2 se unirían y, en lugar de obtener su ADN real, ahora obtendrá una versión más larga de ADN. Entonces tu originalidad se pierde. Además, si cree que incluso si funciona, sin ARNasa, incluso puede sintetizar las siguientes hebras, sintetizará la ADNasa fragmentada y esas ADNasa fragmentadas antes de que se sinteticen. Quiero decir, justo después de que se sintetizan justo después de que se han creado, pueden conectarse entre sí de forma inespecífica porque ya tiene ligasa presente en su solución. Entonces, varios problemas, en otras palabras, si quieres usar el mismo conjunto de enzimas, usando el mismo conjunto de ingredientes, eso sucede en una célula biológica, no vas a obtener tu ADN amplificado, ese proceso de replicación del ADN no se puede realizar. suavemente en un tubo de ensayo sin las células vivas. Así que ese es el problema de imitar la polimerasa imitando la replicación del ADN en el laboratorio. ¿Entonces, cuál es la salida? ¿Cómo puedes cambiar esto? ¿Cómo puedes hacer que funcione? Entonces, una cosa que debes recordar es que estás en un laboratorio y lo estás haciendo en un tubo de ensayo. Entonces, tienes algo de libertad que no tienes en una célula viva. Entonces, tenemos que pensar de esa manera y pensar en lo que podemos hacer para desarrollar o encontrar un nuevo método para que el proceso funcione. Entonces, si miras, inicialmente tienes tu ADN de doble hebra de ADN objetivo. ¿Cuáles fueron los primeros criterios? The first criteria were that you need to unfold the DNA at least partially. That is why you needed the enzyme helicase and that is why you needed the enzyme, single-stranded binding protein. Now, think of it can you do this thing in your laboratory? Can you unfold your DNA or the gene in your laboratory or what should be the condition if you want to open them up? You remember we have talked about DNA, DNA denaturation. DNA denaturation means that to a double-stranded DNA would be split into 2 single standard DNA, that is DNA denaturation, So now think of it way, how can you do our DNA denaturation basically means that you have to break all the noncovalent interactions that are present within your DNA, all the hydrogen bonds, all the pie stacking interactions should be broken down. And in your laboratory, what is the tool you have to do it? Very simple, by heat, if you simply heat it up to a little bit higher temperature, we usually do it at 95 degrees Celsius. You do not go to 100 degrees Celsius because in that temperature your solution which usually in water, DNA soluble, very much soluble in water. So most of the work of DNA we do in an aqueous medium, there are other buffers in it, but the medium is aqueous. So it will start boiling at close to 100 degrees Celsius temperature. And so we do not want that. That is why that temperature is kept a little bit less close to 95 degrees Celsius. If you heat your DNA at 95 degrees Celsius, what is going to happen? It is going to break all your noncovalent interactions. So at this stage, it will be broken which includes hydrogen bonding pi stacking and all. So, in other words, your base pairs would be destroyed and you can very much have 2 single-stranded DNA free from each other no interaction at all. So, by the simple trick of heat, you can separate the DNA into 2 single-stranded DNA. Now, of course, you can understand the same condition obviously cannot be used in a cellular system. Because of 95 degrees Celsius temperature inside our cells if you want to increase that temperature. We will all die so, that is what the freedom we have in the laboratory that you can use heat to make the double-stranded DNA into the single-stranded DNA. What is the other advantage in the cell you have opened the DNA or you have opened the gene partially and that is where all the problems were in the lagging strand? Here, you see once you put heat, they are completely separated whole of the double-strand is completely separated not partial separation, complete separation of the double-strand into 2 individual single strands. So, that gives you full freedom of the single strands and now, you do not have the replication fork, they are all open, and as we will see you can understand that it makes the process so simple now. Because of the simple treatment because of this very simple ingredient that is the heat in this case so, since you have opened with the heat, you do not need helicase it is not needed your SSB protein not needed. Now you move on to the next step what else is required? So let us take this strand first. I still call it leading strand and lagging strand which was originally being called in the cell. But they are no longer actually leading stand they are no longer lagging stand they will behave as equal. Now we will see. So if you take this 5 prime to 3 prime Now if you want to make the complementary strand, what do you need? For cells, you needed the RNA primers that were synthesized from the RNA primase. Now in the laboratory, you do not need RNA primers, because we have already learned to synthesize oligonucleotides. So we will use DNA primers instead of the RNA primers. So now we will use DNA primer, in this case, this is only one. So DNA primer, RNA primer is not required for the laboratory technique, because that DNA primers do not exist in our body does short sequences short oligonucleotide sequences of DNA do not present in our body RNA oligonucleotides are present to some extent. So, since you do not require the RNA primers, therefore, RNA primase that enzyme is also not required. Therefore, RNA primers are also not required. So, you see how the process becomes simplified one by one. So, use a DNA primer and now, for the extension of course, you need a polymerase that is needed because the reaction that I have shown that if I am not writing the whole thing again here O P P P triphosphate, triphosphate these 3 prime hydroxyl which is here. So, this is 5 prime, this is 3 prime will react with B 2 O P P P this reaction can be catalyzed or this reaction can be done only by this enzyme polymerase there is no other goal. So, we need the enzyme polymerase and you need all the individual dNTPs that are also required. So, since DNA primary is their DNA polymerase is going there bound and suitably the complimentary DNTP will be picked up and your strand would be synthesized in this direction. 5 prime to 3 prime so, this is the new strand and that you are synthesizing that you have synthesized 5 prime to 3 prime continuous without a break or without any interruption. Now, since you did not use RNA primer here all DNA, so, you need not go any other steps your amplification for this strand is complete. Now, look at the other strand. Another strand was 5, so, this is 5prime to 3 but this is 3 prime to 5 prime all right here, so, that it will be more clear, 3 prime to 5 prime that is this strand, lagging strand 3 prime to 5 prime. Now, that is also free fully. So, in lagging strand in DNA replication in a cell you have seen that RNA primer came was bound in the middle of somewhere because you were half-open there or partially open there. In this case, your strand is fully open. So, and your reaction is always starting from the 5 prime to 3 prime direction, what is the 5 prime to 3 prime direction here? 5 prime to 3 prime. So you are not starting in the middle of somewhere, you are starting at the very end, just like the leading strand. So, you are again, you can use another DNA primer, suitable DNA primer that is suitable for this strand. And then, of course, use the same enzyme. Now you need a polymer is but do you require a different polymer is no. Here is the same thing 5 prime to 3 prime hydroxyls is free for lagging strand since your synthesis was happening in a discreet manner in the middle part or somewhere in the portion of the gene, you had required a different polymerase, in this case, is the same reaction is happening exactly same as here. So, the same polymer is will do it you do not need a different polymerase so, the same polymer is that you have used in the earlier stage will also work here. And the same dNTPs that you have in your solution will be used and you can have a continuous synthesis without any interruption. So, this is your parent's strand, 3 prime to 5 prime and this is what the new strand that you are synthesizing, 5 prime to 3 prime. So, you see both the leading strand and the lagging strand are behaving as equal in a test tube. And since this is happening, you are not creating the Okazaki fragments. Therefore, you do not need the DNA ligase to ligate them, that is not required and since you do not have the RNA primers, you do not need to destroy them. So, the enzyme RNAase is also not required. So, what you do need here is if I now go back and check what I had written initially here and there, you do not need for the laboratory one you do not need the RNA primers. Instead, you need only DNA primer and you need 2 of them, 1 for each strand RNA primers were needed in multiple numbers dNTPs yes these 2 are needed. Enzymes helicase no need single standard binding protein, no need polymerase, you need 1 RNA primers, no need RNAase no need DNA ligase you do not need. So you have come down to a single enzyme that is polymerase for the whole process and a single trick of heat and the ingredient, one extra ingredient that is the DNA primer which you can synthesize. So, that is the beauty of doing this replication process in the test tube. Now basically what you can have you can have your test tube you can take all the dNTPs for you can use a single polymerase. And you need the DNA primers 2 DNA primers and you will have your amplification as you move on. So, that is the brilliant development of this method that you have simplified such a complicated process into a really doable thing. Now, what another requirement you have you have to use heat for here right and then only you will get your amplifier DNA, more number of DNAase number of copies of DNA you are going to get there is still a problem. Do you see the problem? If you use all the 4 dNTPs if you use the DNA primers if you use the polymerase and you have your target DNA, double-stranded DNA. Actually, still, you are not going to get your amplified pieces of stuff. ¿Por qué? There is a key problem. The problem is you are using heat close to 95 degrees Celsius. And at this temperature, obviously, we are breaking the DNA. We are denaturing the DNA at the same time, you will denature the enzyme Also the polymerase we denatured at high temperature so polymerase is the protein and the protein functions when it is in tertiary structures coiled form 3 dimensional form. I will show you the structure of polymerase briefly in a just very soon. So, but any protein when it functions enzymes they are all in the coil form folded confirmation, and those confirmations are formed along with some covalent interactions, mostly the noncovalent interactions, hydrogen bonding electrostatic interactions, hydrophobic interactions, at high temperature. Those will all be gone and your protein will be dead polymerase will be as good as inactive. So, at that temperature, your polymer is cannot work and that was a key problem that had been sustained for a long time and people were searching to find a solution, what can be done? Can this be achieved at all? So, finally, and this is again another very important discovery is that they have isolated one kind of polymerase is that is known as Taq polymerase. This is a polymerase that can sustain high temperatures because this polymerase was isolated from the microorganisms present in hot springs so hot springs have a high temperature close to boiling temperature. But still, there are many microorganisms living their thermophilic bacteria we call them or thermostatic microorganisms, thermophilic microorganisms, there is life still in the hot springs. So what they have done, they have and of course, since there is life, they were having their cell divisions as well to the must-have polymerase. We have isolated those polymerases and that is known as Taq polymerase. I will show you why Taq, so the Taq polymerase can sustain high temperature and now your problem is solved. So, if you now use these in your laboratory with the dNTPs. With the DNA primers and the newly found polymerase high temperature you are going to get your amplification of DNA. So finding out Taq polymerase was a crucial part of this whole method development. So now I will show you how is it done. So the whole of the PCR is done inside a machine since a very small machine benchtop. You can put it on your table, a small machine which can be programmed. So, you can see the buttons here, it can be fully programmed all the steps it can be preprogrammed so that it will go on automatically. Here is a sample chamber where the things are done. And typically use a very small quantity of volume less than 200 microliters most of the timeless than 200 microliters, so the test tubes. I was talking about are actually the PCR tubes in this model of sizes were quite a small size. So everything is done here. And the key steps are the key things that you need here is of course, you need the DNA sample that you have isolated and that is going to act as your template. second is you need the polymerase Taq polymerase number 3, you need the oligonucleotides which we call primers, so 2 DNA primers 4 is all the 4 dNTPs dATP, dGTP, dCTP and dTTP these are the 4 dNTPs units. And lastly, you remember when we make a DNA hybridization we always had to use salt because phosphates that are present in the backbone will rebuild each other. So in order to overcome that, we always use either sodium chloride or magnesium chloride. And the second reason you need to use a magnesium chloride is that the polymerase uses as magnesium chloride as its cofactor. So our fifth thing is you need magnesium chloride buffer solution. So next we will see how the steps actually work. Gracias.

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From a Pink Squiggle to the Human Genome Project

I n 1994, a Swiss biologist named Pascal Gagneux began a Ph.D. program in zoology. His research plan was to stalk populations of wild chimpanzees in Cote d’Ivoire and Mali. Specifically, Gagneux was in search of chimp nests in forest trees. After he figured out where the chimps slept, he’d wait until they left during the day to search for food before climbing trees to collect their hair.

Gagneux’s aim was to document genetic diversity in our nearest, dearest, and critically endangered relatives. In order to see what made one chimp different from another, and one population of chimps different from the next, he needed to be able to take that hair he’d collected, extract DNA from its follicle, and quickly multiply the DNA. If Gagneux had embarked on his quest just a few years earlier, that crucial last step, the multiplying, wouldn’t have been possible. But thanks to a then-new scientific technique—and a fortuitous discovery in the hot springs of Yellowstone National Park two decades earlier—Gagneux was able to learn that chimpanzees have much more genetic diversity than humans. “There’s more diversity in one social group of chimpanzees than in all 7 billion humans on the planet,” he said.

DIVERSE CHIMPS: Polymerase chain reaction, a process that takes a single scrap of DNA and churns out copy after copy, has led to discoveries like chimps’ remarkable genetic diversity. Julie Larsen Maher/Wildlife Conservation Society

Because the numbers of wild chimps are rapidly dwindling, that knowledge might have been completely lost were it not for the conveniently timed invention of the polymerase chain reaction, or PCR, a process that allows scientists to take a single scrap of DNA and churn out copy after copy with all the ease of stuffing paper into a Xerox. PCR, introduced in 1983, made Gagneux’s work possible.

In fact, PCR is one of the great technical achievements of our time. Many of the mapping techniques used in the Human Genome Project relied on PCR, and it’s helped do everything from identify a previously unknown bacteria that can cause a more-serious form of Lyme disease to aid doctors in screening patients for hereditary diseases like Tay-Sachs and cystic fibrosis. Its inventor, Kary Mullis, won the Nobel Prize for Chemistry in 1993.

But the success of PCR and its standing as one of the most important scientific advances in the history of molecular biology depends upon the discovery, in the mid-1960s, of a pinkish-orange squiggle of a bacterium in a hot spring at Yellowstone National Park. The two men who discovered this bacterium didn’t go searching for something that could be used for DNA replication—or anything else, for that matter. They were just curious. And that curiosity just happened to change the world.

T. aquaticus would help spark a genetic revolution more than a decade later.

In the mid-1960s, when Hudson Freeze was an undergrad at Indiana University, he was, he said, likely the only guy in his dorm who didn’t smoke dope. “I was a classic nerd,” he said. (He even worked in one of the university’s labs while in high school.) Despite his interest in science, he describes himself as drifting through life. One afternoon, he saw a lecture by a professor named Thomas Brock that intrigued him.

Brock’s research centered on microbial ecology: He was interested in how photosynthetic microbes worked outside of a laboratory setting and how photosynthesis changed with temperature. Hot springs, with their variety of relatively stable temperature ranges, seemed like a great place to do that.

Your DNA Is Nothing Special

Who’s your daddy? It’s a fair question. A meta-study published in 2006 by a University of Oklahoma anthropology professor estimated that 30 percent of men who have low paternity confidence about a child were justified in their suspicions. Even among. LEE MAS

So in the summer of 1966, armed with a grant from the National Science Foundation, Brock and Freeze set out for Yellowstone to collect bacteria that thrives in hot springs. It was the first time Freeze had ever left Indiana. He spent the summer gathering, grinding, and extracting bacteria samples to ship back to Brock’s lab. That fall, Brock paid Freeze $2 an hour to put the samples from the hot springs in culture media, at different temperatures, to see what they would grow. One day, in a sample set to 176 degrees Fahrenheit (80 degrees Celsius)—a temperature at which Brock, Freeze, and the rest of the world assumed that nothing could survive—Freeze found the pink filaments of a previously unknown bacterium that Brock would later name Thermus aquaticus—literally, “hot water.” Brock would go on to find the bacterium in lots of different hot water environments—including the University of Indiana’s own plumbing system.

Freeze remembers feeling disappointed with the new creature’s name. “That’s lousy. Hot water? You can be more creative than that.” But he finished his work for Brock, graduated, and went on to another school to work on his Ph.D. Beyond the curiosity of its ability to survive at such high temperatures, he didn’t see much use for the bacterium he’d helped discover. “Some people from Cincinnati who worked for Proctor and Gamble came to see if there was any use for the organism. I think they wanted to put it in Tide,” he said. “But I didn’t think it would amount to anything. I just thought it was cute.”

After Freeze left Indiana, his initial sample of T. aquaticus, taken on Sept. 5, 1966 from Yellowstone’s Mushroom Spring and designated YT-1, went to the American Type Culture Collection in Washington, D.C. And that was where it would help spark a genetic revolution more than a decade later.

You can exponentially multiply the copies of your target DNA. In a matter of hours, you can create millions.

In the early 1980s, many researchers were looking for ways to make more copies of DNA faster. Say you have a drop of blood left at a crime scene and you want to see if the DNA matches that of a suspect. DNA is fragile stuff and that drop of blood probably won’t contain enough, on its own, to allow you to sequence it and make a match. But if you can take the DNA and make many, many copies of it, you’ll have enough to work with. Think about a small animal, like an ant. You might not notice just one ant—but if there were 1,000, they’d be a lot more visible.

The polymerase chain reaction makes copies of DNA and it doesn’t, strictly speaking, need T. acquaticus in order to work. Instead, what it needs is a polymerase, a type of enzyme involved in building and repairing DNA. Scientists take DNA from an organism that contains a segment of DNA they want to copy, and mix it with polymerase, a bunch of loose nucleotides to build DNA from, and short strands of nucleotides, called primers, that show the polymerase where to start building and where to stop. Then, it’s just a matter of heating and cooling. Heat the mixture up, and the DNA separates into two strands. Cool it down and the primers latch on. Heat it up again, and the polymerases go to work, turning loose nucleotides into DNA copies. If you run the cycles of heating and cooling over and over and over, you can exponentially multiply the copies of your target DNA. One becomes two. Two becomes four. Four becomes eight. In a matter of hours, you can create millions.

That was the basic concept that Mullis came up with, but getting it to work in a commercial way was a group effort. Norman Arnheim, a scientist who, together with Henry Erlich, also worked on the early development of PCR, says that the initial system was clunky and fussy. Heat deactivated the polymerase. So, in every cycle, scientists would have to open each test tube up and add more polymerase, at just the right temperature, so it could work but not die. “You’d have to do this forever. It was excruciatingly painful,” he says.

To get around the problem, Mullis’ team started looking for a polymerase that could survive under high heat. They found it in Freeze and Brock’s YT-1 sample. In 1989, Ciencias magazine named the polymerase from T. aquaticus “Molecule of the Year.”

THE HEAT IS ON: The success of PCR depended on a polymerase that could survive under high heat. Scientists found it in a bacterium that thrived in a sizzling Yellowstone hot spring (above). Wikipedia

And that was when Freeze found out what had happened with his old discovery. The rights to the PCR technique sold to Hoffman-LaRoche Pharmaceuticals for some $300 million, but T. aquaticus itself was never patented. Most scientists who do basic research don’t get rich off it. Turning a profit was never their goal. “It doesn’t work that way in science,” Freeze said. Instead, they’re out to further human knowledge and make that knowledge available to others. Without them, the inventions that hacer make money could never happen.

Today, Freeze is the director of the human genetics program at the Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute in La Jolla, California, making him one of the millions of scientists who uses PCR almost every day. “Here I am using the fruits of this discovery and I’m actually improving lives with it,” he said. “That makes the whole project, and by that, I mean my life in science, really meaningful.”

Gagneux, the chimp geneticist, is one of Freeze’s colleagues and considers the older man a giant in his field. Despite this, Gagneaux was surprised to learn, years after they met, about the contribution Freeze had made to science. That’s the other thing about basic science—not only does it not make scientists rich, it often doesn’t even make them famous. Basic science is necessary, but it’s also frequently overlooked.

In the summer of 2014, on a family vacation to Yellowstone, Gagneux went searching for the hot spring where T. aquaticus was discovered. The area was beautiful, he said, all these bubbling pools in a riot of colors, but also quiet and anonymous. There’s no sign alerting visitors about its history. “I was happy to think I saw that pool,” Gagneux said. “I sent Hud an email and told him, ‘I think I found it.’ ”

Maggie Koerth-Baker is the senior science reporter for FiveThirtyEight.com. Su trabajo ha aparecido en The New York Times Magazine, The Atlantic, y otras publicaciones.

This story was commissioned by the Science Philanthropy Alliance as part of its Science to Society series, illustrating the importance of basic scientific research.


Preguntas frecuentes

Q 1. What is the purpose of a polymerase chain reaction?

It is a quick and inexpensive method of amplifying small segments of DNA, which is essential for molecular and genetic analyses. Every study of isolated DNA pieces needs to undergo polymerase chain reaction amplification.

Q 2. What happens in a polymerase chain reaction?

A segment of DNA is amplified using PCR. To do so, the sample is heated to denature the DNA. By denaturing means separating DNA segments into two pieces of single-stranded DNA. The enzyme Taq polymerase synthesizes the DNA to build to new strands resulting in the duplication of two original DNA. each of the strands is used to create two new copies – the cycle can be repeated 40 times making it possible to build a billion copy of the original DNA segment. The entire process would only take a few hours to complete.

Q 3. What is needed for PCR?

To be able to perform PCR, the following is needed:
1. DNA sample
2. ddNTPs (free nucleotides)
3. DNA primers
4. ADN polimerasa

Q 4. How is the PCR used to diagnose?

It is used to count the number of DNA/copies of a gene present in a given sample.
It is used to find out the viral load of HIV in patients suffering from AIDS.
– It is helpful in determining the number of cancerous cells that are remaining in a cancer patient undergoing treatment.

Q 5. Is real-time PCR quantitative?

Real-time PCR is also called quantitative PCR. It is based on the method that includes amplification of the target DNA sequence and quantifying the concentration of DNA species in the reaction.

Q 6. What is the end result of PCR?

The end product of the polymerase chain reaction is a brand new DNA strand with a double-stranded DNA molecule.

Q 7. What happens at 72 degrees in PCR?

The 72 degrees’ temperature is the optimum for Taq polymerase. Once it reaches this temperature, the extension process begins. Taq polymerase works off the primers and will generate a new strand of DNA which results in double-stranded DNA.

Q 8. How many types of PCR are there?

Not all PCRs are the same. You will be surprised to know that there are many types of PCR and the most common ones are the following:
Real-time PCR/Quantitative PCR/qPCR – It uses a fluorescent dye to tag the molecules of DNA. it is used to detect and quantify PCR products in real-time.
Multiplex PCR – It multiplies multiple fragments in a single sample of DNA using a number of primers.
reverse-transcriptase – The purpose is to create complementary DNA by means of reverse transcribing RNA to DNA with the help of reverse transcriptase.
Hot start PCR – Heat is used to denature antibodies that are used for Taq polymerase inactivation.
Nested PCR – Once the initial PCR cycle is done, another PCR is done but this time with the use of a new primer nested within the original primer. Thus, the term nested PCR. The reason for doing so is to reduce the risk of unwanted products.
Assembly PCR – Overlapping primers are used to amplify longer fragments of DNA.
Long-range PCR – A longer range of DNA is formed with the help of a polymerase mixture.
In situ PCR – It is a type of PCR that takes place in the cells or fixed tissue on a slide.
Asymmetric PCR – A single stand of target DNA is amplified.

Q 9. How accurate is a polymerase chain reaction?

The polymerase chain reaction is a highly sensitive procedure. the sensitivities range from 61% to 100%. The specificities range from 11% to 100%.

Q 10. What diseases can PCR detect?

There are different types of diseases that can be detected using PCR such as:
1. Hepatitis
2. VIH
3. Human papillomavirus (causes genital warts and cervical cancer)
4. Malaria
5. Anthrax
6. Epstein-Barr virus in people with glandular fever

Q 11. What do PCR primers do?

They are short fragments of single-stranded DNA, around 15 to 30 nucleotides long complementary to sequences of DNA that flank to the target region. What does a PCR primer do? It provides a free 3’ –OH group where DNA polymerase can easily add dNTPs.

Q 12. Why is PCR important?

A polymerase chain reaction is important as once DNA is amplified it can be used in various laboratory procedures and clinical methods. Examples are fingerprinting of DNA, diagnosis of various genetic disorders, detecting the presence of bacteria and viruses such as in the case of people with HIV/AIDS.

Q 13. What enzyme is used for PCR?

An enzyme is used to complete the polymerase chain reaction. The two enzymes used are DNA polymerase enzyme and Taq enzyme. The DNA polymerase enzyme is used to create new strands of DNA with the use of existing strands as templates.

Q 14. What are the 4 steps of PCR?

The polymerase chain reaction is composed of four primary steps:
1. The first step is denaturation using heat.
2. The second step is annealing the primer to a specific target sequence of DNA.
Extensión
3. End of the first cycle.

Q 15. Who first got the idea of a polymerase chain reaction?

The polymerase chain reaction is a product of the inventive mind of Kary B. Mullis. He invented this procedure in 1985 which paved a way to scientists making millions of copies of scarce DNA samples.

Q 16. Why it is called real-time PCR?

It is called real-time PCR primarily because it monitors the progress of polymerase chain reaction in real-time. only a small amount of PCR product can be quantified during the procedure.

Q 17. Is the RT PCR expensive?

The RT PCR test is an expensive procedure. it is a nuclear-derivative way of identifying the presence of specific genetic materials from a particular pathogen such as the virus. Why it is expensive? It is primarily because the equipment and resources used to run the test are scarce.

Q 18. What is the difference between real-time PCR and PCR?

The difference between traditional PCR and real-time PCR is that the former has advanced from detection at the end-point of the reaction to detection. On the other hand, the latter enables the detection of PCR amplification during the early stage of the polymerase chain reaction.


Ver el vídeo: Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR: Conceptos Básicos (Diciembre 2021).