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Clonación de complementación: ¿qué, por qué y cómo?


Entiendo que está clonando una biblioteca de ADNc completa, pero ¿por qué E. coli ¿Necesita un gen complementario para permitir la expresión génica? ¿Por qué ese gen complementario se considera mutante? ¿Y cómo se detecta el gen de interés después de la clonación?

¿Para qué se utiliza este tipo de clonación?


Me lo imaginé. Estás clonando por complementación cuando conoces la función de una secuencia mutante pero no su secuencia. Por ejemplo, su organismo (humano) contrae cáncer de piel debido a una exposición excesiva a la luz ultravioleta.

Con la complementación, dos mutantes pueden restaurar el fenotipo de tipo salvaje (reparación UV que funciona bien).

Sabemos que E. coli tiene un gen de reparación de rayos ultravioleta bien estudiado, por lo que transforma la biblioteca de ADNc de su ser humano en una E. coli que sabemos que tiene la mutación y luego los cultiva bajo luz ultravioleta intensa. La E. coli con el alelo mutante humano (el fragmento de ADNc derecho) sobrevivirá, por lo que puede amplificar esa colonia, secuenciarla y luego usarla como herramienta de diagnóstico en humanos.

Me pregunto por qué fue vago. ¿"Clonación por complementación" no es un nombre muy utilizado para esa técnica? ¿Era la pregunta demasiado amplia o elemental? Es la primera vez que uso Stack y parece que soy demasiado universitario para esta multitud.


Una definición general de complementación es la capacidad de dos mutantes en combinación para restaurar un fenotipo normal. La dominancia observada en heterocigotos refleja la capacidad de los alelos de tipo salvaje para complementar los alelos con pérdida de función. Sabes que un alelo dominante determinará el fenotipo de un heterocigoto compuesto por un alelo dominante y uno recesivo. A menudo, los alelos recesivos son mutaciones con pérdida de función, mientras que el alelo dominante es el tipo salvaje, que codifica una enzima funcional. Usando el ejemplo que condujo a la Primera Ley de Mendel, un cruce entre YY guisantes (amarillos) y aa guisantes (verdes) produjeron guisantes amarillos en el heterocigoto F1 (Yy). En este caso, el cromosoma que lleva el Y El alelo codifica la función enzimática que falta en el producto del recesivo. y alelo, y la vía para la biosíntesis de pigmentos continúa para producir un producto amarillo. Así se podría decir que el dominante Y alelo complementos el recesivo y alelo: proporciona la función que falta.

Podemos continuar la analogía con la cruz clásica de la Segunda Ley de Mendel. Veamos los mismos genes, pero una disposición diferente de alelos. Considere un cruce entre verde redondo (RRyy) y amarillo arrugado (rrYY) guisantes en este caso, cada padre proporciona un alelo dominante de un gen y un alelo recesivo del otro. El heterocigoto F1 es amarillo redondo (RrYy), es decir, se ven los fenotipos de los alelos dominantes. Pero también podría describir esta situación como los cromosomas de rrYYguisantes complementando la deficiencia en el RRyy cromosomas, y viceversa. En particular, el Yalelo del rrYYpadre proporciona la función que falta en el y alelo del RRyy padre, y el R alelo del RRyy padre proporciona la función que falta en el ralelo del rrYY padre. Si el fenotipo que está buscando es un guisante amarillo redondo, podría concluir que los mutantes en el R-mutantes del complemento genético en el Y-gene. Dado que en un heterocigoto, el alelo funcional proporcionará la actividad que falta en el alelo mutante (si la mutación es una pérdida de función), se podría decir que los alelos dominantes complementan a los alelos recesivos. Por tanto, los alelos dominantes determinan el fenotipo en un heterocigoto con alelos dominantes y recesivos.

La complementación distingue entre mutaciones en el mismo gen o en genes diferentes

La capacidad del análisis de complementación para determinar si las mutaciones están en el mismo o en genes diferentes es la base de la disección genética. En este proceso, uno encuentra los genes cuyos productos se requieren en una vía. En los ejemplos de los guisantes, la ruta metabólica hacia los pigmentos amarillos es claramente diferente de la ruta hacia los guisantes redondos, que es la ruta de biosíntesis del almidón. El análisis de complementación es útil para diseccionar los pasos de una ruta, comenzando con muchos mutantes que generan el mismo fenotipo. Este es un ejemplo más convencional de complementación.

Muchos hongos pueden propagarse como haploides, pero también pueden aparearse para formar diploides antes de la esporulación. Por lo tanto, uno puede buscar mutantes en haploides y obtener mutantes recesivos, y luego probar su comportamiento en combinación con otros mutantes en el estado diploide. Digamos que una cepa haploide de un hongo fue mutagenizada y examinada para detectar arginina. auxótrofos, es decir, mutantes que requieren arginina para crecer. Se aparearon seis de los mutantes para formar todas las posibles combinaciones diploides y se evaluó la capacidad de los diploides para crecer en ausencia de arginina (prototrofia). Los resultados se tabulan a continuación, con un + que designa un crecimiento en ausencia de arginina y un - que designa un crecimiento sin crecimiento.

Cuadro 1.1. Crecimiento de los diploides en ausencia de arginina.

Como era de esperar, cuando el mutante 1 se aparea consigo mismo, el diploide resultante sigue siendo un auxótrofo, esto es lo mismo que ser homocigoto para el alelo defectuoso de un gen. Pero cuando el mutante 1 se acopla con el mutante 2 (por lo que sus cromosomas se combinan), el diploide resultante recupera la prototrofia, es decir, puede producir su propia arginina. Esto es cierto para todosla progenie. Concluimos que el mutante 1 complementomutante 2. Si decimos que el mutante 1 tiene una mutación en el gen 1 de la vía de la biosíntesis de arginina y el mutante 2 tiene una mutación en el gen 2 de esta vía, el diagrama de la figura 1.6 describe la situación en los haploides y el diploide. (Tenga en cuenta que si el organismo tiene más de un cromosoma, entonces los genes 1 y 2 no necesitan estar en el mismo cromosoma). Dado que las enzimas codificadas por los genes 1 y 2 son necesarias para la biosíntesis de arginina, ninguno de los mutantes en el estado haploide puede producir arginina. . Pero cuando estos cromosomas se combinan en el estado diploide, el cromosoma del mutante 1 proporcionará un producto normal del gen 2 y el cromosoma del mutante 2 proporcionará un producto normal del gen 1. Dado que cada uno proporciona lo que falta en el otro, complementan. El mutante 1 también complementará al mutante 3, y se concluye que estas cepas portan mutaciones en diferentes genes necesarios para la biosíntesis de arginina.

Figura 1.6. Complementación entre dos mutantes haploides cuando se combinan en un diploide.

Por el contrario, el diploide resultante del apareamiento del mutante 1 con el mutante 4 sigue siendo un auxótrofo que no crecerá en ausencia de arginina. Suponiendo que ambos mutantes son recesivos (es decir, contienen alelos con pérdida de función), concluimos que las mutaciones están en el mismo gen (gen 1 en el diagrama anterior). Colocamos estos mutantes en el mismo grupo de complementación. Asimismo, los mutantes 2 y 3 no se complementan y están en el mismo grupo de complementación. Por tanto, el mutante 2 y el mutante 3 son portadores de diferentes alelos mutantes del mismo gen (gen 2).

El mutante 5 complementará a todos los demás mutantes, por lo que está en un gen diferente, y lo mismo es cierto para el mutante 6. Por lo tanto, este análisis de mutación y complementación muestra que este hongo tiene al menos 4 genes involucrados en la biosíntesis de arginina: gen 1 (definido por alelos mutantes en las cepas 1 y 4), gen 2 (definido por alelos mutantes en las cepas 2 y 3) y otros dos genes, uno mutado en la cepa 5 y el otro mutado en la cepa 6.

La disección genética por complementación es muy poderosa. Un investigador puede comenzar con una gran cantidad de mutantes, todos los cuales tienen el mismo fenotipo, y luego agruparlos en conjuntos de alelos mutantes de diferentes genes. Los grupos de mutaciones que no se complementan constituyen un grupo de complementación, que es equivalente a un gen. Cada mutación en un grupo de complementación dado es un alelo mutante del gen. El producto de cada gen, ya sea un polipéptido o ARN, es necesario para la función celular que, cuando se altera, genera el fenotipo que fue la base del cribado inicial. El número de diferentes grupos de complementación, o genes, da una aproximación del número de polipéptidos o moléculas de ARN utilizadas en la generación de la función celular.

Pregunta 1.2. Considere el siguiente análisis de complementación. Cinco mutaciones en una vía biosintética (que producen auxótrofos en un estado haploide) se colocaron por pares en una célula en trans(análisis diploide). Las células diploides se analizaron luego para la reconstitución de la ruta biosintética que complementan las mutaciones que pudieron crecer en ausencia del producto final de la ruta (es decir, ahora tenían una ruta biosintética funcional). A + indica un par de mutaciones complementarias a - significa que las dos mutaciones no se complementan.

a) ¿Qué mutaciones están en el mismo grupo de complementación (que representan alelos mutantes del mismo gen)?

b) ¿Cuál es el número mínimo de pasos enzimáticos en la vía biosintética?


Clonación de complementación: ¿qué, por qué y cómo? - biología

Ejemplo: dos plantas de flores blancas se cruzan para producir flores de color púrpura, aunque el púrpura es dominante.
Cada uno contiene una mutación en un gen diferente, que codifica una enzima diferente necesaria para producir el pigmento púrpura.

El análisis de complementación es más fácil de realizar en bacterias, hongos o C. elegans, donde se pueden obtener muchos mutantes de un fenotipo determinado.

Si aislamos una gran cantidad de cepas con el mismo fenotipo defectuoso, podemos cruzarlas en todas las combinaciones y calcular el número de grupos de complementación. Cualesquiera dos cepas defectuosas que NO se complementen están en el mismo grupo de complementación. Por lo general, cada grupo de complementación representa una de las enzimas esenciales en la vía.

Problema 1: averigüe cuántos grupos de complementación hay en estos ejemplos.

El concepto de complementación es extremadamente importante en biología molecular. Por ejemplo, la línea de ratón de células falciformes solo podría crearse porque dos cepas con diferentes defectos (falta de genes de globina humana o de ratón) podrían emparejarse para complementar los defectos de la otra. El hecho de que genes de diferentes especies puedan complementarse entre sí fue uno de los avances conceptuales más importantes de la biología molecular. La complementación se utiliza ahora de forma rutinaria para responder preguntas más sutiles sobre cómo se regulan los genes. Es absolutamente necesario comprender la complementación para comprender la biología molecular.

Complementación bacteriana.
Los sistemas genéticos bacterianos pueden mostrar complementación de dos formas importantes, cada una manipulando un proceso natural de genética bacteriana. Desde entonces, estos dos procesos se han modificado en biotecnología para proporcionar la mayoría de las herramientas esenciales de la clonación de genes.

1. Transducción especializada. Un bacteriófago lisogénico puede escindirse a sí mismo para llevar por error un fragmento de ADN del huésped. El fago ahora llevará una segunda copia de un alelo (o alelos ligados) a una célula huésped. La nueva bacteria es un diploide parcial para los alelos.

En biotecnología, un cromosoma de fago puede tener un fragmento de ADN extraño ligado en el tubo de ensayo. Luego, el ADN del fago se empaqueta en fagos y puede infectar a un nuevo hospedador en el que (1) produce muchas copias del gen del hospedador o (2) lisogeniza al hospedador para expresar el ADN clonado.

2. Plásmido F '. El plásmido F puede recombinarse a sí mismo en el cromosoma del huésped y luego recombinarse de nuevo con algo de ADN del huésped por error. Cuando ingresa a la siguiente célula huésped, porta una segunda copia de varios genes nuevamente, se crea un diploide parcial.

En biotecnología, un plásmido puede tener un trozo de ADN extraño ligado en el tubo de ensayo y luego el plásmido se transforma en E. coli. Luego, el plásmido hace muchas copias, incluido el gen clonado.

Análisis de mutaciones supresoras.
Una variación de la complementación son las mutaciones supresoras. Una mutación supresora corrige un defecto en un locus génico diferente. Una versión mutante del gen A produce un producto génico alterado, que corrige el fenotipo de una mutación defectuosa en el gen B.

Organización de genes
En las bacterias, se pueden organizar varios ORF de genes en un operón. Todas las secuencias de genes en un operón dado se transcriben en un solo ARNm, comenzando en un promotor. Se muestra un ejemplo de un operón, tuf-s10, de Borrelia burgdorferi, que causa la enfermedad de Lyme:

  • factor de alargamiento (tuf)
  • proteínas ribosomales S10 (rpsJ)
  • L3 (rplC)
  • L4 (rplD)
  • L23 (rplW)
  • L2 (rplB)
  • S19 (rpsS)
  • L22 (rplV)
  • S3 (rpsC)

Receptor de hormona de crecimiento humano

Para otros operones interesantes, intente buscar en GenBank, el repositorio internacional de todas las secuencias de ADN conocidas. (Financiado por el gobierno de los EE. UU.: El dinero de sus impuestos en el trabajo).

  • Secuencia de ADN: inversión o deleción
  • Transcripción, factor sigma
  • Transcripción, secuencia promotora, proteínas represoras
  • Represor traslacional
  • Modificación post-traduccional

El Lac Operon
El operón Lac es el modelo clásico de activación y represión de la transcripción. Los conceptos de análisis basados ​​en el operón Lac se pueden aplicar a otros sistemas, incluidos animales y plantas.

La siguiente explicación del operón Lac se modifica a partir del Operón Lac MIT.
Jacob y Monod fueron los primeros científicos en dilucidar un sistema regulado transcripcionalmente. Trabajaron en el sistema de metabolismo de la lactosa en E. coli. Cuando la bacteria se encuentra en un ambiente que contiene lactosa:

Debería activar las enzimas necesarias para la degradación de la lactosa. Estas enzimas son: beta-galactosidasa: Esta enzima hidroliza el enlace entre los dos azúcares, glucosa y galactosa. Está codificado por el gen LacZ. Permeasa de lactosa: Esta enzima atraviesa la membrana celular y trae lactosa a la célula desde el ambiente exterior. Por lo demás, la membrana es esencialmente impermeable a la lactosa. Está codificado por el gen LacY. Tiogalactósido transacetilasa: Se desconoce la función de esta enzima. Está codificado por el gen LacA. Las secuencias que codifican estas enzimas se ubican secuencialmente en el E. coli genoma. Están precedidos por la región LacI que regula la expresión de los genes metabólicos de la lactosa. Es de esperar que la célula quiera activar estos genes cuando hay lactosa alrededor y desactivarlos cuando no hay lactosa. Pero la historia es más complicada que eso. Por ejemplo, el gen de la permeasa siempre debe expresarse a un nivel bajo para que la lactosa entre en la célula. Entonces, un cierto nivel bajo de expresión es constitutivo, es decir, ocurre todo el tiempo, incluso si está "reprimido". La mayoría de los operones bacterianos son parcial o totalmente constitutivos. La expresión de LacI, por ejemplo, es totalmente constitutiva, su promotor siempre está "encendido", para un nivel de expresión muy bajo, lo suficiente para producir unas pocas moléculas represoras.

La principal fuente de alimento de una bacteria es la glucosa, ya que no es necesario modificarla para ingresar a la vía respiratoria. Entonces, si tanto la glucosa como la lactosa están presentes, la bacteria quiere apagar el metabolismo de la lactosa en favor del metabolismo de la glucosa. Hay sitios reguladores corriente arriba de los genes Lac que responden a la concentración de glucosa.

  • La lactosa induce la transcripción retirando el represor LacI.
  • La glucosa evita la transcripción quitando el activador de CAP.

Cuando hay lactosa, actúa como inductor del operón. Entra en la célula, se reorganiza ligeramente para formar alolactosa y luego se une al represor Lac. Un cambio conformacional hace que el represor se desprenda del ADN. Ahora, la ARN polimerasa puede moverse libremente a lo largo del ADN y el ARN se puede producir a partir de los tres genes estructurales. El ARNm se traducirá en las proteínas que transportan y metabolizan la lactosa.

Cuando se elimina el inductor (lactosa), el represor vuelve a su conformación original y se une al ADN, de modo que la ARN polimerasa ya no puede pasar más allá del promotor. No se produce ARN ni proteína.

Tenga en cuenta que la ARN polimerasa todavía puede unirse al promotor, aunque no puede superarlo. Eso significa que cuando la célula está lista para usar el operón, la ARN polimerasa ya está allí y esperando comenzar la transcripción, el promotor no tiene que esperar a que la holoenzima se una. Represión de catabolitos, con una proteína activadora
Cuando los niveles de glucosa (un catabolito) en la célula son altos, se inhibe la formación de una molécula llamada AMP cíclico. Pero cuando los niveles de glucosa bajan, los fosfatos de ATP se liberan hasta que por fin se forman cAMP:

ATP -> ADP + Pi -> AMP + Pi -> cAMP

El cAMP se une a una proteína llamada CAP (proteína activadora de catabolitos), que luego se activa para unirse al sitio de unión de CAP. Esto activa la transcripción, quizás aumentando la afinidad del sitio por la ARN polimerasa. Este fenómeno se llama represión catabólica. , un nombre inapropiado ya que involucra una proteína activadora, pero comprensible ya que parecía que la presencia de glucosa reprimía todos los demás operones del metabolismo del azúcar.

Esta imagen muestra una vista de "primer plano" de CAP regulación:

Control de corespresor
Otros operones están controlados por sus productos, en lugar de sus sustratos, por ejemplo, la expresión de enzimas biosintéticas para construir aminoácidos. A esto se le llama inhibición por retroalimentación. En el operón Trp, para la biosíntesis de triptófano, la transcripción del ARNm de cinco enzimas se evita mediante la unión del correpresor de Trp en presencia de triptófano. Cuando los niveles de triptófano caen, Trp sale del correpresor y el correpresor sale del sitio del promotor / operador. Ahora se produce la transcripción, por lo que la célula tiene enzimas para producir más triptófano.
Análisis del control de operón
¿Qué experimentos realizamos para averiguar cómo se regulan los operones?
Usamos cepas diploides parciales creadas por F 'o transducción especializada. En cualquier caso, probamos qué sucede cuando una cepa es diploide para los elementos reguladores.

Los mutantes reguladores pueden tener varios tipos de fenotipos mutantes. Por ejemplo:

p- El promotor no se une a la ARN polimerasa. No se produce ninguna transcripción.
lacI- El represor no logra unir al promotor / operador. La transcripción ocurre constitutivamente
(en presencia o ausencia de lactosa)
o-c El operador no puede vincular el represor. La transcripción es constitutiva.
lacZ- El gen estructural está defectuoso. No se produce ninguna enzima.

¿Lo que sucederá? ¿Qué tipos de complementación pueden ocurrir? ¿Importa si los dos alelos mutantes son adyacentes en el mismo cromosoma (cis) o están separados (trans)?


"Tipo salvaje" Mutante
LacZ + Produce enzima B-gal LacZ- NO hacer enzima
LacI + Hace represor LacI- NO hace ningún represor
La transcripción puede ser constitutiva
SI EL PROMOTOR ES FUNCIONAL
p + El ARN Pol se une al promotor pag - El ARN Pol NO se une al promotor
Sin transcripción
o + El operador se une al represor o - c El operador NO vincula al represor
La transcripción puede ser constitutiva
SI EL PROMOTOR ES FUNCIONAL

Problema 2. Predecir si los siguientes diploides producen B-galactosidasa, en presencia de lactosa en ausencia de lactosa. Explicar por qué. Explique en cada caso si importa si los dos alelos mutantes están ubicados en cis o en trans.

p + lacZ - lacI +
----------------- ----------
p + lacZ + lacI -

p + lacZ - lacI -
----------------- ----------
p - lacZ + lacI -

p + lacZ - lacI +
----------------- ----------
p + lacZ + lacI -

p + o-c lacZ + lacI + (Un operador constitutivo NUNCA une al represor,
-------------------------- -------- con o sin lactosa.)
p + o + lacZ - lacI +

Problema 3. Explique dos procesos genéticos diferentes en bacterias que pueden crear un "diploide parcial" para una pequeña parte del genoma. Explique por qué estos procesos son útiles para el análisis genético bacteriano.

Problema 4. Indique si la B-galactosidasa es expresada por cada diploide del operón lac, (1) y (2), y explique brevemente por qué (una oración). Complete los posibles genotipos para (3) y (4).


Lactosa
Ausente
Lactosa
Regalo
LacI- P + O-c LacZ +
LacI + P + O + LacZ-
LacI + P- O-c LacZ +
LacI + P + O + LacZ-
LacI- P + O + ___
____ ___ __ LacZ-
- +
__ P- O-c LacZ +
__ P + __ ___
+ +

Quiz sobre Lac Operon - Muy recomendado

Estructura molecular de los promotores
Los promotores se definen por secuencias de pares de bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. La ARN polimerasa tiende a reconocer secuencias promotoras en las que la mayoría de los pares de bases coinciden con la secuencia consenso del promotor. La secuencia de consenso es un compuesto definido por la base más común que ocurre en cada posición. Las mutaciones de sustitución de bases pueden disminuir o aumentar la eficiencia del promotor.

Los promotores de consenso bacterianos incluyen dos regiones de seis pares de bases cada una, en -10 y -35 bases cadena arriba. Sin embargo, no hay dos promotores exactamente iguales y ningún promotor coincide exactamente con la secuencia consenso. Se pueden encontrar sitios adicionales para reguladores ambientales hasta -50 a -300 bases aguas arriba.

  • Cuando las bacterias consumen sus fuentes de carbono, expresan RpoS, el factor sigma de la inanición. (Repaso, ¿qué es un factor sigma?)
  • RpoS se une a la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de diferentes genes de estrés ambiental, genes que protegen contra todos los diferentes tipos de estrés que las bacterias pueden encontrar antes de entrar en un nuevo intestino humano. Este fenómeno se conoce como protección cruzada.
  • Los genes de estrés pueden usarse para condiciones tan no relacionadas como la resistencia a ácidos o bases.
  • Los genes de estrés activados pueden ser o no parte de operones de múltiples genes. Pueden enfrentarse en direcciones opuestas, desde muchos promotores diferentes, en todos los loci diferentes alrededor del mapa genómico.
  • Operones de resistencia al arsénico. ¿Cómo resisten las bacterias al arsénico? El arsénico activa un regulón de respuesta ambiental. La base molecular está relacionada con la forma en que las células cancerosas desarrollan resistencia a los medicamentos contra el cáncer.
  • Regulación ambiental en Yersinia pestis (bacteria de la peste bubónica). Varios regulones complejos de genes responden a factores ambientales específicos, en particular el hierro y la temperatura. A baja temperatura, la presencia de hierro le dice a la bacteria: "Estoy en sangre que ha sido tragada por una pulga". La bacteria expresa proteínas que alteran la digestión de la pulga, obligándola a regurgitar la bacteria en la sangre de su próxima víctima. (Susan Straley y Robert Perry, Trends in Microbiol., 1995)
  • E. coli regulador de virulencia. ¿Cómo virulento E. coli las cepas matan a los niños? Una proteína reguladora se une a un operón que codifica "pilinas", por E. coli para formar pili que se adhieren al epitelio intestinal.
  • Expresión génica del modelo de tuberculosis. ¿Cómo se regulan los genes en un patógeno relacionado con la tuberculosis?

    M. Donnenberg, U. Maryland
  • Regulador de virulencia en "Bacterias carnívoras". Una proteína activadora de genes en Staphylococcus aureus activa el regulón de virulencia que produce las toxinas carnívoras. Este activador se puede utilizar como vacuna contra S. aureus.
  • Microarrays de ADN. Ahora podemos poner la mayoría de los genes que codifican proteínas en un chip de microarrays, utilizando tecnología basada en la industria de chips de silicio de ADN. El chip se puede usar para hibridar con ARN celular y medir las tasas de expresión de una gran cantidad de genes en una célula.

Los investigadores utilizan rutinariamente técnicas de clonación para hacer copias de genes que desean estudiar. El procedimiento consiste en insertar un gen de un organismo, a menudo denominado "ADN extraño", en el material genético de un portador llamado vector. Los ejemplos de vectores incluyen bacterias, células de levadura, virus o plásmidos, que son pequeños círculos de ADN transportados por bacterias. Una vez que se inserta el gen, el vector se coloca en condiciones de laboratorio que lo inducen a multiplicarse, lo que hace que el gen se copie muchas veces.

Los investigadores utilizan rutinariamente técnicas de clonación para hacer copias de genes que desean estudiar. El procedimiento consiste en insertar un gen de un organismo, a menudo denominado "ADN extraño", en el material genético de un portador llamado vector. Los ejemplos de vectores incluyen bacterias, células de levadura, virus o plásmidos, que son pequeños círculos de ADN transportados por bacterias. Una vez que se inserta el gen, el vector se coloca en condiciones de laboratorio que lo inducen a multiplicarse, lo que hace que el gen se copie muchas veces.


Este capítulo se completó después de valiosos comentarios de los miembros del Laboratorio Hodgkin, D. Williams, M. Best, K. L. Chow y un revisor anónimo, todos a quienes estoy muy agradecido. Estoy en deuda con O. Hobert, K. L. Chow y J. Kimble por compartir datos inéditos. KJY fue apoyado por Ruth L. Kirchstein NRSA (F32A1050333) de NIH.

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* Edited by Jonathan Hodgkin and Philip Anderson. Last revised October 05, 2005. Published October 06, 2005. This chapter should be cited as: Yook, K. Complementation (October 06, 2005), WormBook , ed. los C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.24.1, http://www.wormbook.org.

Derechos de autor: © 2005 Karen Yook. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

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Cloning Yeast Genes by Complementation

This unit presents a generalized protocol and describes the principles involved in cloning yeast genes by complementation in yeast. The protocol is presented using a hypothetical mutation of yeast, the cdc101-1 mutación. This mutation was isolated as a cell cycle mutant and is both recessive and temperature-sensitive for growth: it can grow relatively normally at 30 o C but is unable to make a colony at 37 o C. A genomic DNA clone that complements this mutation will be isolated by transforming the cdc101-1 strain with a yeast genomic library and subsequently screening for temperature-resistant colonies. Once isolated, two steps are necessary to prove that the insert present on the plasmid contains the wild-type CDC101 gene. First, segregation of the complementing plasmid must result in co-loss of both the plasmid-borne selectable marker and the complementing phenotype, demonstrating that the observed complementation is plasmid-specific and is not due to reversion of the cdc101-1 mutación. Second, it must be ruled out whether the cloned gene encodes a phenotypic suppressor of the mutation, rather than the wild-type gene. This is done via a complementation test, which demonstrates whether or not a disruption of the cloned gene that is integrated into the genome can complement the original mutation.


Alpha Complementation method for Bacterial Screening

15 comments:

whats the role of alpha and omega fragment in operon system

Alpha and omega fragments complement each other and are necessarilu required for function

They play a key role in the production of beta-galactosidase protein as alpha and omega fragments become functional after interaction and then beta-galactosidase can be produced.

the cells which recived the recombinant plasmid appears white or blue?? ¿y por qué? because i am confused
the cells mutant in alphe frarment will appeare white .but if these cells got the r plasmid they will appeare blue.
this is right or no?
but my be we have to insert the gene in lac z portion of the plasmid so both the cells(mutant and recombinant )will appeare white as the cant produse galactosidase.
thank u

according to what i understood the cells with recombinant plasmid will appear white


Tips for blue-white screening

  • Use a good control: Transform the backbone plasmid without insert. All colonies on this plate should be blue, indicating that your IPTG and x-gal are working as they should be.
  • Don't rush the process: It is important to give your plates enough time for any intact β-galactosidase to be expressed and process x-gal into blue pigment (16-20 hours). A plate with only white colonies is very suspicious!
  • Refrigerate your plates: Placing plates at 4C for few hours after the initial overnight incubation increases pigment precipitation, enhances the blue color of negative colonies, and allows for better differentiation between blue and white colonies.
  • Take care in making your plates: X-gal is light and temperature sensitive and needs to be added to media after autoclaving. If spread on top of pre-made plates, make sure it is evenly distributed and allow sufficient drying time before use.
  • Beware of false positives: Blue-white screening only indicates the presence of AN insert, not necessarily YOUR insert. Any cloning artifact that disrupts the α-peptide DNA will also lead to a white colony.
  • And also false negatives: These are rare, but if a small fragment is inserted in-frame, read-through can lead to a functional β-galactosidase enzyme and a blue colony. Blue-white screening is a good way to narrow down candidates for more specific analysis, like PCR or restriction digest.
  • Make sure you use a proper E. coli strain (i.e. contains the lacZΔM15 mutation): XL1-Blue, DH5α, DH10B, JM109, STBL4, JM110, and Top10 are a few examples.
  • Make sure you use a proper plasmid (i.e. contains the α-complementation cloning MCS): pGEM-T, pUC18 and pUC19, and pBluescript are a few common vectors.

Blue-white screening is just that – a screening process. It does not select only those cells that have taken up a plasmid and thus should be used in conjunction with selection methods. Combining selection and screening ensures that the white colonies you see are white due to successful cloning and not because the cell failed to take up the α-complementation plasmid. This way you can quickly and easily identify colonies that not only have your plasmid (antibiotic resistance), but also confirm those plasmids have your insert (blue-white screening).


Abstracto

Chlamydomonas reinhardtii is an excellent model system for plant biologists because of its ease of manipulation, facile genetics, and the ability to transform the nuclear, chloroplast, and mitochondrial genomes. Numerous forward genetics studies have been performed in Chlamydomonas, in many cases to elucidate the regulation of photosynthesis. One of the resultant challenges is moving from mutant phenotype to the gene mutation causing that phenotype. To date, complementation has been the primary method for gene cloning, but this is impractical in several situations, for example, when the complemented strain cannot be readily selected or in the case of recessive suppressors that restore photosynthesis. New tools, including a molecular map consisting of 506 markers and an 8X-draft nuclear genome sequence, are now available, making map-based cloning increasingly feasible. Here we discuss advances in map-based cloning developed using the strains mcd4 y mcd5, which carry recessive nuclear suppressors restoring photosynthesis to chloroplast mutants. Tools that have not been previously applied to Chlamydomonas, such as bulked segregant analysis and marker duplexing, are being implemented to increase the speed at which one can go from mutant phenotype to gene. In addition to assessing and applying current resources, we outline anticipated future developments in map-based cloning in the context of the newly extended Chlamydomonas genome initiative.

Sometimes called green yeast ( Goodenough, 1992), the unicellular, eukaryotic green alga Chlamydomonas reinhardtii (hereafter called Chlamydomonas) is a venerable model system for plant biology as well as for cell motility. The tag green yeast refers to its haploid vegetative state, the existence of two mating types, and the general similarity in applicable genetic techniques. These aspects of Chlamydomonas biology have been previously reviewed ( Rochaix, 1995).

Like many microorganisms, screening of Chlamydomonas strains for rare mutations is straightforward, since large numbers of cells can be plated on an appropriate selective medium, or nonswimmers, for example, can be selected from large numbers of swimming cells. At the same time, the ease of nuclear transformation in Chlamydomonas, coupled with the plant-like nonhomologous integration of transforming DNA, facilitates the creation of insertional mutant collections. Taken together, the assortment of techniques useable for Chlamydomonas indulges both the amateur and experienced geneticist, yielding sometimes overwhelming collections of mutant strains. In this report, we focus on mutants affecting photosynthesis, in keeping with the thrust of this journal, and the emphasis of the newly renewed and National Science Foundation-supported Chlamydomonas genome project (http://www.chlamy.org/). However, the map-based cloning tools described here are generally applicable to Chlamydomonas biology.

The use of Chlamydomonas to study the elaboration and regulation of the photosynthetic apparatus is long established and was recently reviewed ( Grossman, 2000 Dent et al., 2001). Key to this is the ability to maintain nonphotosynthetic (PS−) mutants on acetate-containing media, as well as the ability to use replica plating ±acetate and/or chlorophyll fluorescence to identify such mutants ( Bennoun and Béal, 1997 Niyogi et al., 1997). Furthermore, numerous photosynthetic (PS+) suppressors have been recovered from screening of PS− strains (e.g. Girard-Bascou et al., 1992 Levy et al., 1997 Bernd and Kohorn, 1998 Nickelsen, 2000 Esposito et al., 2001 Li et al., 2002).

Recovery of wild-type alleles of genes mutated in PS− strains has been successful, since both genomic complementation with selection on minimal medium or identification of DNA flanking an insertional mutant site are relatively straightforward although perhaps tedious methods (e.g. Gumpel et al., 1995 Boudreau et al., 2000 Vaistij et al., 2000 Auchincloss et al., 2002 Dauvillee et al., 2003). However, in cases where PS+ suppressors have been recovered from PS− strains or where a trait otherwise cannot be selected on minimal medium, recovery of the mutation requires other methods. In the case of PS+ suppressors, for example, a recessive suppressor would yield a PS− phenotype upon complementation, and even dominant suppressors such as mcd2, which suppresses the nuclear mcd1-2 mutation responsible for instability of the chloroplast petD mRNA ( Esposito et al., 2001), require construction of a genomic library from the suppressed strain if they are to be cloned by complementation. Another example is the xanthophyll cycle mutant npq1, which is defective in nonphotochemical quenching ( Niyogi et al., 1997). A pesar de que npq1 was generated in an insertional mutant population, its defect is not linked to the ARG7 insertional mutagen. In each of these cases, isolation of the gene of interest could be achieved through map-based cloning in a suitably developed system.

Map-based cloning relies on two basic principles, namely the existence of a genetic/physical map and the ability to generate progeny of sexual crosses that segregate for the trait of interest as well as phenotypic and/or molecular markers. In higher plants, such resources are most fully advanced in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) and rice (Oryza sativa), which, not coincidentally, have complete nuclear genome sequences. Furthermore, interfertile polymorphic ecotypes (Columbia and Landsberg erecta y indica y rosal japonés, respectively) have been utilized as sources of genetic variation to introduce into selected mutant backgrounds. Resources for Arabidopsis and rice have been extensively publicized and have been utilized in numerous examples of successful gene isolation ( Chen et al., 2002 Garcia-Hernandez et al., 2002 Torjek et al., 2003) maize (Zea mays) is another subject of intensive efforts ( Coe et al., 2002 Cone et al., 2002).

Here we present a case-based study to describe existing and projected resources for map-based cloning in C. reinhardtii. Mutations generated in this species can be mapped by crossing to the interfertile strain known as Chlamydomonas grossii, S1-D2 or its culture collection designation of CC-2290, which has a suitable profusion of sequence tagged sites (STS), cleavable amplified polymorphic sequence (CAPS), single nucleotide polymorphism (SNP), and RFLP markers ( Gross et al., 1988 Vysotskaia et al., 2001 Grossman et al., 2003). Beginning with laborious RFLP-based mapping ( Gross et al., 1988), Chlamydomonas mapping has moved toward a PCR-based method ( Kathir et al., 2003) and now is poised to incorporate more high-throughput methods. This, in concert with an increasingly complete nuclear genome sequence ( Grossman et al., 2003), provides the necessary tools for studies of all classes of mutations.

The nuclear mutants mcd4 y mcd5 were derived from strains petDLS2 and petDLS6, respectively, in which mutations engineered into the 5′-untranslated region of the chloroplast petD gene caused RNA instability and thus a PS− phenotype ( Higgs et al., 1999). Ambos mcd4 y mcd5 are spontaneous PS+ mutants, do not carry a molecular tag, and genetic analysis (data not shown) showed them to be recessive. Thus, complementation of mcd4 o mcd5 with the wild-type genes would revert the PS+ phenotype to PS−, making genomic complementation an inappropriate approach. We therefore decided to map mcd4 y mcd5 by using available genomic resources and by developing new ones as opportunities or needs arose.


Alpha Complementation of LacZ in Mammalian Cells

The bacterial lactose converting enzyme beta-galactosidase (β-gal) and its gene (LacZ) have been studied for many years ( 1 and references therein) and are among the most utilized tools in molecular biology. The LacZ product, a polypeptide of 1029 amino acids, gives rise to the functional enzyme after tetramerization ( 2 and references therein) and is easily detected by chromogenic substrates either in cell lysates or directly on fixed cells en el lugar ( 3 and references therein). The tetramerization is dependent on the presence of the N-terminal region spanning the first 50 residues ( 2 and references therein). Deletions in the N-terminal sequence generate a so-called omega peptide that is unable to tetramerize and does not display enzymatic activity. The activity of the omega peptide can be fully restored either in bacteria or in vitro ( 4) if a small fragment (called alpha peptide) corresponding to the intact N-terminal portion of the β-gal is added en trans. The phenomenon is called alpha complementation and the small N-terminal peptide is called alpha peptide. This effect has been widely exploited for studies in procaryotes, where special strains that constitutively express omega peptide exist and allow the detection of expression of the small alpha peptide.

Aiming to study the stability of microsatellites in ageing eucaryotic cells, we have engineered (CA)norte repeats at the N-terminal position of LacZ ( Fig. 1A). However, we were disappointed by the rapid loss of activity caused by prolonged repeats (see below). We reasoned that, analogously to procaryotic systems, the alpha peptide might be more stable towards such insertions. Surprisingly we could not find any report describing alpha complementation of LacZ in mammalian cells. Therefore, we constructed eucaryotic expression vectors that should produce either a lacZ omega peptide [ Fig. 1A, construct g, called Z(d)NC] or different alpha peptides (constructs b–d, called Z-N58, Z-N85 and Z-N150, respectively). We have also compared the tolerance towards N-terminal inserts for the whole enzyme [construct f, Z( 1)NC] or for an alpha peptide [construct e, Z(i)N58]. Transfection of these constructs in various combinations has produced the results shown in Figure 1B, where the length of the bars represents the relative enzymatic activity obtained from extracts of transiently expressing HeLa cells. The data clearly show that co-expression of alpha and omega peptides (lines 4–6 and 8–12) resuscitates enzymatic activity that is absent in the single components (see control lines 2 and 3). We find that the optimum length of the alpha complementing peptide is ∼85 amino acids (line 5), while a shorter peptide (truncated at position 58) that is otherwise active in most prokaryotic systems (see Fig. 1 legend) demonstrates only a very weak alpha complementing activity (line 4). We could also demonstrate that alpha peptides are more tolerant towards insertions of foreign sequences (compare lines 8–12 with lines 13–15). The tolerance was tested with the relatively weak N58 alpha complementing peptide and we expect the N85 construct to be even more tolerant. We are looking forward to using similar peptides to monitor stability of dinucleotide repeats in mammalian cells. Recently we learned that expression of Z-N85 and Z(d)NC in yeast cells does also result in efficient trans complementation (D. Picard, personal communication). We observed the same complementation behaviour in other human cell lines (S. B. Verca, unpublished). Therefore, we are confident that these constructs can be used in a variety of eucaryotic cells.

The availability of this approach opens new perspectives in gene expression studies in cell cultures and animals, such as (i) easy monitoring of various fusion proteins in eucaryotic systems (ii) facilitated packaging of small reporter peptides in size-constrained viral vectors (iii) establishment of dual expression monitoring systems in which omega and alpha peptides are brought under distinct genetic control (iv) study of protein trafficking, where only co-compartmentalization shall produce significant complementation. Thus, we believe that this system will become the basis of many experiments and applications in eucaryotic systems.


Ver el vídeo: The complementation test (Enero 2022).